הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

17.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51796

⸱

2 באוגוסט 2014

 ,  ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

במאמר זה

סיכום

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

תקציר

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את החומרים דרושים, ואת ההליך להכנת C שונה. Legans דואר מדיה הרגלה והרבייה (mCeHR). בנוסף, הצעדים לחשיפה והתאקלמות ג elegans גדל על E. coli לaxenic תקשורת נוזלית מתוארים. לבסוף, ניסויים במורד הזרם לנצל ג axenic elegans להמחיש את היתרונות של הליך זה. היכולת לנתח ולקבוע ג הדרישה התזונתית elegans שהומחש על ידי גידול תולעים מסוג בר N2 בתקשורת נוזלית axenic עם ריכוזי heme שונים. הליך זה יכול להיות משוכפל עם חומרים מזינים אחרים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לצמיחה והתפתחות או תולעת, כדי לקבוע את השפעות טוקסיקולוגי של טיפולים תרופתיים. ההשפעות של ריכוזי heme מגוונים על הצמיחה של תולעים מסוג בר נקבעו באמצעות תצפית מיקרוסקופית איכותית ועל ידי quantitating tהוא מספר התולעים שגדלו בכל ריכוז heme. בנוסף, ההשפעה של ריכוזים תזונתיים מגוונים ניתן assayed ידי ניצול תולעים המבטאים חיישני ניאון שמגיבים לשינויים בתזונתיים של עניין. יתרה מזאת, מספר גדול של תולעים יוצרו בקלות עבור הדור של elegans המהונדס ג באמצעות הפגזת microparticle.

מבוא

נמטודות הקרקע, elegans Caenorhabditis, הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במחקרים רבים מתחום הגנטיקה לטוקסיקולוגיה. כתוצאה מגודלו 1 מ"מ, זמן דור המהיר של ארבעה ימים, קל טיפוח, ומספרי צאצאים גדולים, נמטודות אלה כבר נוצלו במספר מסכי גנטיים תרופתיים 1, 2. חוקרים לנצל את תולעת זה כדי לזהות מולקולות ומסלולים נשמרים במערכות בעלי חוליות. מסלולים אלה כוללים אותות מוות של תאים, מסלולים של הזדקנות ואת חילוף חומרים, ואת מערכת העצבים 3-6. בנוסף, השקיפות של ג elegans מאפשר לדור של קווים מהונדסים באמצעות כתבי חלבון פלואורסצנטי, אשר ניתן דמיינו ישירות לנתח דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון.

במחקרים רבים נמטודות זה תרבית על משטח המבוסס על אגר מוצק באמצעות מדיום גידול נמטודות צלחות (NGM) או בליטרתרבויות iquid זרע עם Escherichia coli כמקור מזון 7,8. מקורות מזון של חיידקים אלה יכולים לבלבל את מחקרים ביוכימיים ורעלים עם הפרעות מחיידקי תוצרי המשפיעים על הפרשנות של תוצאות. על מנת להימנע מתופעות הרכבה אלה, ג יכול להיות מתורבת elegans בתקשורת נוזלית axenic כי הוא נטול חיידקים כמקור מזון. שימוש בתקשורת זו, אנו תרבית בהצלחה מיליוני תולעים מסונכרנים היטב עבור רבים ג הסטנדרטי פרוטוקולי elegans כולל ניתוח microarray של גנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי בג elegans נחשף לריכוזי heme שונים, וייצור של תולעים מהונדסים באמצעות הפגזת גן. מדיה זו הגדרה כימית ושונה ממתכון מקורי שגובש על ידי ד"ר אריק קלג 9. השימוש במדים mCeHR זה, זיהינו בהצלחה את הגנים מעורבים בהומאוסטזיס heme, המכונה גנים כheme מגיבים (HRG ים) 10, שהייתלא היה אפשרי בתנאי גידול רגילים אשר מנצלים צלחות אגר NGM seeded עם א ' coli.

בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההליך להחדרה ושמירה על ג elegans גדל על E. coli לmCeHR axenic ולנצל בשיטה זו כדי לקבל מספר גדול של תולעים לייצור ג המהונדס קווי elegans באמצעות הפגזת microparticle. אנחנו גם לימודים הנוכחיים המציגים את התועלת של שימוש במדים axenic לקביעת הדרישה התזונתית של ג elegans באמצעות heme לדוגמא ירושלים. מחקרים אלה מראים כי השימוש במדים mCeHR מאפשר צמיחה מהירה של מספר גדול של ג elegans עבור יישומים במורד הזרם רבים מנוצלים על ידי חוקרי תולעת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. זני תולעת

  1. השג ג elegans wildtype זני בריסטול N2 ממרכז Caenorhabditis הגנטיקה (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) ולשמור אותם על צלחות NGM seeded עם א ' OP50 זן חיידק 7. הערה: תולעת מהונדס זני IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) מנוצל נוצרו כמתואר 11 בעבר. ניתן לבקש IQ6011 מן המחבר המתאים.

2. הכנת ג השתנה elegans מגורים ורבייה בינוני (mCeHR)

הכן תקשורת נוזלית mCeHR כמתואר להלן 12. תקשורת נוזלית axenic זה מאפשרת לגדל התולעים ללא כל מקורות מזון נוספים. לבצע את כל המניפולציות של תקשורת axenic נוזלית ותולעי axenic באמצעות תנאים סטריליים לחלוטין כגון זרימה למינרית.

  1. השג חלב ללא שומן מפוסטר אולטרה ממכולת. השתמש בפרו בקירורדביק ולא את המוצר בטמפרטורת החדר. לפני שימוש בmCeHR בינוני, פס חלב על מוח לב עירוי (BHI) אגר צלחות דגירה במשך 3 ימים ב30 מעלות צלזיוס ו37 ° C כדי לבדוק על סטריליות. מעביר את חלב ל50 צינורות מ"ל ולאחסן סטרילי ב -80 ° C
  2. הכן את כל אחד מהמרכיבים הבאים ולשלב בהוראה ובסכומים שניתן להכין 1 ליטר של mCeHR (לוח 1 א): 10 מיליליטר של 2 ציטראט diacid כולין מ"מ, 10 מיליליטר של ויטמין ותמהיל גורם גדילה (ראה מתכון בטבלה 1 ב '), 10 מיליליטר של 2.4 מיו-אינוסיטול מ"מ, 10 מיליליטר של 2 כלוריד hemin מ"מ, 250 מיליליטר של מים deionized. החל יניקה וסינון באמצעות יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר.
  3. הוסף 20 מיליליטר של תערובת חומצות גרעין (מתכון בטבלה 1 ג), של תערובת מינרלים 100 מיליליטר (מתכון בטבלה 1D), 20 מיליליטר של 170 מ"ג / מיליליטר lactalbumin hydrolyzate, 20 מיליליטר של חומצות אמינו חיוניות, 10 מיליליטר של אמינו לא חיוני חומצות, 20 מיליליטר של 450 מ"מ KH 2 PO 4,50 מיליליטר של 1.45 M D-גלוקוז, 10 מיליליטר של 1 M HEPES, מלח נתרן, 250 מיליליטר מים deionized.
  4. החל יניקה לסינון לעקר את הרכיבים. הסר את המסנן ולהוסיף 1 מיליליטר של 5 מ"ג כולסטרול / מיליליטר. ודא כי ה-pH של התקשורת היא כ 6-6.5. הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.
  5. הוסף 20% (v / v) חלב רזה אורגני אולטרה מפוסטרת למדיום mCeHR לפני השימוש. השתמש בטכניקה בקפדנות סטרילי (למשל בזרימה למינרית) בעת הפתיחה וaliquoting חלב. אחסן את המדיה ב 4 ° C.

3. היכונו ג elegans לתרבות בAxenic mCeHR הנוזלי בינוני

  1. לגדול תולעים בעשר צלחות NGM 60 מ"מ עד שיש הרבה תולעים הרה להולדת וכמות מינימאלית של OP50 E. coli על הצלחות.
  2. הסר את התולעים מכל צלחת על ידי שטיפה עם 5 מיליליטר של חיץ M9 (מתכון בטבלה 1F), ולשלב בצינור חרוטי 50 מיליליטר.
  3. לאפשר לתולעים ליםettle ידי השארת הצינור לעמוד במשך 5 דקות עד 10 לאחר מכן להסיר את supernatant המכיל E. בזהירות coli.
  4. חזור על שלבים 3.2 ו3.3 2x כדי להסיר כמה שיותר החיידקים השיורי ככל האפשר לפני שתמשיכו את ההליך.
  5. Resuspend התולעים ב0.1 N NaCl בנפח שהוא כפול של שלוש, למשל 1.5 מיליליטר, 3 מיליליטר או 6 מיליליטר שבו ניתן לראות תולעים בודדים בצינור.
  6. להלבין את התולעים על ידי הוספת 5 N NaOH ו -5% נתרן היפוכלוריט פתרון (אקונומיקה) ביחס 1:02:06 להשעית התולעת. לדוגמא, 1 מיליליטר 5 N NaOH: 2 מיליליטר 5% נתרן היפוכלוריט: 6 מיליליטר של ההשעיה התולעת. מערבבים את NaOH ואקונומיקה לפני שמוסיף להשעית התולעת.
  7. ורטקס הפתרון במרץ עד התולעים הרה להולדת הם מומסים ורק ביצים הן גלויות בתוך ההשעיה (כ 5 דקות עד 10). לפקח על התהליך באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב עם מטרת 10X.
  8. אחרי התולעים נמסו לגמרי, מייד גלולהביצים על XG 800 ל45 שניות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולשטוף את הכדור פעמיים עם 10 מיליליטר של מים סטריליים על ידי צנטריפוגה גלולה ב XG 800 ל45 שניות ב 4 ° C.
  9. אחרי הלבנה, להעביר את כדור הביצה לבקבוק תרבית רקמה 25 2 סנטימטר המכיל 10 מיליליטר של תקשורת mCeHR תוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין. לבצע הליך זה באמצעות טכניקות סטרילית. אם תרצה, להוסיף אנטיביוטיקה נוספת, ובכלל 250 מיקרוגרם / חומצת nalidixic מיליליטר, כדי למנוע התפתחות חיידקים בתרבויות נוזלי axenic.
  10. דגירה התרבויות נוזלית ב20 ° C בחממה רועדת בכ 70 סל"ד.
  11. בדקו את התולעים מדי יום כדי לציין את השלב של פיתוח וקצב צמיחה.
    הערה: תולעים יהיו בתחילה לגדול לאט ודורשים 7-10 ימים להפוך להרה. עם זאת, כמו התולעים להתאקלם למדיום הנוזלי זמן הדור יקטן לכ -4 ימים לwildtype תולעים (N2).
  12. אחרי שיש לי התולעים developed לבמה ההרה להולדת בתקשורת נוזלית, להעביר את תרבות תולעת צינור חרוטי וגלולים את התולעים ב800 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
  13. הסר את supernatant ועדינות resuspend את כדור התולעת בנפח שווה של 0.1 M NaCl. לדוגמא, השתמש 10 מיליליטר של 0.1 M NaCl לתולעים בתרבית 10 מיליליטר של mCeHR. לאפשר התולעים להתיישב למשך 5 דקות על קרח.
  14. לבצע את הליך הלבנת כפי שתואר לעיל בצעדי 3.5-3.8, ולאפשר לתולעים לגדול לדור שני בתקשורת נוזלית axenic. במידת צורך, להוסיף את האנטיביוטיקה שוב כדי לעכב את צמיחת חיידקים.
  15. שוב לאפשר התולעים להפוך הרה להולדת אז גלולה ו resuspend את התולעים ב0.1 M NaCl כפי שמתוארים בצעדים 3.12 ו3.13, אז להלבין שוב כפי שמתואר בצעדים 3.5-3.8, כדי לייצר אוכלוסייה מסונכרנת. לגדל את תולעי זחל L1 בתקשורת נוזלית ללא אנטיביוטיקה מעתה והלאה.

4. תולעים סנכרון מנוזליםתרבות

  1. גלולה וresuspend התולעים ב0.1 M NaCl כפי שתואר לעיל בצעדים 3.12 ו3.13. אקונומיקה כפי שתואר לעיל בצעדי 3.5-3.8.
  2. Resuspend את כדור הביצה ב10 מיליליטר של חיץ M9 ולאפשר לזחלים לבקוע O / N ב 20 ° C על שייקר פלטפורמה מסתובב. הערה: הביצים יבקעו לזחלי L1, אבל לא לפתח עוד יותר, סנכרון התולעים בשלב L1.
  3. כדי לשמור ותולעים תת, גלולה זחלי L1 בXG 800 למשך 5 דקות, ולאחר מכן resuspend הזחלים ב10 מיליליטר של mCeHR והעברה לבקבוק 25 2 סנטימטר. לאפשר התולעים לגדול ב 20 ° C על פלטפורמה מסתובבת. לשמור על צפיפות מקסימלית של 3,000 תולעים / מיליליטר / 2 סנטימטר, כדי להבטיח תזונה נאותה לתולעים.
    הערה: בשלב זה, אנטיביוטיקה אינן נדרשת לשמור על תנאי axenic כאשר ההליכים מתבצעים באמצעות טכניקות סטרילית בזרימה למינרית. תולעים יש לבדוק מדי יום כדי לעקוב אחר צמיחה.

5. חינםזיע ותולעי הפשרה לתרבויות Axenic בינוני

  1. להקפיא תרבויות axenic אסינכרוני תולעת או זחלי L1 מסונכרנים בחנקן נוזלי. תולעים גלולה ב XG 800 למשך 5 דקות ואז resuspend במאגר S (6.45 מ"מ 4 KHPO, 43.55 מ"מ 4 KHPO, 146.25 מ"מ NaCl) באמצעות 0.5 מ"ל לכל בקבוקון. הוסף נפח שווה של חיץ S עם 30% גליצרול v / v לכל בקבוקון ולהעביר את התולעים ל-80 מעלות צלזיוס לפני אחסון לטווח ארוך בנוזל N 2. הקפא כ 1 x 10 6 תולעים לכל מיליליטר בבקבוקון אחד.
  2. להפשיר תולעים על ידי דוגרים הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 2 דקות עד שכמעט כל הקרח נמס. בזרימה למינרית, להעביר את התולעים לבקבוק סטרילי המכיל mCeHR ולמקם אותם ב20 ° C.

6. לקבוע את ההשפעה של ריכוז hemin על צמיחה ועל העתקה מmCeHR

  1. השתמש בתקשורת mCeHR axenic לassay צמיחה תלויה תזונתית של ג elegans. על מנת לקבוע את השפעת of ריכוז hemin על צמיחת תולעת ופיתוח, משתמש מסונכרן תולעי N2 axenic או זנים אחרים של עניין. לסנכרן זחלי L1 כפי שתואר לעיל בסעיף 4.
  2. ביום הבא, גלולה ולספור זחלי L1 מסונכרנים ולדלל את תולעת 1 לμl של תקשורת axenic. הפוך כלוריד hemin 10 מ"מ ב0.3 4 OH M NH ולהתאים את ה-pH 8 באמצעות HCl המרוכז.
  3. הוספת 800 μl של תקשורת mCeHR לצלחת 24 גם. הוספת 100 תולעים היטב כל אחד באמצעי תקשורת 100 μl. הוספת כלוריד hemin היטב כל אחד בריכוזים הנעים בין 0 מיקרומטר, 1.5 מיקרומטר ל1,000 מיקרומטר בשלושה עותקים. ודא שכל הבארות מכילות את אותו הריכוז של 0.3 4 OH M NH. בעדינות resuspended התולעים לפני pipetting כדי להבטיח ש100 זחלי L1 מתווספים היטב כל אחד.
  4. לבחון את התולעים יומיים ולציין את הצמיחה בכל ריכוז בכל טוב. לספור את מספר התולעים לאחר 9 ימים של דגירה, ותתאר את מספר תולעי מיליליטר / המתאים לכל אחד hemeריכוז (איור 1).

7. השפעה של ריכוז hemin על תולעים חיישן הרן

  1. דגירה תולעים מסונכרנים L1 חיישן heme (GFP Phrg-1 ::) בmCeHR המכילים 4 מיקרומטר, 8 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו20 hemin מיקרומטר.
  2. תמונת התולעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal, 48 הודעה שעה דגירה (איור 2).

8. ניצול mCeHR ליצור מהונדס ג elegans שימוש microparticle הפצצה

הערה: ההליך להפקת וביצוע הפגזת microparticle באמצעות UNC-119 (ed3) תולעים גדלו בmCeHR מתואר באיור 3 13.

  1. הכנת תולעת
    1. העבר את התולעים כ 1 x 10 6 אסינכרוני UNC-119 (ed3) ב90 מיליליטר של תקשורת mCeHR ב175 סנטימטר 2 בקבוק שבוע לפני הפצצה. לאפשר התולעים לגדול ב20 o C °na רועד פלטפורמה ב ~ 70 סל"ד (איור 3-1).
      הערה: שבוע לאחר מכן, בצפיפות התולעת צריכה להיות גדולה יותר באופן משמעותי עם תולעים הרה להולדת למבוגרים רבים. כ 3 x 10 7 תולעים יידרשו להפגזת microparticle.
    2. צ'יל JM109 E. coli זורעים 10 צלחות NGM סנטימטר על קרח.
    3. העבר את תולעי axenic לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר ו צנטריפוגות התולעים בXG 800 למשך 2 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend את התולעים בכל צינור ב50 מיליליטר של חיץ M9 (איור 3-2).
    4. לאפשר לתולעים בוגרות כדי גלולה על ידי כוח הכבידה ל10-15 דקות על קרח.
      הערה: גלולה 2 מיליליטר עכשיו צריכה להכיל תולעים בוגרות> 90%. גלולה 2 מיליליטר זה צריכה להיות כ 5 x 10 6 תולעים, והוא מספיק להפגזת microparticle אחד.
    5. מעייל את פני השטח כולו של JM109 המצונן זורעים צלחת NGM עם גלולה 2 מיליליטר של תולעים. לאפשר לנוזלים להיספג לחלוטין ולאחר מכן לעזוב את הצלחתל30 דקות על קרח לפני שתמשיך (איור 3-3).
  2. הכנה של חלקיקי זהב
    1. שוקל 30 מ"ג של חלקיקי זהב לתוך צינור microcentrifuge siliconized. הוסף 1 מיליליטר אתנול 70% ומערבולת בצינור למשך 5 דקות.
    2. לאפשר את הצינור לשבת במשך 15 דקות, אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 שניות לגלולת חלקיקי הזהב. הסר את supernatant באמצעות פיפטה קצה על ידי הנגיעה בזהירות את הקצה בצד של ההפך הצינור לחלקיקי זהב.
    3. לשטוף את חלקיקי זהב עם 1 מיליליטר של מים סטריליים, מערבולת דקות 1 ובקצרה צנטריפוגות הצינור ב6,000 XG במשך 10 שניות. חזור על השלב לשטוף פעמיים, ואז resuspend חלקיקי זהב ב0.5 מיליליטר של גליצרול 50% סטרילי.
      שים לב: הריכוז הסופי של חלקיקי הזהב יהיה 60 מ"ג / מיליליטר, וזה יכול להיות מאוחסן במשך 1 עד 2 חודשים ב 4 ° C.
  3. מכין את תערובת חלקיקי DNA-זהב
    1. שלב 10 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד הרצוי עם 10 &# 956; גרם של פלסמיד הצלת UNC-119 בצינור microcentrifuge siliconized 1.5 מיליליטר. הוסף 50 μl מים DI ושל תמיסת חלקיקי זהב resuspended גם אז מערבולת דקות 1 100 μl.
    2. הוסף 150 μl של 2.5 M CaCl 2 ומערבולת הפתרון שוב דקות 1. לפתרון זה, להוסיף 60 μl של 0.1 M spermidine ו מערבולת במשך 3 עד 5 דקות.
    3. דופק צנטריפוגה הפתרון ב6,000 XG במשך 10 שניות, להסיר את supernatant ולהוסיף 300 μl של 70% אתנול. גם מערבולת דקות 1, צנטריפוגה הדופק ב6,000 XG, להסיר את supernatant ו resuspend ב 170 μl של 100% אתנול. במרץ מערבולת הפתרון ל5-10 דקות לאחר מכן דופק צנטריפוגות ולהסיר את supernatant.
  4. הפצצה (איור 3-3)
    הערה: פרוטוקול זה מתבצע במערכת מסירת החלקיקים המפורטת בטבלה של חומרים / ציוד. בצע את ההוראות למכשיר משלוח החלקיקים זמינים.
    1. הנח גיליון נייר רקמה לתוך צלחת 15 סנטימטר. בעזרת פינצטה, לטבול שבע macrocarriers בנפרד לתוך 100% אתנול ולהניח אותם על הרקמות לייבוש.
    2. לנקות ביסודיות את חדר biolistic, בעל macrocarrier, וצלחת היעד עם 70% אתנול. נקי וחיטוי מסכי לעצור לפני כל הליך הפגזה.
    3. טען את macrocarrriers לתוך המחזיק באמצעות פינצטה ולחץ לתוך מחזיק שימוש באפשרות הישיבה.
    4. להתפשט באופן שווה 20 μl של חלקיקי זהב DNA מצופה במרכזו של כל macrocarrier ולאחר מכן לאפשר הפתרון להתייבש לחלוטין.
    5. יש לנקות את שני חלקי מחיצת לחץ עם אתנול ולהרכיב עם דיסקי קרע אתנול ניקה. לדפוק את מחיצת הלחץ התאסף ודיסקי קרע לתוך תא ההפצצות.
    6. להרכיב מסך עצירת autoclaved עם בעל macrocarrier ולמקם את המנגנון על מדף המתכת הנדרש ונעילה במקום.
    7. הכנס את macr התאסףמנגנון ocarrier לתוך תא biolistic בחריץ שהוקצה מתחת למחיצת הלחץ וליישר עם מחיצת הלחץ.
    8. תדביק את צלחת NGM הפתוחה עם התולעים על מדף צלחת היעד ולסגור את הדלת של החדר.
    9. להפציץ תולעים, להתאים את הלחץ לכי צריך לשבור דיסקי הקרע. הפעל את הוואקום כדי 28 סנטימטרים של לחץ כספית, ולאחר מכן לחץ על כפתור האש עד הדיסקים להתפקע.
    10. לשחרר את הוואקום ולהסיר את צלחת NGM מהמנגנון. שטוף את התולעים מהצלחת ולהפיץ בעשרים 10 צלחות NGM סנטימטר זורעים עם JM109 E. coli (איור 3-4).
    11. לאפשר התולעים לגדול ל10-14 ימים ב ° C25 ולהרעיב את הצלחות. תולעים חולצו מפגם UNC-119 יהיו תנועה רגילה וניתן לזהות בשלב זה. לאסוף לפחות 10 תולעים "wildtype" מצלחות נפרדות לניתוח נוסף כמו אלה מייצגים קווים מהונדסים עצמאיים (figurדואר 3-5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Culturing ג elegans בעזרי axenic נוזל בינוניים בקביעה של חומרים מזינים הנדרשים על ידי תולעים, ללא הפרעה מצד מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי א coli. תולעי wildtype N2 להתאקלם לתקשורת mCeHR בתוך שלושה דורות ולהציג צמיחה דומה לתולעים גדלו על צלחות חיידקי NGM. ואכן, התולעים אלה הופכים הרה להולדת בתוך 4 ימים לעומת 3.5 ימים לתולעים גדלו על OP50 חיידקים.

אחד יתרונות של שימוש mCeHR היה לראות במחקרים שב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה אנו מציגים mCeHR הותאם axenic נוזל מדיה המאפשרת לג המהיר דור elegans עם ייצור של מספר רב של תולעים. מדיה זו מציגה מספר יתרונות כמו התולעים גדלים בלי לזהם E. coli או תוצרי לוואי וחיידקים יכול להיות מנוצלים במחקרים תזונתיים וטוקסיקולוגי. שימושו של ע ' יש חיידק או חיידקים אחרים במחקרים מסוג זה יש כמה חסרונות. למשל, הצמיחה של החיידקים יכולה להשתנות בתנאים שונים והחיידקים יכולים לעכל מולקולות שנמצאים assayed, ובלבלו את הפרשנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד העניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לHealthGrants DK85035 וDK074797 (IH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MgCl2• 6H2OSigmaM-2393
נתרן ציטראטSigmaS-4641
אשלגן ציטראט מונוהידראטSigmaP-1722
CuClsub2• 2H2OFisherC455-500
MnCl2• 4H2OFisherM87-100
ZnCl2SigmaZ-0152
Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2OSigmaF-1018
CaCl2• 2H2OפישרC70-500
אדנוזין 5 -מונופוספט, מלח נתרןסיגמאA-1752
ציטידין 5 -פוספטסיגמאC-1006
גואנוזין 2' - ו-3' -מונופוספטסיגמאG-8002
אורידין 5 -פוספט, מלח דיסודיוםסיגמאU-6375
תימיןסיגמאT0376
N-אצטיל גלוקוזאמיןסיגמאA3286
DL-אלניןפישרS25648 
p-אמינו-בנזואית חומצהסיגמאA-9878
ביוטיןסיגמאB-4639
ציאנוקובלמין (B-12)סיגמאV-2876
פולינט (Ca)SigmaF-7878
ניאציןסיגמאN-0761
ניאצינמידסיגמאN-3376
פנטתאיןסיגמאP-2125
פנטותנט (Ca)סיגמאP-6292
חומצה פטרוילגלוטמית (חומצה פולית)ACRCS21663-0100
פירידוקסל 5'-פוספטסיגמאP-3657
פירידוקסאמין 2HClסיגמאP-9158
פירידוקסין הידרוכלורידסיגמאP-6280
ריבופלבין 5-PO<תת>4(Na)SigmaR-7774
תיאמין הידרוכלורידסיגמאT-1270
DL-6,8-חומצה תיאוקטיתסיגמאT-1395
KH<תת>2PO<תת>4SigmaP-5379
כולין די-חומצה ציטראטסיגמאC-2004
myo-אינוזיטולSigmaI-5125
D-GlucoseSigmaG-7520
Lactalbumin הידרוליזט אנזימטיSigmaL-9010
Brain Heart InfusionBD211065
Hemin chlorideFrontier ScientificH651-9
HEPES, מלח נתרןSigmaH-3784
כולסטרולJ.T. BakerF676-05
MEM חומצות אמינו לא חיוניותInvitrogen11140-076
MEM תמיסת חומצות אמינוInvitrogen11130-051
חומצה Nalidixic מלח נתרןSigmaN4382
טטרציקלין הידרוכלורידMP ביו-רפואי2194542
מערכת אספקה ביוליסטיתBioRad165-2257
חלקיקי זהב (אבקת Au)   Ferro Electronic Material Systems6420 2504, חלקיקי JZP01010KM
או
זהב 1.0 μ מBioRad  165-2263

מקורות

  1. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  2. Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
  3. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
  4. Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
  5. Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
  6. Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109(2011).
  7. Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
  8. Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
  9. Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
  10. Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044(2010).
  11. Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
  12. Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
  13. Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
  14. Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
  15. Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19(2003).
  16. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
  17. White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
  18. Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
  19. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  20. Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40(2004).
  21. Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גידול C. elegansמצע M-C-E-H-Rריכוזהם של המיםדרישות תזונהטכניקה סטריליתסנכרון תולעיםחיישנים פלואורסצנטיים
Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.