מאמר שיטה

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

DOI:

10.3791/51741

⸱

20 ביולי 2014

 ,  , 
1Center for Thoracic Disease and Transplantation, Heart and Lung Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש צורך ניכר למידע משופר על נהגים מולקולריים של ושט בארט. מכתים Immunofluorescent הוא טכניקה שימושית להבנת ההשפעות של תא איתות במורפולוגיה של תאים. אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל לשימוש בצביעת immunofluorescent להעריך טיפול רפואי בתאי הוושט של בארט.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) יש שיעור כולל הישרדות של פחות מ 17% ושכיחות של EAC עלתה באופן דרמטי בשני העשורים האחרונים. אחד מגורמי הסיכון העיקריים של EAC הוא שט בארט (BE), שינוי metaplastic של הוושט הקשקש הנורמלי בתגובה לצרבת כרונית. למרות הקשר המבוסס היטב בין EAC ולהיות, חקירה של האירועים המולקולריים, במיוחד מסלולי איתות שינו מעורבים התקדמות של להיות EAC, הם הבינו היטב. חלק גדול מזה נובע חוסר המתאים במודלים חוץ גופית זמינים ללמוד מחלות אלה. לאחרונה, קווי BE תא הונצחו הפכו זמינים באופן מסחרי המאפשרים לבדיקות במבחנה של BE. כאן, אנו מציגים שיטה לצביעת immunofluorescent של קווי BE תא הונצחו, ומאפשרים באפיון מבחנה של תא איתות ומבנה לאחר חשיפה לתרכובות טיפוליות. יישום של טכניקות אלה הלp לפתח תובנה המנגנונים המעורבים בתהיה התקדמות EAC ולספק אפיקי פוטנציאל לטיפול ומניעה של EAC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ושט בארט (BE) הוא שינוי metaplastic באפיתל הנורמלי הקשקש של הוושט ותוצאה של חשיפה כרונית לתוכן הקיבה הנובע ממחלת החזר הוושטי (GERD) 1. הוא חשב להיות להיות מנגנון הגנה בתגובה לGERD, עם זאת הנוכחות של BE מקנה סיכון מוגבר של אדנוקרצינומה של הוושט (EAC), מחלה אשר נושאת הישרדות נמוכה באופן משמעותי 1. הערכות הנוכחיות מצביעות על כך שעד 5.6% מכלל האוכלוסייה האמריקנית צריכים להיות, כמו להיות לעתים קרובות תסמינים, הוא חשב, עם זאת, הרוב המכריע של BE נשאר לא מאובחן 2. כשיעורי ההיארעות של שני GERD וEAC ראו צמיחה נמשכת 3, זה הפך להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהתקדמות של להיות EAC, במיוחד כאשר מידע זה עלול לספק גישות טיפוליות למניעת התקדמות של להיות EAC.

מחקרים> חולה מופנים הביאו לפרדיגמה הנוכחית של הפתוגנזה BE-EAC 1. דלקת כרונית, פציעה, ונזק genotoxic כתוצאה מחשיפה ממושכת לתוכן קיבה להפעיל לחץ סלקטיבי על הנגע לקדם התקדמות neoplastic לEAC. מספר השינויים הגנטיים שזוהו במהלך להיות התקדמות EAC. אולם, למרות זאת קיים מחסור מובהק של הבנה לגבי השינויים המדויקים בתא איתות והשפעות שלאחר מכן על מבנה תא ותפקודו.

הונצחו בשורות תאים במבחנה הם כלים שימושיים לחקר ההשפעות של תא איתות, בעיקר בחוקר את ההשפעות של תרכובות טיפוליות ממוקדות. הזמינות המסחרית האחרונה של שורות תאים להיות מונצחות מאפשרת ללימודים כאלה. למרות מבחני תפוקה גבוהה, כגון מבחני כדאיות בשימוש נרחב, יכולים להיות בעל ערך בהערכת ההשפעות של טיפולים ממוקדים על התפשטות תאים וsurvival 4-6, מבחני אלה אינם שימושיים לחקירת ההשפעות של תא איתות על מורפולוגיה של תאים. מכתים Immunofluorescent (IF) הוא טכניקה שימושית חוקר את ההשפעות של טיפולים ממוקדים על המאפיינים מורפולוגיים, צמיחה וההישרדות של תאים והחלבונים שהם מעורבים. המעבדה שלנו יש להתאים שיטות אלה לכיוון קווי BE תא הנציחו, באמצעות IF כדי להעריך את ההשפעות של תרופה זמינה מבחינה קלינית על שורות תאים להיות בתקוות של התוויית טיפול אפשרי chemopreventative וסמנים ביולוגיים לטיפול תרופתי 7. כמו כן, יישום של טכניקות אלה בEAC, BE ושורות תאי הוושט הונצחו יש מתווית ממצאים קריטיים לגבי להיות התקדמות EAC 8-10. אנו מוצאים אם ניתוח של תאים להיות מטופלים עם טיפולים ממוקדים יש ערך, המאפשר אפיון של שינויים במבנה תא ולוקליזציה חלבון. כאן, אנו מציגים את השיטות שלנו כי אם של תאים להיות מונצחים לגharacterize טיפול תרופתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקת קו סלולרי

  1. אדם הנציח BE שומות בדרגה גבוהה (CP-B, CP-C, CP-D) וmetaplastic (CP-) שורות תאים על ידי transfection היציב של טלומראז האנושי להפוך חלבון טרנסקריפטאז (טרט) 11.
  2. לשמור BE שורות תאים בתקשורת keratinocyte בתוספת תמצית שור יותרת המוח (BPE), גורם אפידרמיס צמיחה (EGF), 5% בסרום שור העובר (FBS), חומצות אמינו חיוניות (NEAA), פניצילין, סטרפטומיצין, ניאומיצין (PSN), וסטנדרטי תנאי תרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 98%).

2. להיות נייד ציפוי

  1. הכנת הצלחת / coverslips 12 היטב. הנח 18 coverslips מ"מ לתוך צלחת פטרי זכוכית וחיטוי. העברת autoclaved 18 coverslips זכוכית מ"מ לתוך צלחת תרבית רקמת 12 גם באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית מחוברת לצינור ואקום. שטוף את coverslip עם PBS ותקשורת סטרילית.
  2. Trypsinize ולספור תאים להיות מונצחים. ספירת תאי USIng דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. לדלל תאים בתקשורת והתרבות לריכוז של 20,000-40,000 תאים / מיליליטר.
  3. מקום 1 מיליליטר של תאים לתוך כל המכיל coverslip לספירת תאים כולל של 20,000-40,000 תאים / היטב היטב.
  4. השתמש בקצה פיפטה סטרילית לדחוף בעדינות את coverslip לתחתית הבאר, כדי להבטיח שתאים לצרף coverslip.

3. הטיפול התרופתי של תאים להיות

  1. לדלל תרופה שנבחרה בתקשורת חמה (37 מעלות צלזיוס) לריכוז רצוי ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך שוב ושוב או בעזרת מערבל מערבולת. ריכוזי תרופה נקבעו באופן אמפירי. להתחיל טיפול 24 שעות הבאות הזריעה הראשונית של התאים יהיה לאפשר התקשרות תאים לcoverslip
  2. לשם השוואה ובקרה, טיפול בcoverslip נוסף של תאים להיות עם רכב 0.1% (sulfoxide דימתיל [DMSO] או סוכן המשמש לsolubilize מתחם) בדילול מלא בתקשורת והתרבות. צלחת תווית עם עט מעבדה לזיהוי סמים וvehicle טופל דגימות. מקום תאים לתרבית תאי חממה מוגדרת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 98% ודגירה של נקודות זמן רצויים.

