מאמר שיטה

שריר חלק בשלפוחית ​​השתן רצועת התכווצות כשיטה להערכת נמוכה יותר בדרכי שתן פרמקולוגיה

DOI:

10.3791/51807

⸱

18 באוגוסט 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מציג פשוט, אך רב עוצמה, בשיטה חוץ גופית להערכת התכווצות שריר חלק בתגובה לסוכנים תרופתיים או גירוי עצב. יישומים עיקריים הם הקרנת סמים ופיזיולוגיה רקמת הבנה, פרמקולוגיה, ופתולוגיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה במבחנה למדידת התכווצות שריר חלק בשלפוחית ​​השתן, ושימוש בו לחקירת מאפיינים פיסיולוגיים ותרופתיים של שריר החלק, כמו גם שינויים הנגרמים על ידי פתולוגיה. שיטה זו מספקת מידע קריטי להבנת תפקוד שלפוחית ​​השתן תוך כדי התגברות על קשיים גדולים מתודולוגיים נתקלו בניסויי vivo, כגון מניפולציות כירורגית ותרופתיות המשפיעות על יציבות והישרדות של ההכנות, שימוש ברקמות אנושיות, ו / או שימוש בכימיקלים יקרים. הוא גם מספק דרך לחקור את המאפיינים של כל מרכיב בשלפוחית ​​השתן (כלומר שריר חלק, רירית, בעצבים) בתנאים בריאים ופתולוגי.

שלפוחית ​​השתן הוא להסיר חיה הרדים, להציב פתרון קרבס וחתוך לרצועות. רצועות ממוקמות לתוך תא מלא בפתרון קרבס חם. קצה אחד מחובר לtensio איזומטרימתמר n למדוד כוח התכווצות, בקצה השני מחובר למוט קבוע. רקמה היא מגורה על ידי ישירות הוספת תרכובות באמבטיה או על ידי אלקטרודות גירוי שדה חשמליות המפעילות את עצבים, בדומה למפעיל התכווצויות שלפוחית ​​in vivo. אנו מדגימים את השימוש בשיטה זו על מנת להעריך התכווצות שריר חלק ספונטנית במהלך פיתוח, ולאחר פגיעה בחוט השדרה ניסיונית, הטבע של עצבית (משדרים וקולטנים מעורבים), גורמים מעורבים בויסות של פעילות שריר חלק, התפקיד של רכיבי שלפוחית ​​בודדים, ומינים והבדלי איבר בתגובה לסוכנים תרופתיים. בנוסף, הוא יכול לשמש לחקר מסלולים תאיים מעורבים בהתכווצות ו / או הרפיה של שריר החלק, יחסי מבנה פעילות תרופה והערכה של שחרור משדר.

שיטת התכווצות שריר חלק במבחנה כבר נעשה שימוש נרחב FOr מעל 50 שנים, וספק נתונים שתרמו באופן משמעותי להבנה של תפקוד שלפוחית ​​שלנו, כמו גם לפיתוח תרופות של תרכובות המשמשות כיום מבחינה קלינית לניהול שלפוחית ​​השתן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שריר החלק בשלפוחית ​​השתן נרפה כדי לאפשר אחסון שתן, וחוזים לעורר חיסול שתן. הרפיה מתווכת על ידי תכונות שריר חלק פנימיות ועל ידי שחרור טוניק של נוראפינפרין (NE) מהעצבים הסימפתטית, אשר מפעיל קולטני בטא adrenergic (β 3 AR באדם) בdetrusor. רקה מושגת על ידי עיכוב הקלט האוהד והפעלת העצבים הפאראסימפתטית שישחררו ACH / ATP להתכווץ שריר החלק בשלפוחית ​​השתן 1. תנאים רבים פתולוגיים, כולל מוח ו / או פגיעה בחוט השדרה, מחלות ניווניות, סוכרת, חסימת מוצא שלפוחית ​​השתן או דלקת שלפוחית ​​השתן interstitial, יכולים לשנות את תפקוד שלפוחית ​​השתן עמוק, עם השלכות קשות על איכות חיים של המטופל 2. תנאים אלה לשנות את ההתכווצות של שריר החלק על ידי המשפיע על אחד או יותר מרכיבים של שלפוחית ​​השתן: שריר החלק, מביא או עצבי efferent ו / אורירית.

כמה in vivo ובשיטות מבחנה ללמוד תפקוד שלפוחית ​​השתן פותחו. בvivo, cystometry הוא המדידה הראשונית של תפקוד שלפוחית ​​השתן. למרות זאת היא הכנה שלמה המאפשרת איסוף מידע במסגרת קרובה לתנאים פיסיולוגיים, יש מספר הנסיבות שבהן השימוש ברצועות שריר חלק הוא מועדפת. אלה כוללים מצבים שבם וכירורגי / או מניפולציות תרופתי ישפיעו על ההישרדות והיציבות של הכנת in vivo, או כאשר המחקרים דורשים שימוש ברקמה האנושית או כימיקלים יקרים. שיטה זו גם מאפשרת בדיקה של ההשפעות של תרופות, גיל ופתולוגיה בכל רכיב של שלפוחית ​​השתן, כלומר שריר חלק, רירית, מביא ועצבי efferent.

רצועות שלפוחית ​​כבר מועסקות במשך השנים על ידי קבוצות רבות לענות על מספר שאלות מדעיות. הם היו רגילים לevaשינויי luate בפעילות ספונטנית myogenic הנגרמים על ידי פתולוגיה. הוא האמין כי פעילות זו תורמת לתסמיני דחיפות ותכיפות של פעילות יתר של שלפוחית ​​(OAB), ולכן הוא יעד לתרופות שפותחו עבור OAB 3-9. רצועות שלפוחית ​​השתן שמשו גם כדי לחקור גורמי myogenic ועצביים המווסתים את טונוס שרירים חלק במטרה לגלות תעלות יונים ו / או קולטנים ו / או מסלולים תאיים שיכול להיות ממוקדת כדי לגרום או הרפיה או התכווצות של שריר חלק 3,10- 13. מחקרים אחרים התמקדו בטבע של עצבית, כולל משדרים וקולטנים המעורבים ושינויים הנגרמים על ידי פתולוגיה 14,15. בנוסף, השיטה הייתה בשימוש להשוואה בין רקמות ממינים שונים 16- 18, בין האיברים 19-21, והערכה של מערכות יחסים מבנה פעילות תרופת 22-24. סיומת של שיטה זו נעשתה שימוש כדי measurדואר את ההשפעה של תרופות על שחרור משדר מעצבי efferent 25. יתר על כן, מגוון רחב של רקמות (שלפוחית ​​השתן, שופכה, מערכת עיכול, במערכת העיכול) שנקטפו מבעלי חיים או בני אדם (מניתוחים או רקמת תורם איברים שאושרו למחקר) וממגוון רחב של מודלים של בעלי חיים, כולל פגיעה בחוט השדרה (SCI), חסימת מוצא שלפוחית ​​השתן (BOO), או דלקת שלפוחית ​​השתן interstitial (IC) יכול להיחקר שימוש בטכניקה זו.

במאמר זה אנו מציגים את השימוש בשיטה זו יחד עם פרוטוקולי ניסוי הכרחיים, כדי לטפל בכמה שאלות מדעיות שהוזכרו לעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים שתוארו כאן אושרו על ידי ועדת IACUC באוניברסיטת פיטסבורג.

.1 פתרונות

  1. הכן פתרון קרבס על פי המתכון. הרכב במ"מ: 118 NaCl, KCl 4.7, CaCl 2 1.9, 4 MgSO 1.2, NaHCO 3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, דקסטרוז 11.7.
  2. לאוורר קרבס עם 95% O 2, 5% CO 2 ולמקם אותו באמבט 37 ºC מים לשימוש לאורך כל הניסוי. מניחים בצד ~ 200 מ"ל של תמיסת קרבס סודה בטמפרטורת חדר שישמש לנתיחת רקמות.
  3. למדוד pH (~ 7.4) וosmolarity (~ 300 mOsm) של קרבס סודה.

.2 ניסויי Set-up (איור 1 א סכמטי)

  1. מלא סודה (95% O 2, 5% CO 2) תאים עם 10 מ"ל קרבס.
  2. התחל משאבת מים במחזור כדי לחמם את התאים ל37 ° C; מגבר (ים), ממריץ (: להפעיל את הציוד הדרושתוכנת ים) והקלטה.
  3. לכייל מתמרים עם משקל 1 גרם.

.3 רקמות (איור 1)

הסר את שלפוחית ​​השתן מעכברוש ספראג Dawley נשי נאיבי מבוגר (200-250 גר '; ~ 10-12 שבועות) ביצוע השלבים הבאים:

  1. הכינו אזור לנתיחה ומכשירים דרושים: סכיני גילוח חשמליים, מלקחיים עם שיניים, להב סכין מנתחים, מספריים לנתח, microscissors, שני מלקחיים לנתח (מחברים מעדיפים דומון # מלקחיים 3), קטעי רקמה (או תפר משי), צלחת לנתיחה Sylgard מצופה בקרבס ו סיכות לנתיחה רקמות.
  2. להרדים את החיה עם שאיפת isoflurane (4% בO 2) בחדר האינדוקציה. השתמש במשחת טרינריים המשפיעה על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לפקח באופן רציף את רמת ההרדמה על ידי התבוננות קצב הנשימה, תגובה לגירויים חיצוניים, ואובדן של איבר אחורי לסגת רפלקס.
  3. כאשר בעל החיים הוא מורדמים גילוח הבטן התחתונהמחשבה. לחשוף את אברי האגן דרך חתך בבטן קו האמצע. זהה את שלפוחית ​​השתן ושופכה. הסר את שלפוחית ​​השתן על ידי חיתוך בצוואר שלפוחית ​​השתן בסמוך לשופכה הפרוקסימלית. הנח רקמה מייד בצלחת המצופה Sylgard מלא פתרון קרבס סודה.
  4. במידת הצורך, להסיר רקמה נוספת בשלב זה: שופכה, חתיכות של מערכת עיכול (GI) ו / או ערמונית, וכו '
  5. להקריב בעלי החיים תוך שימוש בשיטות שאושרו IACUC (למשל, מנת יתר הרדמה או חנק CO 2 ואחריו שיטה משנית).
  6. הכנס סיכות רקמה לנתח דרך כיפת שלפוחית ​​השתן, צוואר, והשופכנים, כדי לייצב את הרקמות לנתיחה נוספת. לא למתוח את הרקמה. הסרה של רקמת שומן, חיבור, שופכה הפרוקסימלית, והשופכנים אם קיימים.
  7. פתח את שלפוחית ​​השתן מהבסיס לכיפה כדי ליצור גיליון שטוח, צד serosa למטה / צד עד luminal (איור 1). הנח סיכות לנתח בכל פינה של הרקמה. הסר dom שלפוחית ​​השתןדואר ורקמות צוואר.
  8. אם מטרת הניסוי היא לקבוע את התרומה של הרירית (urothelium וpropria lamina - ראה תרשים איור 1 ג) להתכווצות שריר החלק, להשוות את המאפיינים של רצועות detrusor עם ובלי הרירית המצורפת. לשם כך, לפני חיתוך הרקמה ברצועות, להסיר בזהירות את השכבה הרירית באמצעות קשתית אביב מספריים ומלקחיים עדינים תחת מיקרוסקופ לנתח. בסופו של הניסוי, לתקן את הרצועות לצביעת H & E כדי לאשר את הסרת הרירית שלמה. שים לב שהליך זה הוא קל יותר בשלפוחית ​​שתן עכבר מאשר בשלפוחית ​​השתן של חולדה.
  9. חותך את הרקמה לאורך מבסיס לכיפה לרצועות של ~ 2 x 8 מ"מ (איור 1). לקשור או לצרף סרטון רקמה בשני הקצוות של כל רצועה.
    הערה: שלפוחית ​​השתן של חולדה אחת בדרך כלל ניתן לחתוך לרצועות 4 אך מספר הרצועות יכול לגדול או לקטון בהתאם לגודל חיה / שלפוחית ​​השתן.
  10. העבר את הרצועות לexperתאי imental. חבר קצה אחד של כל רצועה למתמר כוח, אשר מודד את התכווצות הרקמה, והשני למוט זכוכית / מתכת קבועה.
    הערה: תאי רקמות שונים בגודלם (0.2 מ"ל ל20 מ"ל או גדול יותר). תאים אופייניים לשלפוחיות מכרסמים הם 5-20 מ"ל, המספק גובה מספיק לרצועות להיות טבלו לגמרי בפתרון. תאים מסוימים מגיעים עם מובנה באלקטרודות גירוי, אחרים לא. יש להקפיד על מנת להבטיח כי כל החיבורים של אלקטרודות נמצאים במצב טוב, אחרת גירוי שדה חשמלי הוא לא אמין.
  11. למרוח כמות מוגדרת של כוח לכל רצועה בעדינות על ידי מתיחת הרקמה עד מתח בסיסי מגיע g 1 (~ 10 MN). בתחילה הרקמות נוטה להירגע אשר נרשמו כירידה במתח בנקודת ההתחלה. רקמה לשטוף בערך כל דקות 15 באמצעות קרבס סודה החם ולהתאים את המתח הבסיסי ל1 גרם לאחר כל שטיפה. לאפשר רקמה לאזן ל~ 1-2 שעה או עד שהמתח בנקודת ההתחלה הוא יציב (כלומר הרפיה רקמה לא יותר).
  12. הוא הגיע כדאיות רקמות בדיקה על ידי הוספת KCl (80 מ"מ) ישירות לאמבטיה ל~ 5 דקות, או עד שתגובת רמה. תגובות לריכוזים גבוהים של KCl גם ניתן לחזור במהלך הניסוי או בסוף הניסוי ומשמשות לנרמול תגובות לתרופות אחרות או בין רצועות (ראה נורמליזציה לפי סעיף ניתוח נתונים).
  13. פעמים רקמה לשטוף מרובות (3-5x) עם קרבס סודה החם כדי לאפשר לרקמות לחזור למראש טיפול תנאים.

.4 גירוי פרוטוקולים

  1. כדי לחקור את ההשפעות של פתולוגיה בפעילות myogenic ספונטנית או טונוס שרירים חלק, להשתמש ברצועות שריר חלק ממודלים של בעלי חיים שונים כגון SCI, BOO, או ילודים. איור 2 מדגים את השימוש בשיטה זו כדי לחקור את השינויים בפעילות ספונטנית בשלפוחית ​​השתן במהלך פיתוח ו לאחר SCI. בנוסף, ניתן להשתמש בסוכנים תרופתיים לווסת spontaneous פעילות. איור 3 ממחיש את ההשפעה של מאפנני KCNQ ערוץ, flupirtine וXE991, על פעילות ספונטנית וטונוס שרירים חלק.
  2. לעקומות תרופתי חלקות מבנה גירוי שרירים תגובת ריכוז על ידי הוספת תרכובות מפתרונות מניות מרוכזות ישירות לאמבטיה במרווחי זמן מוגדר. השתמש בסמים וברכב ברצועות מקבילות לדין וחשבון על השפעות רכב והזמן.
    1. הפוך פתרונות מניות של תרכובות מבחן רצויים ב1000x ריכוז העבודה הסופי. לcarbachol (CCH), אגוניסט קולטן מוסקריניים, להכין המניות הבאות: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 מ ' ריכוזים סופי באמבטיה הוא 10 -8 M ל10 -5 M (4C דמויות, D). לneuromedin B (NMB), אגוניסט תת סוג 1 קולט bombesin, להכין המניות הבאות: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M וריכוזים סופיים באמבטיה הם 10 -11 M ל10 -6 מ ' שני CCH וNMB צפויים להגדיל התכווצות רקמה.
    2. לאמבטיה רקמות 10 מ"ל, להוסיף 10 μl של כל פתרון מניות CCH בהקדם התגובה מגיעה לרמה (איור 4C, D). ברצועות מקבילות להוסיף כמויות שווה של הרכב (מים). בדומה לכך, להוסיף 10 μl של כל פתרון B מניית neuromedin כל דקות ~ 5.
      הערה: שים לב לאפקט מעורר של NMB וCCH על טונוס שרירים חלק ברצועות ממינים שונים באיור 4.
    3. לחקור את תכונות ההרפיה של השרירים החלקים ברקמות נדבקו מראש עם סוכן מעורר, בדרך כלל CCH או KCl.
    4. כדי לחסום תגובת אגוניסט, pretreat הרקמה ל10-20 דקות עם היריב כדי לאפשר חדיר לרקמות, לפני אגוניסט גירוי.
  3. לסטים עצבייםulation של שריר החלק, גירוי שדה חשמלי הנקרא גם (EFS) בצע את פעולות 1-3.13 ולהמשיך כמתואר בהמשך. EFS נועד להפעיל באופן סלקטיבי עצבים לעומת שריר חלק. פרמטרים לגירוי צריכים להיות שנבחרו בקפידה, כדי למנוע גירוי שריר חלק ישיר.
    1. לקבוע פרמטרים גירוי: סוג של גירוי (פולסים בודדים או רכבות), משך (משך דופק ומשך רכבת), תדירות ועוצמה, כפי שמתוארים בשלבים הבאים ומאויר באיורים 5A, B.
      1. לגירוי אחד הדופק, משך דופק סט, מרווח בין גירוי ומספר הגירויים הרצויים. פרמטרים משך גירוי רגילים הם פולסים בודדים של .05-0.3 משך אלפיות שני נמסר במרווחים רצויים (איור 5 א). בצע צעד 4.3.1.4 לעוצמת גירוי.
      2. לגירוי רכבת, להגדיר את משך זמן רכבת ומרווח רכבת היתר. ערכים אופייניים לרקמת השלפוחית ​​3-10 שניות נמסרו מ 'לפחות 1בזה מזה (איור 5). אם עייפות רקמות מתרחשת (כלומר EFS התכווצויות לרדת במהלך תקופת ביקורת), הגדל את המרווח בין הרכבת.
      3. להקים את התדר של גירויי רכבת (מספר הפעימות ברכבת - איור 5 ב). הפעל עקומת תגובת תדר נעה 0.5-50 הרץ. תדרים אופייניים לשלפוחית ​​שתן הם 10-20 הרץ, אשר נותן התכווצויות לשחזור ויציבים בתיווכה של ATP וACH. שים לב לתגובות התדירות תלויות לגירוי EFS ברצועות שלפוחית ​​השתן עכבר באיור 5 מדגימים כיצד שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את התרומה של הכולינרגית ומנגנוני purinergic להעברה עצבית.
      4. להקים עוצמת הגירוי: באופן שיטתי להגביר את עוצמת (מתח) של הגירוי עד המשרעת של ההתכווצות מגיעה לרמה (אם רכבות באמצעות לשמור קבועות בתדר).
      5. הגדר את עוצמת הגירוי בהתאםמטרה של הניסוי. אם המטרה היא להגדיל את ההתכווצויות עוררות העצביות, ולאחר מכן להשתמש בעוצמה submaximal כך שהמשרעת של התכווצות היא ~ 50% מהתכווצות מקסימלי. אם המטרה היא להפחית את ההתכווצויות עוררות העצביות, ולאחר מכן קבע את עוצמת ל~ 80% ממשרעת המרבית כדי למנוע עייפות רקמה.
    2. ברגע שפרמטרי גירוי (משך, תדירות ועוצמה) הם הקימו, לאפשר ~ 20-30 דקות לEFS- עוררו התכווצויות לייצב לפני בדיקות סמים.
      הערה: כדי לאמת את הסלקטיביות של EFS להעברה עצבית, הולכה עצבית בלוק עם חוסם Na + הערוץ, tetrodotoxin (TTX; 0.5-1 מיקרומטר). לבצע שלב זה בתחילת הניסוי, כTTX שוטף קל יחסית. בנוסף, לבצע את זה בסופו של הניסוי (ראה שלב 4.3.5. להלן).
    3. הכן פתרונות מניות ב1,000x ריכוזי עבודה הסופיים ל: אלפא, ביתא ATP-תילן (ABMA; activator קולט purinergicוdesensitizer) 10 -2 M, אטרופין (אנטגוניסט לרצפטור מוסקריניים) 10 -3 M (איור 5 ג). שים לב דוגמאות אחרות באיור 6. אגוניסט קולטן 5HT4, cisapride (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, x 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), מגביר התכווצות רקמות וSB-203,186 (3 x 10 -3 M), אנטגוניסט לרצפטור 5HT4, הופך השפעות של cisapride.
    4. כדי לבחון את ההשפעות של ABMA ואטרופין על EFS (איור 5 ג), לבצע שתי עקומות תגובת תדר שליטה. הוסף 10 μl של 10 -2 M ABMA לאמבטיה לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. זה יהיה חוזה הרקמות עקב גירוי ישיר של רצפטורים purinergic בשריר החלק. לאחר תשואות התגובה לנקודת התחלה, לחזור על עקומות תגובת תדר. הוסף 10 μl של 10 -3 אטרופין M לתרכיזים סופייםיון של 1 מיקרומטר. לאחר 10 דקות ~ (נדרשו עבור אטרופין לחסום קולטני מוסקריניים), עקומות תגובת תדר חוזרות. ברצועות מקבילות להוסיף 10 μl של הרכב, מים, בכל שלב.
      הערה: לקבלת דוגמאות אחרות באיור 6, להוסיף 10 μl של כל פתרון מניות cisapride במרווחי זמן מוגדר זמן (~ כל 15 דקות; ראו דיון), ואחריו 10 μl של פתרון מניות SB-203,186 ישירות לאמבטיה ולפקח על ההשפעה שלהם על EFS-induced התכווצות. ברצועות מקבילות להוסיף 10 μl של הרכב, DMSO. שים לב להשפעות של cisapride, אגוניסט קולטן 5HT4, על התכווצויות עוררו EFS ברקמות שלפוחית ​​השתן ומעי אנושיים באיור 6. בנוסף, לבחון את ההשפעה של DMSO, הרכב לcisapride, על התכווצויות עוררות EFS בשלפוחית ​​שתן אנושי ורקמות מעי .
    5. בסופו של פרוטוקול EFS לאמת את הסלקטיביות של EFS על ידי חסימת הולכה עצבית עם חוסם Na + הערוץ, tetrodotoxin (TTX; 0.5-1 &# 181; M). אם התכווצויות עמידות TTX עדיין קיימות, מומלץ להתאים את המשך ועוצמת הגירוי בניסויים הבאים.
  4. לקביעת ההשפעות של תרופות באתרים לפני או אחרי סינפטי (איור 7 א) בצע את שלבי 1 עד 4.3.2. להקים תגובות לשחזור לcarbachol וEFS, ולאחר מכן להוסיף X. תרופה
  5. בסופו של הניסוי, שחרר או להתיר את הרצועות, למחוק אותם בעדינות על פיסת נייר טישו כדי למנוע נוזלים עודפים ולמדוד המשקל של כל רצועה באמצעות איזון. גם למדוד את אורך הרקמות באמצעות קליפר כדי לקבוע אזור חתך. מידע זה משמש לנורמליזציה של נתונים (ראה סעיף 5.4).

ניתוח .5 נתונים

לנתח נתונים באמצעות תוכנה מתאימה (למשל, Windaq, LabChart).

  1. לפעילות ספונטנית, לבחור חלון של לפחות 30 שניות לפני ובשיא של תגובת התרופה המושרית ומשרעת ASURE ותדירות של פעילות myogenic (איור 3).
    1. השתמש בניתוח שינוי פורייה מהיר כדי לקבוע את הספקטרום של תדרים תורמים להתכווצות תגובות ואם יש הבדלים בין חלקים השונים של שלפוחית ​​השתן (לדוגמא, כיפה לעומת צוואר) או עם פיתוח, פתולוגיה, ותרופות 8.
  2. להשפעות על טונוס שרירים חלק לבחור חלון של לפחות 10-30 שניות לפני ובשיא של תגובת התרופה המושרית ולמדוד המשרעת של התכווצות.
  3. להשפעות על התכווצויות עצביות עוררות למדוד משרעת, משך ושטח מתחת לעקומה של התכווצויות (לפחות 3) לפני ובשיא של תגובת תוצאת משימוש בסמים.
    הערה: יש צורך למדוד גם את המשרעת ושטח מתחת לעקומה של התכווצויות נגרמות על ידי EFS בגלל שיש לי רכיבים purinergic והכולינרגית קינטיקה שונה. מרכיב purinergic הוא מהיר וחולף (ATP מפעיל purinergiערוצי ionotropic ג כגון P2X1 המאפשרים זרימה מהירה של סידן, אז הם להפחית רגישות), ובכך לתרום יותר לתגובת המשרעת שיא ופחות לשטח מתחת לעקומה. המרכיב הכולינרגית הוא איטי יותר ומתמשך (ACH מפעיל קולטנים מוסקריניים metabotropic, שדורשים זמן רב יותר כדי להפעיל מסלולים תאיים שסופו של דבר להפעיל את תעלות יונים שdepolarize שריר החלק לגרום להתכווצות). לפיכך, מרכיב מוסקריניים הוא נתפס טוב יותר על ידי מדידת השטח מתחת לעקומה.
  4. לנרמל את הנתונים כדי להיות מסוגל להשוות את התוצאות על פני רצועות וטיפולים תרופתיים. הפרמטר שנבחר לנורמליזציה לא צריך להיות מושפע מתרכובות הבדיקה, מצב פתולוגי למד או עיצוב ניסיוני. בין הפרמטרים האלה, במשקל רצועת שימוש, אזור חתך, תגובות KCl (איור 4),% מהתגובה המקסימלי (איור 7) או% מהתגובה המקסימלי לסוכן התכווצות נוספת(לדוגמא, CCH) או סוכנים מרגיעים (למשל, papaverine).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פעילות myogenic ספונטנית

פעילות myogenic ספונטנית היא אופייני שריר חלק חשוב שעובר שינויים עם התפתחות לאחר הלידה 6-9 ופתולוגיה (למשל, SCI, BOO) 3-5. משום שהאמינה כי פעילות זו תורמת לסימפטומים של פעילות יתר של שלפוחית ​​(OAB) 2, הערכה של קולטנים, מסלולים תאיים וסוכנים תרופתיים המווסתות אותו, היא בריבית גבוהה לפיתוח טיפולים יעילים לOAB וחוסר תפקוד שריר חלק א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים פשוטים בשיטת מבחנה שריר חלק התכווצות שיכול לשמש כדי לטפל במספר השאלות מדעיות חשובות הקשורים לפיזיולוגיה בשלפוחית ​​השתן ופתולוגיה, כמו גם סיוע לגילוי תרופות חדשות לטיפול בתפקוד שלפוחית ​​השתן. יש לנו הדגמתי את השימוש בשיטה זו להערכת מאפיינים התפתחותיים, פתולוגי ותרופתיים של התכווצות שריר חלק בשלפוחית ​​השתן (איורים 2-4), אפנון עצבית (5-7A איורים), מיני הבדלים (איור 4), הבדלי איבר (איור 6)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH R37 DK54824 וR01 DK57284 לק"ג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Equipment
מערכת אמבט רקמות עם מאגרRadnoti, LLC159920אמבטיות רקמות מבודדות
משאבת מחזור מים חמיםKent Scientific Corporation TPZ-749כדי לשמור על אמבטיות טישו ל-37 ו-#176; C
מערכת רכש נתונים
מגבר מתמר Transbridgeמכשירים מדויקים בעולםSYS-TBM4Mמגבר מתמר
ממריץ דשאטכנולוגיות דשאדגם S88ממריץ
מערכת הרדמהקנט תאגיד מדעי ACV-1205Sלהרדמת
קופסת ההרדמהמכשיר הרווארד500116להרדמת בעל החיים
מסכות הרדמהקנט סיינטיפיק קורפוריישן AC-09508להרדמת החיה
<חזק>חומרים ומכשירים כירורגיים
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITלסיכה, ניתוח וחיתוך רקמות
צלחת פטריקורנינג3160-152לניתוח/חיתוך רקמות
סיכות חרקיםENTOMORAVIA Austerlitz סיכות חרקיםגודל 5להצמדת רקמה
כרית ספסלVWR International56617-014רפידות ספסל סופגות
ערכה כירורגיתKent Scientific Corporation INSRATKITלהסרה וניתוח רקמות
2 Dumont #3 מלקחייםקנט סיינטיפיק קורפוריישן INS500064להסרה וניתוח רקמות
מלקחיים של רקמותקנט סיינטיפיק קורפוריישן INS500092להסרה וניתוח רקמות אזמל
קנט סיינטיפיק קורפוריישן INS500236להסרה וניתוח רקמות
להב אזמלKent Scientific Corporation INS500239להסרה וניתוח רקמות
קוצץ מקצועי בריינטרי סיינטיפיק בע"מCLP-223  45להסרת חוט תפר פרווה
Fine ScienceTools 18020-50רקמת קשירה
מהדקי רקמותRadnoti, LLC158802חבר רקמה למוט/מתמר
1 גרם משקל  Mettler Toledo11119525לכיול
<חזק>כימיקלים
תמיסת קרבס:
נתרן כלורי
אשלגן כלורי
אשלגן פוספט מונו-בסיסי
מגנזיום גופרתי
דקסטרוז
סודיום ביקרבונט
סידן כלורי
מגנזיום כלוריד		 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		להכנת תמיסת קרבס
IsofluraneHenry Schein029405To להרדים את בעל החיים
  מיכל חמצןMatheson Tri Gasox251לשימוש עם מערכת הרדמה
מיכל קרבוגן (95% חמצן; 5% פחמן דו חמצני) Matheson Tri GasMoxn00hn36Dלאוורור תמיסות קרבס
ממוחשבת DataQ Instruments DI-710-UH כדי להציג, להקליט ולנתח נתונים של בעלי החיים חולדה מתמר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים