הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

22.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

21 באוגוסט 2014

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

במאמר זה

סיכום

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

תקציר

העשורים האחרונים היינו עדים לפיצוץ של כ מנגנוני בקרת ביטוי גני עניין מדעי ברמת RNA. ענף זה של ביולוגיה מולקולרית כבר מתודלק באופן משמעותי כתוצאה מגילוי noncoding RNAs כשחקנים מרכזיים בויסות לאחר תעתיק. כגון פרספקטיבה מהפכנית כבר מלווה ומופעלת על ידי הפיתוח של טכנולוגיות רבות עוצמה לאפיון ביטוי RNAs קצר, הן ברמת התפוקה הגבוהה (זיהוי הגנום) או כניתוח בודד מועמד (הצטברות מצב יציבה של מינים ספציפיים). למרות שכמה אסטרטגיות המדינה של אמנות זמינות כעת למינון או חזותי מולקולות שברחו כזה, assay צפון הכתם נשאר הגישה זכאית בביולוגיה מולקולרית להערכה מיידית ומדויקת של ביטוי RNA. זה מהווה צעד ראשון בדרך ליישום של, וטכנולוגיות יקרות יותר מתוחכמות, במקרים רבים, נותר שיטה מועדפת לתובנה בקלותלביולוגית RNA. כאן אנו סקירה כללית של פרוטוקול יעיל (Enhanced צפון כתם) לאיתור מייקרו RNA מתבטא בחולשה (או מיני RNA קטנים אחרים רגולטורים) מתסיסנית כל עוברים, גזורים באופן ידני רקמות / מבוגר זחל או בתאים בתרבית מבחנה. כמות מוגבלת מאוד של RNA נדרש והשימוש בחומר מתאי הזרימה cytometry-מבודדים יכולים להיות גם בחזונו.

מבוא

ביוכימיה RNA חוותה התקדמות מרהיבה בשנים האחרונות 1. ההבנה שלנו של פוטנציאל RNA בבקרת ביטוי גנים כבר פרצה על ידי זיהוי של ribo-רגולטורי noncoding החזקים 2, על ידי הגילוי של מנגנונים מבוססי RNA רומן הרגולציה 3,4 ועל ידי אפיון מעמיק יותר של אירועים שלאחר התעתיק כבר ידועים 5. כל הביולוגיה RNA יחד מחקרים אלה אפשרו לעשות באופן דרמטי את הסצנה, הפך נושא המחקר מרכזי בנוף המדעי הנוכחי. בפרט, בשנים האחרונות אנחנו מקבלים תחושה של ההשפעה המתפשטת של "עולם RNA" בנוירוביולוגיה המולקולרית 6, אחד מתחומי המחקר הדינמיים ביותר במדעי החיים מודרניים. בעשור האחרון של המאה שעברה, התרחיש המדעי הכולל כבר מהפכה על ידי הגילוי של התערבות RNA 7,8 ושל RNAs הרגולציה הקטן 9,10ביחס מסוים ל11 מייקרו RNA, באופן אנדוגני הביע RNAs noncoding הקטן מעורב בשליטה כמעט את כל הפונקציות הסלולריות כרגולטורי pleiotropic וקומבינטורית של ביטוי גנים.

כמעט 10 שנים לאחר הגילוי ראשוני מירנה בelegans Caenorhabditis ידי אמברוס והמעבדות של Ruvkun, תשומת לב מחודשת הפכה לשדה כאשר מספרים גבוהים של miRNAs זוהו בדרוזופילה ובתאים אנושיים, כמו גם 12-15. מאז, הודות לגישות מהונדסים תכליתיות, melanogaster דרוזופילה יש התבלט כהקשר ביולוגי יקר ערך עבור להתעמק ביוסינתזה ופעילות מירנה. דרוזופילה miRNAs חשפו פונקציות שונות בתהליכי חרקים ספציפיים או אבולוציונית משומרת, פורש מהזדקנות לחילוף חומרים, מסלולי איתות , התנהגות, וכמובן, נוירוגנזה. לאורך כיוון זה, אנו חשפו לאחרונה קישור רומן 16 בשיתוף המסקרןrrelation מתרחש בין GCM / דאיית גן האדון ומסלול RNA. גורם שעתוק זבוב GCM / Glide 17-19 מהווה דוגמא ייחודית של הקובע גורל תא, אשר מכתיב את בחירת הגורל העצבית גליה לעומת בmultipotent לטוס מבשרים עצביים 20. עשרים שנה מחקר ארוך בנושא זה באופן ברור הדגיש את התרחשותם של מספר רב של תשומות והחופפות של רגולציה ביטוי גנים מתכנסת על GCM / להחליק 21-28 להקים את רמות הסף הנדרשות לאיזון היחס העדין בין עמיתים עצביים וגליה במהלך התפתחות עצבית.

גילינו כי רגולציה, באמצעות מיקוד לפי Dmel-miR279 מייצגת רמת שליטה נוספת שתרמה לכוונון עדין שלאחר תעתיק של GCM / להחליק ביטוי 16. שיפורים מתודולוגיים ספציפיים בעולם, קווי מחקר אלה נדרשים: לאורך שנים, במספר טכנולוגיות שפותחו במקור כדי לנתח מסורתיתRNAs itional הוסב לכימות RNAs לא קטן קידוד, כמו כמבחני הגנה RNAse, מערכי cDNA 29-31, שיטות PCR בזמן אמת 32-35 ורצף 36,37. בצד השני, כיול של גישות טכניות טפח התקדמות רציפה בתחום.

צפון הכתם assay (NB, או assay כתם ג'ל RNA) מהווה דוגמא מייצגת: הוא מועסק במידה רבה לפרופיל הצטברות RNA, שכן הוא מבטיח שני quantitation רמת הביטוי, כמו גם קביעת גודל. עם זאת, רגישות העניים המהותית של השיטה היא להגביל כאשר הוא שיחול על מקלטי קנס ביטוי גנים נמוכים בשפע, כמו RNAs הקצר. תוצאה מזיקה היא הדרישה של כמויות גדולות של רנ"א הכל, מה שהופך את היישום שלה קשה לדגימות ביולוגיות ספציפיות. מסיבות כאלה, וריאנטים NB ספציפיים לגילוי RNA קטן פותחו 38-40: אנו ניצלנו proc NB השתפרedure 41 (ENB, משופר צפון כתם), ואילו הבהרת הגומלין הנ"ל בין Dmel-miR279 וGCM / דאייה.

שיטה זו מסתמכת על צעד כימי crosslinking מבוסס על הפעילות של נגזר Carbodiimide [1-אתיל 3-carbodiimide (3-dimethylaminopropyl), EDC] לתקן חומצות גרעין על תמיכה מוצקה. Carbodiimide הוא מקשר צלב צדדי הידוע לזרז את הקמתה של אגרות חוב אמיד בין קבוצות carboxyl או פוספט מופעלות וקבוצות האמינים 42. מאפיין זה יכול להיות מנוצל לזוג קוולנטית RNA הקטן באמצעות קבוצת 5'-הידרוקסיל מונו פוספורילציה לאמין קבוצות על פני השטח של קרום ניילון. תצורת הקובץ המצורף וכתוצאה מכך מגדילה את הנגישות של חומצות גרעין המשותקים ו, בתורו, את היעילות של הכלאת בדיקה-יעד, וכתוצאה מכך שיפור גילוי מדהים 43.

הטכניקה מניחה relevanc מסויםדואר במחקרים מולקולריים דרוזופילה, שבו ההתרחשות של כיתות רומן וייחודיות של RNAs noncoding הקטן מתגלה 44. בין אלה, rasiRNAs 45,46 מהווים תת סוג ספציפי של RNAs אינטראקציה-piwi (piRNAs 47), מעורב בהשתקת גני רצף ספציפי. פרטים אופרטיביים של שיטה זו מתוארים באופן מלא ומדמיינים להלן, ביחס לניתוח של מייקרו RNA Dmel-miR279 וDmel-miR286 ו, בפעם הראשונה, של אחד rasiRNA, rasi4. אנחנו דחפתי למצבים קיצוניים ששיטה זו, אשר אפשרה לנו לחשוף את המטרות הביעו גרוע מכמויות מינימליות של RNA (מיקרוגרם פחות מ 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אוסף 1 לדוגמא

  1. ניתוק 2 התאים של שניידר למחצה חסיד, (1-5 x 10 6 תאים בממוצע), על ידי pipetting ולמסוק אותם על ידי צנטריפוגה (1 דקות 100 XG). במקרה של במבחנה תאים חסיד תרבותיים, trypsinize אותם בתנאים סטנדרטיים או ישירות לאסוף אותם מצלחות לסכום נוח של מגיב מיצוי RNA, על ידי עזרה של מגרד תא.
  2. לאוסף עובר, לגדול זני דרוזופילה בכלובי זבוב ועוברים לתת להצטבר על צלחות הטלת ביצים. נגבו את העוברים על ידי מכחול במים מזוקקים (DH 2 O), להשליך פסולת על ידי סינון מסננת, לשטוף ולשחזר עוברים ב48 בקבוקון.
  3. כטכניקה חלופית, לנתח באופן ידני רקמות / איברים. לבודד אשכים (מערכת מועדפת לניתוח Pirna) מבטן דרוזופילה בופר פוספט (PBS) תחת סטראו (הגדלה 20X), על ידי שימוש במחטים לנתיחה או מלקחיים כמו מולualized בסאליבן et al 49.
  4. העלי homogenize דגימות על התמכרות של 0.5 כרכים של מגיב מיצוי RNA.

2 הפקת RNA / ניתוח

  1. ההוראות של היצרנים הבאים לבצע בידוד RNA באמצעות חומרים כימיים מסחריים. זהירות! סוכני מיצוי RNA הם בדרך כלל רעילים ומאכל. לחלופין, להחיל פרוטוקול מבוסס K proteinase לבידוד RNA 50, כדלקמן:
    1. לדלל דגימות לתוך 400 μl של Stop מיקס ולדגור על RT במשך 15 דקות.
    2. לשחזר רכיבי hydrosoluble ידי פנול הסטנדרטי: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ועקירות כלורופורם ועל ידי אתנול (EtOH) ממטרים / כביסה. אוויר יבש הדגימות וresuspend לdiethylpyrocarbonate (DEPC) -treated מזוקק פעמיים (dd) H 2 O.
  2. להעריך ריכוז RNA על ידי מדידת spectrophotometric UV. כמו כן להבטיח את טוהר RNA הוא גבוה, קרוב ל2.0, basעורך על 260 / קריאה 280.
  3. בדוק הכנת RNA על denaturing agarose ג'ל כדלקמן:
    1. בכוס נקייה, לפזר 1.2 גרם Agarose ב82 מ"ל של DEPC-DDH 2 O, תחת בחישה מתמדת. מרתיחים עד שהיא נמסה לחלוטין.
    2. אפשר פתרון ג'ל להתקרר; כאשר הטמפרטורה מגיעה 60 ° C להוסיף 10 מ"ל של 10X חומצה 4-morpholinepropanesulfonic (מגבים) חיץ לריכוז סופי 1X (FC), ו -8 מ"ל של 37% פורמלדהיד עד 3% FC. זהירות! פורמלדהיד הוא חומר מסרטן.
    3. יוצקים את הג'ל לתוך תא אלקטרופורזה אופקי. לאפשר את הג'ל לביסוס מתחת למכסת מנוע לשעה לפחות 1. בעקבות מיצוק, להטביע את הג'ל לתוך מגבים 1X.
    4. Aliquot 2 מיקרוגרם של מדגם RNA ו1 מיקרוגרם של סולם (השתמש סמן RNA כאשר הערכה מדויקת היא רצויה). הוסף 3 כרכים של צבע agarose טעינה (ALD) לרנ"א ולסולם. מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וקרירות באופן מיידי על קרח. CAUTION! תוכן של ALD (רומיד ethidium ופוראמיד, ראה חומרים) הוא mutagen ומאכל, בהתאמה.
    5. טען את הדגימות ולהפעיל את הג'ל על 50 V כ 1 שעות עם מחזור חיץ מדי פעם. בדוק את דפוס חלוקה RNA על ידי ההדמיה UV או הדמיה ג'ל. להכיר להקות דיסקרטיות המתאימות ל28S ו18S rRNAs ולtRNAs (ראה איור 1).
  4. המשך צפון Assay או RNA חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

.3 Denaturing Acrylamide ג'ל הכנה

  1. השתמש במנגנון קטן אנכי electrophoretic לצעד חלוקה זו (גודל צלחת על 8 סנטימטר x 9 סנטימטר, מ"מ 0.75 עובי מסרק).
  2. להרכיב משקפיים נקיים יחד במסגרת ליהוק.
  3. הכן 10 מ"ל של 10 acrylamide% / bis-acrylamide (19: 1) פתרון במגבי 1X, 7 מ אוריאה. מייד לפני המזיגה, להוסיף 10% persulfate אמוניום 100 μl ו10 μl של TEMED ומהירות לערבב הפתרון. זהירות! Acrylamide הוא רעיל למערכת עצבים וקרצינוגן.
  4. יוצקים את הג'ל בין לוחות זכוכית והכנס את המסרק היטב בזהירות כדי למנוע בועות. בואו ג'ל לפלמר ב RT לפחות 45 דקות לפני השימוש. לחלופין, לאחסן O ג'ל / N, עטוף בניירות מסנן ספוג מים ואטומים בניילון נצמד.

הכנת .4 דוגמא

  1. Aliquot .5-20 מיקרוגרם של RNA הכולל לכל דגימה. אם הנפח עולה על 3-4 μl, ואקום לייבש את המדגם.
  2. לקביעת גודל, לרוץ aliquot (20-30 CPS) של סולם נמוך לטווח radiolabeled במקביל לדגימות, כסמן (ראה סעיף 4.3 ו4.4 להכנה). פנקו אותו במקביל לדגימות, כפי שמתואר בשלב 4.5.
  3. סולם: להגדיר תגובה קדימה פוספט באמצעות 0.1 מיקרוגרם של סולם 10 נ"ב צעד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולעצור את התגובה על ידי הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל20 מ"מ FC.
  4. לטהר על ידי משקעים EtOH / כביסה, ייבוש באוויר וresuspend DDH 2 O (כ -100 μl). זהירות! 32 P הוא מקור רדיואקטיבי.
  5. לכל דגימה להוסיף נפח שווה של צבע acrylamide הכחול (ABD). לפגל על ידי חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומגניבות על קרח עד טעינה. זהירות! פוראמיד (תוכן בABD) הוא מאכל.

.5 Electrophoretic פלזמה

  1. הסר את לוחות זכוכית מתמיכת הליהוק וכראוי להרכיב אותם בתא אלקטרופורזה. מלא את שני החדר הפנימי וחיצוני עם מספיק מאגר פועל (RB).
  2. להסיר בעדינות את המסרק ומראש להפעיל את הג'ל על 200 V עבור 10 דקות. לפני דגימות טעינה, לשטוף את פיקדונות אוריאה מהבארות על ידי התזה כמה RB באמצעות מזרק.
  3. השתמש בעצות שטוחות לזהירות דגימות רבד מצעד 4.5 בחלק התחתון של כל טוב. בדקו את חיבורי האנודה וקתודה, כדי למנוע ריצה הפוכה. לאחר הדגימות להיכנס לג'ל ב100 V למשך 5 דקות, אניncrease המתח 200 V.
  4. לאורך חלוקה של כ 7 סנטימטר, 45 דקות-טווח ארוך מספיק. הימנע bromophenol כחול (פיגמנט מעקב בABD) לעלות על גדותיו את הג'ל.
  5. דמיינו בג'ל RNAs הארוך המופרד על ידי רומיד ethidium מכתים (EtBr), כצעד אופציונאלי:
    1. לחתוך 2 סנטימטר מהחלק העליון של ג'ל ובקצרה לשטוף את הפרוסה בDDH 2 O.
    2. דגירה הפרוסה ג'ל ב RT ל15 דקות עם רועד עדין בRB, EtBr 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​FC.
    3. Destain ג'ל ל15 דקות בRB, לדמיין rRNAs ארוך על ידי קרינת UV או הדמיה ג'ל. הגעה לטעינת RNA ואיכות (ראה תרשים 1, לוח 7). זהירות! Ethidium ברומיד הוא mutagen.
  6. בינתיים להמשיך סופג את החלק התחתון של ג'ל המכיל מיני RNA קטנים.

.6 ג'ל סופג

  1. חותך 6 חתיכות של נייר סופג כדי שיתאים לשטח הסופג וחתיכת uncharge שווה ערךקרום ניילון ד. לחלח גיליונות נייר, קרום ו2 רפידות סופגות בRB. הקפד לספוג לחלוטין את הרפידות על ידי סחיטתם שוב ושוב בRB.
  2. להסיר את הג'ל מהמכשירים ולפתוח את המשקפיים על ידי ממוצע של מרית. השתמש בחותך נקי כדי להסיר את הבארות. הנח גיליון נייר Whatman הרטוב על הג'ל בעדינות להרים את זה.
  3. מניחים את קרום הניילון על פניו חופשיות של ג'ל. סמן פינה כדי לכוון את המסנן בהתאם לטעינת מדגם. השלם את "הכריך" (חתיכות 3 נייר בכל צד). מרדדים מוט פלסטיק על פני השטח הכתם, כדי להסיר כל בועות אוויר אפשריות.
  4. הנח את הכתם בין שתי רפידות סופגות ולאחר מכן בקלטת הסופג. להרכיב את הקלטת במודול הסופג, למלא את התא עם RB ולבדוק את הכיוון הנכון (קרום הניילון חייב להישאר בין ג'ל והתחנה הסופי החיובית).
  5. העבר ב20 V עבור 20 דקות. הערה: על מנת להבטיח תנאים הומוגנית, לאחר 10 דקות לפתוח את המודול וr הסופגסוב הכריך ידי 180 ° לפני השלמת ההעברה.

.7 ממברנה Crosslinking

  1. הכן 6 מ"ל של תמיסה הטרי Crosslinking (XLS). להרוות 10 סנטימטר x 10 סנטימטר (גדול מקרום ניילון) פיסת נייר סופג עם XLS. זהירות! HCl (מרכיב של XLS) הוא מאכל מאוד.
  2. לפרק את הכתם ולמקם את הקרום על נייר סינון 3MM הרטוב. הערה: RNA לא חייב להיות במגע ישיר עם הנייר הרווי. הנח את המסנן ונייר בין שני לוחות זכוכית ולעטוף בניילון נצמד.
  3. מחממים את הקרום ב60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ואחריו DDH 2 O כביסה. אחסן ב-20 ° C או להמשיך לכלאה.

.8 ממברנה Prehybridization

  1. אם טעינת RNA נבדקה (צעד אופציונאלי 5.5), ישירות להמשיך לכלאה. או אחר, לחתוך 1 סנטימטר לחלק העליון של מסנן הניילון, כדי למנוע hybridizatio צולב בדיקהns לRNAs הארוך המופרד.
  2. מחממים 10 מ"ל של הכלאה פתרון (HS) על 37 מעלות צלזיוס. לפגל 1 מ"ג של זרע סלמון על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS.
  3. דגירה המסנן בHS ב37 ˚ C במשך שעה לפחות 1, תחת סיבוב בתנור הכלאה. בדוק שRNA-הצד של המסנן עומד בפני HS.

.9 Probe סינתזה

  1. הגדר את התגובה קדימה פוספט ב10 pmol של מולקולת אנטיסנס קצרה ספציפית, כפי שמתואר ב4.3.
  2. הוסף 5 כרכים של טריס-EDTA-NaCl (TEN) חיץ לתגובה ולטהר פריימר שכותרתו מנוקלאוטידים מאוגדים על ידי כרומטוגרפיה הדרת ג'ל על עמודי G-25 Sephadex (או גם על ידי המשקעים EtOH). פעילות בדיקה ניתן להעריך על ידי נוזל נצנץ מתפרצות.

10. ממברנה הכלאה

  1. החלף את HS מותש עם טרי 10 מ"ל aliquot (שהוכן והושלם כפי שתואר לעיל). מחממים את הבדיקה בC 95 מעלות עבור 10 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS רומן. דגירה המסנן על 37 מעלות צלזיוס ON.

כביסה 11. ממברנה

  1. לשחזר את פתרון ההכלאה ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס בתיבת מיגון רדיואקטיביות.
  2. יש לשטוף את המסנן בכביסה חוצץ (WB) ולשטוף אותו ביסודיות ל10 דקות ב RT.
  3. השתמש גייגר מילר גלאי לבדיקת רדיואקטיביות שיורית בפינות המסנן. כאשר פליטת רקע היא סביב 5 CPS, להמשיך קרום אקספוזיציה.

12. גילוי אותות

  1. לחשוף את המסנן על סרטי autoradiography או על גבי מסך תרמי מולקולרי. לחשוף אותות על ידי עיבוד צילום או המרה דיגיטלית.
  2. לנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנה ייעודית כימות (ImageJ או Optiquant).

13. ממברנה חישוף

  1. כדי להסיר אותות עיקריים, להטביע את הקרום ב500 מ"ל רותח פתרון חישוף, אז לדגור על RT דקות 1. המשך לרומן הכלאה (מראש) או לאחסן את המסנן ב-20 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על ידי ביצוע ההליך הכולל המתואר בטקסט ואופן סכמטי המיוצג באיור 1, אנו הערכנו ביטוי RNA הקטן מדוגמאות RNA מורכבות של מקורות שונים. בניסוי שהוצג באיור 1, RNA היה מבודד מ2 התאים של דרוזופילה שניידר על ידי מיצוי proteinase K, בדיקת תקינות ב( שלב אופציונאלי: denaturing חלוקה agarose ג'ל) ועמוס בכפול. מחצית אחת של ג'ל הייתה מחקה על קרום ניטראלי וכימי צולבים על ידי EDC; המחצית השנייה הועברה על מסנן ניילון במטען חיובי, אז UV צולב (1.2 x 10 5...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות ההערכה של המתוחכם משתרג דרכו RNA מסדיר נוירוגנזה שלנו עולה בהתמדה, ההשלכות מכניסטית של circuitries מבוסס RNA המשפיע על ביולוגיה של תאי גזע עצבי, הבחנה עצבית / אינטגרציה פונקציונלית, פיתוח של פתולוגיות וסוגי הסרטן עצביים להישאר שלא נחקרו. התחזוקה של רשתות כגון דרך הממלכות עושה את הפוטנציאל של מערכות גנטיות כתסיסנית סייעה לפענח מסלולים סלולריים שלא נחקרו, שבו RNAs noncoding הקצר וגורמי שעתוק נחשבים שחקנים מולקולריים גדולים. בתצוגה זו, הפרופיל של רמות ביטוי RNA הקטנות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la המשוכלל והנדיר Médicale, המרכז הלאומי דה לה המשוכלל והנדיר Scientifique, האוניברסיטה לדה שטרסבורג, Hôpital דה שטרסבורג, האגודה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, המכון הלאומי du הסרטן, סוכנות הידיעות Nationale de la המשוכלל והנדיר ואלזס האזור.

פייטרו Laneve כבר נתמך על ידי Fondation לשפוך la המשוכלל והנדיר Médicale. נכון לעכשיו, הוא מקבל מלגת Istituto Italiano Tecnologia (IIT). עלויות פרסום נתמכות על ידי רשת Neurex (TriNeuron - תכנית Interreg IV העליון הריין)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הרכב סופי/שםקטלוג החברה (מלאי)הערות<
, 5418Eppendorf5418 000.017
Decontaminant, RNase AwaySigma-Aldrich83931למרוח על זכוכית/כלי פלסטיק, לנגב ולשטוף
מעכב RNase, DEPCSigma-AldrichD5758מסוכן //// 1609-47-8
מיקרוסקופ סטריאו להכנת דגימה, M60Leica 
1X מאגר
137 מ"מ NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
2.7 מ"מ KClסיגמא-אולדריץ'P95417447-40-7 
10 מ"מ Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1.8 מ"מ KH2PO4Sigma-AldrichP97917778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-VIS ספקטרופוטומטרThermo ScientificNanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+Biorad170-8265
אלקטרופורזיות אופקיות, Mini-Sub Cell GTBioRad170-4487EDU
מגיב מיצוי RNA, TRIzol ReagentLife Technologies15596026מסוכן
PCA (25:24:1), 1:1 למיצויSigma-Aldrich77617136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 למיצויSigma-AldrichC243267-66-3   
EtOH, 2.5 כרך למשקעים, 70% לשטיפתסיגמא-אולדריץ'5984464-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNALadder Thermo ScientificSM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x תמיסת
2% נתרן דודציל סולפט (SDS)Sigma-Aldrich71736לעולם אל תקרר SDS כדי למנוע  משקעים //// 151-21-3
2 מ"ג/מ"ל Proteinase KRoche Applied Science0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4Sigma-AldrichT59411185-53-1   
100 מ"מ NaClסיגמא-אולדריץ'S30147647-14-5   
30 מ"מ MgCl2Sigma-AldrichM82667786-30-3
דנטורינג אגרוז ג'ל
1.2% אגרוזסיגמא-אולדריץ'A9539תן לג'ל להתמצק למשך שעה לפחות //// 9012-36-2
10X MOPS Buffer
0.2M מלח נתרן MOPS, pH 7Sigma-AldrichM9381אל תבלבלו מלח נתרן MOPS עם MOPS //// 71119-22-7
טעינת אגרוז
1x MOPS מאגר
3% פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'F8775מסוכן //// 50-00-0
50% פורממידסיגמא-אולדריץ'47670מסוכן //// 75-12-7
אתידיום ברומיד (EtBr) 30 μ גרם/מ"לסיגמא-אולדריץ'E1510מסוכן //// 1239-45-8
ברומופנול כחול סיגמא-אולדריץ'B0126115-39-9 
פיצול RNA
קטן טיפים לטעינת ג'ל שטוח LifeTechnologiesLC1002
Savant SpeedVac רכזThermo Scientific DNA120
אלקטרופורזה אנכית, תא טטרה Mini-PROTEAN Biorad165-8000
ג'ל
10% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (19:1)Sigma-AldrichA3449מסוכן. תן לג'ל להתפלמר במשך 45 דקות לפני השימוש
1x TBE Buffer (או 1x MOPS Buffer)
7 M אוריאהSigma-AldrichU650457-13-6
0.1% אמוניום פרסולפטSigma-Aldrich2155897727-54-0 
0.1% TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
Gene Ruler סולם DNA בטווח נמוך במיוחד (10 bp-step)Thermo ScientificSM1211Label 0.1 μ g, כמתואר בתגובת "תיוג הבדיקה"
Acrylamide Blue Dye 
50% פורממידסיגמא-אולדריץ'47670מסוכן //// 75-12-7
ברומופנול כחולסיגמא-אולדריץ'B0126115-39-9 
מאגר ריצה (RB)
1x מאגר MOPS 
חלופה RB: 1x מאגר
1x מאגר
5X TBE
445 מ"מ Tris-baseSigma-AldrichT150377-86-1 
445 מ"מ חומצה בוריתסיגמא-אולדריץ'B790110043-35-3
20 מ"מ EDTAסיגמא-אולדריץ'EDS60-00-4   
צביעת ג'ל
אתידיום ברומיד 0.5 μ g/mlSigma-AldrichE1510מסוכן //// 1239-45-8
1x כתם RBלמשך 15 דקות עם EtBr, נמנע למשך 15 דקות w/o EtBr
BLOTTING
3MM נייר WhatmanSigma-AldrichZ270849
קרום ניילון ניטרלי, Hybond NXGE Healthcare Life ScienceRPN203TPhotosensitive
CROSSLINKING
תמיסת קישור צולבת (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v)Sigma-Aldrich336092הכינו תמיד מנה טרייה של XLS //// 616-47-7
12.5 mM HClSigma-AldrichH1758מסוכן //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v)Sigma-Aldrich345025952-53-8   
(PRE)-HYBRIDIZATION
מונה נצנוץ נוזלי BeckmannLS 6500
זרע סלמון גזוז, 0.1 מ"ג/מ"ל Life TechnologiesAM9680
rasi4 בדיקה5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA
בדיקה אנטי-חושית5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
אנטי-חושית5'-TTAATGAGTGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
אנטי-חושית5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'ערכת
טיהור, Illustra MicroSpin G-25 עמודותGE Healthcare Life Science27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
0.5% SDSSigma-Aldrich71736151-21-3 
5x הפתרון
20X SSPE
3.6 M NaClSigma-AldrichS30147647-14-5   
0.2 M נתרן פוספטסיגמא-אולדריץ'3424837601-54-9   
20 מ"מ EDTA (pH 8.0)Sigma-AldrichEDS  60-00-4   
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v)Sigma-AldrichF263726873-85-8
1% PolyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichPVP409003-39-8
1% BSASigma-AldrichA79069048-46-8   
1X TEN Buffer
10 מ"מ Tris-Cl (pH 8.0)Sigma-AldrichT150377-86-1 
100 מ"מ NaClסיגמא-אולדריץ'S30147647-14-5   
1 מ"מ EDTA (pH 8.0)Sigma-AldrichEDS60-00-4   
תיוג
0.4 μ M אוליגונוקלאוטיד
1.5 μ l Ci/μ l [γ-32P] ATPPerkin ElmerNEG002Aמסוכן //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase BufferBiolabsB0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 יחידות/μ lBiolabsM0201EC 2.7.1.78
כביסה
גלאי גייגר מולרקנברה תעשיותMCB2/CPS –
EM77021 מאגר כביסה (WB), 2x SSPE
מאגרי
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
זיהוי אותות
מערכת PharosFX Plus Biorad170-9460
תמונה Jכמות זמינה
סרטי רנטגן
אחד
מפתח רגיש לאור לסרטי רנטגןSigma-AldrichP7042
Fixer לסרטי רנטגןSigma-AldrichP7167
הפשטה
תמיסת
10 מ"מ Tris-HCl pH 8.8סיגמא-אולדריץ'T150377-86-1 
5 מ"מ EDTAסיגמא-אולדריץ'EDS60-00-4   
0.1% SDSSigma-Aldrich71736הוסף SDS לאחר הרתיחה כדי למנוע קצף //// 151-21-3
TD colspan="4">צנטריפוגה לדרישות כלליותPBSRSBצבע אקרילאמידTBETBEתמיסת אנטי-חושית בדיקה בדיקה של דנהרדטבדיקהכביסה מחמיריםבחינם Biorad, BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 הפשטה

מקורות

  1. The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43(2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175(2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98(2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 2nd, Academic Press, Inc. (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60(2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641(2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

גילוי RNAאלקטרופורזה של ג'ל אקרילאמידמיצוי RNAהיברידיזציה של גשושיתגילוי באוטורדיוגרפיהבידוד RNAהעברה מג'ל
Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.