4. Immunofluorescent מכתים

  1. קבעון
    1. בעקבות זמן דגירה רצויה של טיפול תרופתי, לשאוב התקשורת לשטוף coverslips במהירות עם פוספט שנאגרו מלוח 1x (PBS) בטמפרטורת חדר (RT, 25 מעלות צלזיוס).
    2. לשאוב PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS המכיל 4% PFA [4% PFA / PBS] היטב כל אחד ולדגור על RT במשך 30 דקות.
    3. לשאוב PFA 4% / PBS ולשטוף 3x coverslips, 5 דקות כל אחד עם PBS ב RT. coverslips חנות במשך שבוע אחד ב% PBS/0.1 PFA על 4 מעלות צלזיוס אם תרצה בכך.
  2. Permeabilization / חסימה
    Permeabilize תאי PFA קבוע כדי לאפשר את הנוגדן כדי לגשת למטרות תאיים. לתאי ועלו חלבונים, לבצע את כל השלבים שלאחר מכן ללא saponin מתווסף פתרון BSA% PBS/0.5 1x.
    1. להפחית את הרקע על ידי דוגרים עם 50 Cl NH 4 מ"מ מדולל PBS 10 דקות ב RT ולשטוף עם RT-PBS פעם אחת במשך 5 דקות.
    2. דגירה תאים להיות עבור 30 דקות ב100-300 μl של PBS המכיל saponin 0.1% ו0.5% אלבומין בסרום שור (BSA). לדלל saponin ממניות 10% פילטר מעוקר, שהוכן במים ומאוחסנים ב 4 ° C.
    הערה: זה מונע ספציפי מחייב של נוגדנים לחלבונים תאיים על ידי חסימת coverslips בשל התוספת של BSA 0.5%. לחלופין, להחליף BSA עם הסרום עז המדולל ל -5% כדי לסייע להפחית ספציפי מחייב של נוגדנים.
  3. הכנה של לשכת האנוש
    1. הכן צלחת מבדק כיכר על ידי שכבות התחתונה של החדר עם מגבות נייר רטובות ומניח שכבה של Parafilm על העליונה.
    2. בעדינות להעביר את coverslips, התאים פונים כלפי מעלה, על Parafilm באמצעות מלקחיים ומחט מזרק.
    3. סמן את Parafilm עם עט מעבדה כדי לזהות coverslips.
  4. ראשי נוגדן דגירה
    1. לדלל את הנוגדן העיקרי PBS המכיל שני BSA 0.5% וsaponin .0.1%.
    2. בעדינות למחוק את פתרון החסימה באמצעות רקמות במעבדה ומוסיף של פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl. דגירה הנוגדן הראשוני בתאי BE לילה בשעה 4 ° C.
  5. דגירה נוגדנים משני
    1. שטפו את השקופיות 3x עם% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
    2. מדולל משני נוגדנים מצומדות עם תג ניאון ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 ששני הנוגדנים מזהה מינים שבו הנוגדן הראשוני הועלה.
    3. הוספה של נוגדן בדילול 100 μl לכל coverslip. דגירה הנוגדנים משני עבור שעה 2 ב RT.
  6. כביסה והרכבה של Coverslips
    1. שטוף את coverslips 3x, 5 דקות כל אחד ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1. הסר את החיץ לשטוף ולהוסיף 100-300 μl של PBS על coverslips.
      הערה: לקבלת אנטי כפוליםצביעת גוף, חזור על שלבים 4.4-4.5 עם הנוגדן ראשוני ומשניים נוסף הרצוי על פי מידע שהותווה בדיון.
    2. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים את coverslip ולמחוק את PBS באמצעות רקמות במעבדה או מגבת נייר.
    3. הוסף 15 μl של תקשורת מתאימה אנטי לדעוך הרכבה המכילה 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לcoverslip ולהפוך את coverslip, תאים למטה, לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
    4. מניחים את השקופיות לתוך תיקיית שקופיות ודגירה הרחק מאור ישיר הלילה ב RT כדי לאפשר את המדיום אנטי לדעוך קשה להגדיר כדי לרפא, על פי הוראות יצרן. ברגע שהמדיום אנטי לדעוך קבע, יכולה להיות מאוחסנות בשקופיות או 4 ° C או -20 ° C עד להדמיה מיקרוסקופית.

5. להדמיה מיקרוסקופית של Coverslips

ניתן הדמיה תאים מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ או או confocal אם microscop הזקוף מסוגלדואר. למרות מיקרוסקופיה confocal מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעומקים בדידים, מיקרוסקופי זקוף הוא מסוגל לייצר תמונות שימושיות יותר מהר. למען קיצור, שיטה של ​​הדמיה מוכתמת להיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית הוא מוצגת. באופן כללי, לisothiocyanate תמונה והעמסת (FITC) או fluorophores הדומה (כלומר חלבון פלואורסצנטי ירוק), טקסס האדומה וDAPI, דורש מיקרוסקופ עם מסננים מסוגלים להפלות fluorophores אלה. בדוק את המיקרוסקופ לפני תחילת פרוטוקול כדי לקבוע fluorophores התואם.

  1. הדמיה על תקן אם מיקרוסקופ
    1. הסר שקופיות / coverslips מאוחסן מ-20 מעלות צלזיוס או 4 ° C ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר. כוח במיקרוסקופ ומנורת קשת כספית.
    2. הנח שקופיות מיקרוסקופ עם coverslip פונה כלפי אובייקטיבי על הבמה מיקרוסקופ. לשימוש במטרת טבילת שמן, להוסיף טיפה של שמן טבילה על coverslip.
    3. בחר את מסנן DAPI ולפתוח את התריס.
    4. להתמקד במטרה תוך מבט דרך העיני עד שהתמונה מופיעה. מכיוון שכל התאים יהיו כתם עם DAPI, הגרעינים צריכים להיות נצפים בקלות.
    5. לאסוף תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמא לתוצאות המתקבלות מיישום של הנהלים שתוארו באה לידי ביטוי בדמויות 1A-D. Coverslips עם CP-D ותאי BE CP-C טופלו ל24 שעות עם 1 מיקרומטר של מעכב Src המשפחה, SKI-606, או רכב (DMSO) ומוכתם באמצעות הנהלים מעל לצומת Adherens וWnt איתות חלבון, β -Catenin. ויזואליזציה של β-catenin הושגה על ידי תיוג עם IgG נגד ארנב מצמידים fluorophore ירוק, תוך תיוג של גרעין התא בוצע על ידי תיוג עם DAPI (כחול). Coverslips היו רכוב על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות קשה להגדיר התקנה ותאים הם צי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לנו התוויתי שיטה ליישום של IF של תאים להיות כלפי הבהרת ההשפעות הפיזיולוגיות של טיפולים ממוקדים על תאים אלה. אמנם יש לנו תיארתי את השימוש בנהלים אלה לתאים להיות, שמצאנו כי שיטות אלה תקפים גם למגוון רחב של סוגי תאים שונים 13,17,18 של. יתר על כן, ניתן לשנות נהלים אלה במספר דרכים כדי לייעל את הצביעה למטרות ספציפיות.

אנו מוצאים פרמטר אחד שיש לו השפעה ישירה על אם ראוי הוא הבחירה של קיבעון. יש לנו תיארתי א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מסנט, קרנו של יוסף (AJF, LJI) ואיגוד ריאות האמריקאי, RG-224,607-N (LJI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CP-A (קו תאים מטפלסטיים)ATCCCRL-4027
CP-B (קו תאים דיספלסטיים בדרגה גבוהה)ATCCCRL-4028
CP-C (קו תאים דיספלסטיים בדרגה גבוהה)ATCCCRL-4029
CP-D (קו תאים דיספלסטיים בדרגה גבוהה)ATCCCRL-4030
קרטינוציטים-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042
0.25% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום Life Technologies25200056
סרום בקר עוברי, מוסמך, HILife Technologies10438026
תערובת אנטיביוטיקה PSNLife Technologies15640
PBS - Phosphate-BufferedSalt Life Technologies10010049
מגיב אנטי-דהיית זהב Pro-long עם DAPI Life TechnologiesP36931
כיסוי זכוכית עגול 18 מ"מפישר סיינטיפיק15-183-86
&בטא;-catenin נוגדן ראשוני (ארנב)איתות תאים9562S
Alexa Fluor 488 (עיזים נגד ארנב)Life TechnologiesA11008
צלחת PS 10 ס"מ מטופלת TC, סטריליתUSA ScientificCC7682-3394
צלחת PS שטופלה ב-TC 12 בארות, סטריליתUSA Scientific5666-5180
DMSOSigma-Aldrich276855
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
אמוניום כלורידSigma-AldrichA9434
SaponinSigma-Aldrich47036
אלבומין סרום בקר - Fraction Vסיגמא-אולדריץ'85040C
SKI-606 (Bosutinib)Selleck ChemicalsS1014
צלחת בדיקה ביולוגית מרובעת תרמו סיינטיפיק240835
פרפילם VWR82024-546
פיפטות פסטר חד פעמיות, זכוכית צורVWR14672-380
Nexcelom מיני מונה תאיםNexcelom
תאי ספירת תאיםNexcelomCHT4-SD100-014
מיקרוסקופ Zeiss Apotome צייס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
  2. Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
  3. Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
  4. Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
  5. Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
  6. Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
  7. Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
  8. Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
  9. Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461(2011).
  10. Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
  11. Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
  12. Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
  13. Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
  14. Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
  15. Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
  16. Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
  17. Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
  18. Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים