3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

סיכום

בפרוטוקול וידאו זה אנו עוקבים - במהירות גבוהה ובתלת מימד - אחר ליזוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך תאים חיים, תוך שימוש בשיטת המעקב המסלולי במיקרוסקופ דו-פוטוני שונה.

תקציר

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לדון כיצד לבצע ולנתח ניסוי מסלולית ניאון תלת ממדי מעקב אחר חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה ^1. בניגוד לגישות קונבנציונליות (סריקה סריקה או שדה רחב המבוסס על ערימה של מסגרות), המעקב מסלולית 3D מאפשר למקם ופעל עם מרחבית גבוהה (10 דיוק ננומטר) ורזולוציה של זמן (תגובת תדר 50 הרץ) עקירת 3D של חלקיקי ניאון נעו על אורך קשקשים של מאות מיקרונים ^2. השיטה מבוססת על אלגוריתם משוב ששולט בחומרה של מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים על מנת לבצע מסלול מעגלי מסביב לאובייקט להיות במעקב: מנגנון המשוב ישמור את אובייקט הניאון במרכז על ידי שליטה על התזוזה של קרן הסריקה ^3-5. כדי להדגים את היתרונות של טכניקה זו, אנחנו אחרי אברון זז מהר, הליזוזום, בתוך אלתא iving ^6,7. תאים היו מצופים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ומוכתם באמצעות צבע מסחרי הליזוזום. אנו דנים בקצרה את תצורת החומרה ובפירוט רב יותר את תוכנת שליטה, לבצע ניסוי מעקב מסלולית 3D בתוך תאי חיים. אנו דנים בפירוט הפרמטרים הנדרשים על מנת לשלוט במיקרוסקופ הסריקה ולאפשר התנועה של האלומה במסלול סגור סביב החלקיקים. אנו מסיקים על ידי המדגימים כיצד שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר התנועה מהירה של הליזוזום שכותרתו לאורך microtubules ב3D בתוך תא חי. יזוזומים יכולים לנוע במהירויות בטווח של 0.4-0.5 מיקרומטר / sec, בדרך כלל מוצגות תנועה בבימויו לאורך רשת microtubule ^8.

מבוא

מספר גדול של גישות פותחו עד כה כדי לעקוב אחר חלקיקי ניאון בשלושה ממדים באמצעות מיקרוסקופ. רוב הגישות מסתמכות על השימוש במצלמות מהירות, מתאימות באופן אידיאלי למעקב בשני ממדים, בשילוב בדרך כלל עם שינויים מותאמים אישית של אופטיקה הפליטה של ​​מיקרוסקופ כדי להשיג מעקב בכיוון הצירי. מיקרוסקופי סריקת לייזר (או confocal או שני פוטונים) כמקובל יכול לעקוב אחר חלקיקי ניאון על ידי ביצוע רצף של z-ערימות זמן, למרות שתהליך זה הוא בדרך כלל זמן רב, ומניב רזולוציה זמן סבירה (10 Hz) רק אם במעקב החלקיקים הוא המשיך במרכז אזור הדמיה סריקה קטן על ידי מנגנון משוב פעיל ^2.

הרעיון של נעילה לחלקיקים הוא הבסיס של שיטת המעקב מסלולית. במקום סריקה לסרוק מסלול מעגלי מתבצע סביב חלקיקי הניאון. עוצמת הקרינה לאורךהמסלול בדיוק מתאים את עמדת חלקיקי ^4.

העמדה המקומית של החלקיקים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להניע סורקי מיקרוסקופ ומחדש מרכז המסלול בעמדת החלקיקים. סורקי גלונומטר של המיקרוסקופ מונעים על ידי מתח אנלוגי. רכיב AC של מתח זה מאפשר לבצע מסלול עם קרן הלייזר הממוקדת, כלומר סינוס וקוסינוס גל פנה למראות X וסריקת Y יאפשר ביצוע מסלול מעגלי. DC לקזז של האות מקל לשנות את מיקומו של מרכז המסלול. ברגע שתקופת מסלול נקבעה ואת צורת הגל לאות AC מוגדרת, מערכת המשוב צריכה לעדכן את רכיב DC רק של האות.

תוכנה מסוגלת לקרוא את אות הניאון שנאסף מהגלאים נדרשה לשלוט הסורקים וגלאים, כדי לחשב את המיקום של החלקיק ולעדכן את DC אתנקבע. למשוב מוצלח הדמיה בחירה זהירה של הפרמטרים המסלול (גודל ועיתוי) דרוש ופרמטרים אלה צריכים להיות מותאמים המבוססים על המאפיינים של חלקיקי הניאון שיש צורך לעקוב אחר.

היסודות הפיזיים ומתמטיים של הטכניקה תוארו ^ב4,5 העבר עבור שני יישומי 2D and 3D. בפרוטוקול זה אנו מתארים בקצרה את רכיבי החומרה המרכזיים של ההתקנה, ובפירוט רב יותר נדרשים הבחירה של הפרמטרים והכנת המדגם לניסוי טיפוסי מאפשר לנו הבא לעקירתם של הליזוזום ברזולוציה גבוהה זמנית בתוך תא חי.

פרוטוקול

הכנת .1 לדוגמא

1. שמור על תאי CHOK1 בצלוחיות תרבית רקמה באמצעות DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 IU / מ"ל ​​של פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין. דגירה התאים בחממה humidified 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס.
2. קציר ולאחר מכן תאי צלחת CHOK1 על מיקרו היטב בקוטר 14 מ"מ בעובי של 0.16 מ"מ משטח. תאי זרע לצפיפות אופטימלית להדמיה, סביב confluency 60-70%.
3. דגירה תאי הלילה בשעה 37 ° C, 5% CO _2. שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS (האנק נאגר מלוח פתרון), ודגירת תאים בתמיסה המכילה 50 ננומטר של Lysotracker DND26 הירוק ו150 ננומטר של ירוק גשש טובולין. דגירה תאים לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. שלב אופציונאלי: לפני הדגירה, לבצע כתם נוסף עם צבע המיטוכונדריה צביעת מטריצה ​​(25 ננומטר).
4. שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS כדי להסיר כל צבע מאוגד. הוסף בינוני צמיחת DMEM טרי לפני מתאר לעצמיing התאים.

2 תצורות מיקרוסקופ

מיקרוסקופ למעקב אחר החלקיקים המתוארים בפרוטוקול הווידאו מורכב על המסגרת של מיקרוסקופ זמין מסחרי הפוך (איור 4). מודולים עם זאת מסחריים למעקב אחר חלקיקים מסלולית 3D זמינים כעת.

1. השתמש השני קוהרנטית Chameleon-Ultra Ti: femtosecond מקור אור עירור לייזר Sa, עם טווח אורכי גל פלט מתכונן בין 690 ננומטר ננומטר-1,040.
2. ודא שקרן הלייזר מיושרת ביציאה האחורית של מיקרוסקופ באמצעות מראות מצופה IR. קרן הלייזר מוחלשת באמצעות צלחת חצי גל מסתובבת ואחריו מקטב ליניארי קלציט. להחליש את הקרן, כך שההספק הממוצע במדגם הוא בין mW 0.5 ו2.
   הערה: קרן הלייזר באה לידי ביטוי על ידי זוג מראות ומונעות גלונומטר מנוע המאפשרות שליטה על המיקום והמסלול של הקרן הממוקדת במטוס המדגם. בתצורה אופיינית קרן לייזר collimated יציאה של מראות גלונומטר מורחבת (10X) עוברת דרך הרחבה קרן, לפני שנכנסת לחלק האחורי של מטרת מיקרוסקופ לאחר ההשתקפות במראה dichroic קצר לעבור.
3. לאסוף את אור פלואורסצנטי מהמדגם על ידי הצבת מטרה מספרית מים גבוהות צמצם (60X, NA 1.2) לתוך נתיב האור. בחר קוביית מסנן הקרינה על פי אורכי גל הפליטה הרצויים בכל תצורת ערוץ אחד או שתיים. מעסיק מסנני bandpass הפליטה כדי לבחור את טווח הספקטרום של הקרינה הנפלטת נוסף.
4. מניחים את המדגם על במה ממונעת, ולהתאים את התנועה העדינה של מטרת מיקרוסקופ באמצעות piezo-בקר אובייקטיבי.
5. לכוון את האור מקוביית המסנן לתוך צינורות מכפיל שבו האות מופלה ונשלחו לכרטיס רכישת נתונים I / O דיגיטלי.
   הערה: מחשב שנוצר צורות גל הם הפלט האנלוגי של I / O הכרטיס והם provided לסורקים לשלוט אלקטרוניקה. קלט ספירת פוטון מהמכפיל ואות הפלט לסורקים נמדד ונשלט באמצעות כרטיס קלט / פלט על ידי המעבדה לתוכנת Dynamics הקרינה SimFCS.

.3 הדמיה

1. מקם את התאים על הבמה ולהתמקד באמצעות תאורת אור מועברת.
2. לעבור להדמית סריקת סריקה לזהות את התאים ששלבו את הצבע וכדי להמחיש את microtubules הבסיסי. זהה את האזור הראשוני שבו תנועת שלפוחית ​​היא הווה.
3. ברגע ששלפוחית ​​בודדת מזוהה, להגדיר את הפרמטרים למעקב ההקפה הבאים:
   1. בחר את הרדיוס של המסלול כדי להגדיר את הגודל של הסריקה המעגלית בהתאם לגודל של החלקיקים במעקב. לפולט נקודה, להגדיר את הרדיוס של המסלול שווה למותנים של פונקצית מורחים פוינט (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של קורה העירור על מנת למקסם את הרגישות ותגובה.
   2. הגדר את צירילהרחיק כדי להגדיר את המרחק בין שני המסלולים המבוצעים בתרגום עמדת החלקיקים לאורך הכיוון הצירי. הגדר את המרחק הצירי ל1.5-3 פעמים המותניים כוחות הביטחון הפלסטיניים.
   3. הגדר את הזמן להתעכב בהתאם לבהירות של החלקיקים כדי להגדיר את המשך הזמן על כל נקודה של המסלול, שגם יקבע את שיעור הלבנת תמונה. השתמש להתעכב זמן בין 10-100 μsec.
   4. הגדר את מספר נקודות בכל מסלול ל64 או 128 להניב תקופות מסלול בצו של 4-32 אלפיות שני ולספק רזולוציה גבוהה זמנית לקביעת עמדת החלקיקים.
4. לשנות את DC אות לקזז נשלחה למראות כדי למרכז את הקרן על החלקיק דרך ממשק המשתמש הגרפי באמצעות בחירת סמן בדימוי שנסרק סריקה.
5. להתחיל לעקוב אחר על ידי מעבר למצב מיקרוסקופ מסריקת הדמיה לסריקה מסלולית.
6. הפעל את אוסף המשוב ונתונים.

.4 Trajectניתוח אורים

1. השתמש בתוכנה כדי להציג את הקרינה שנאסף בכל נקודה לאורך המסלול ובכל נקודה בצורה של "שטיח עוצמה 'זמן. העצמה שנאסף לאורך השטיח מספקת מידע על האינטראקציה של החלקיקים עם אובייקטים בהירים אחרים. להשתמש בתוכנה כדי להציג את שני מידע המסלול (כלומר עקירת DC לאורך הזמן של x, y וסורקים של -piezo z), כמו גם את עוצמת הקרינה שנאספו מהצינור מכפיל לאורך זמן בצורת סדרת זמן של.
2. השתמש בייצוג סדרת הזמן ומידע 'שטיח עוצמה' כדי לבחור רק אזור של עניין במסלול.
3. להשתמש בתוכנה כדי להציג הקרנת 2D של החלק הנבחר של מסלול החלקיק. בחר את הפקדים המתאימים לצבע קוד המסלול בהתאם לעוצמת הקרינה של חלקיקים.
4. בחר את האפשרות להציג pמסלול מאמר ב3D, וצבע קוד אותו בהתאם לעוצמת הקרינה. סובב את המסלול ב3D באמצעות הפקדים כדי להמחיש את התכונות של תנועת הליזוזום לאורך microtubule.

תוצאות

על פי פרוטוקול זה מעקב אחר חלקיקים מהירים 3D יחיד יכול להתבצע בתוך תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה כדי לעקוב אחר התזוזה של יזוזומים שכותרתו fluorescently. הניסוי בוצע מתחקה אחרים הליזוזום מבודד נע בתוך התא לאחר תהליך התבגרות endosome ^9. יזוזומים היו מוכתמים באמצעות צבע ירוק ניאון ונרגש ב930 ננומטר ניצול עירור 2 פוטונים. הנתונים שלנו מראים שזה אפשרי להשיג x, y, z מסלולי תזוזה עם רזולוציה זמנית של 32 אלפיות שניים (איור 1 א). ניתוח השט...

דיון

למרות ההתקדמות העצומה בטכניקות הקרינה מיקרוסקופיה וinstrumentations בשנים האחרונות, להשגת מסלולים של חלקיקי ניאון בשלושה ממדים עם רזולוציה גבוהה זמנית נשאר אתגר בתחום. אם רזולוציה גבוהה זמנית הושגה חלקיקי מעקב בשני ממדים, הרחבה לכיוון הצירי בדרך כלל מביאה לירידה דרסטית בתגובת התדר של המערכת ^10.

בסרטון-פרוטוקול זה אנו מתמקדים ביישום ההפגנתי של מעקב חלקיקים בודדים בשלושה ממדים בתוך תא חי עם רזולוציה גבוה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Tubuline tracker Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
מלון קוהרנטי- אולטרה II	TI קוהרנטי
Glan Taylor Calcite Polarizer	Melles Griot	03PTA001
מראה גלוונומטר-מנוע	Cambridge Technologies	M 6350
מראה דיכרואית	Chroma Technologies	700 DCSPXR
שלב ממונע	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
צינור מכפיל צילום	Hamamatsu	H7422P-40
כרטיס רכישת נתונים	IO tech	PCI 1128-4000
תוכנת הדמיה	LFD	Global לתמונות-SimFCS