מאמר שיטה

Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

DOI:

10.3791/51824

⸱

5 בספטמבר 2014

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע מורפולוגיה פוליפ ומבנה רקמה בannularis Montastraea אלמוגי האיים הקריביים ומ ' faveolata. הקרינה, פנים בלוק סדרתי, ומיקרוסקופ סריקת לייזר confocal שני פוטונים זיהו מבנה lobate, קירות פוליפ, וchromatophore מוערך וצפיפויות zooxanthellae והפצות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חבילה משולבת של טכניקות הדמיה יושמה כדי לקבוע את המורפולוגיה תלת ממדים (3D) ומבנה תאי של רקמות פוליפ המרכיב את annularis Montastraea אלמוגי בניין שונית קריביים ומ ' faveolata. גישות אלה כוללות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM), פנים בלוק סידורי הדמיה (SBFI), ושני הפוטונים במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה (TPLSM). SBFI מספק הדמיה רקמות עמוקה לאחר חתך פיזי; זה מפרט את מרקם רקמת פני השטח והדמיית 3D למעמקי רקמות של יותר מ 2 מ"מ. תמונות FM המשלים ותשואת TPLSM רזולוציה גבוהה במיוחד של מבנה תאי של רקמה. תוצאות: (1) זיהו מורפולוגיות רקמת lobate לא פורסם בעבר על הקיר החיצוני של פוליפים אלמוגים בודדים ו( 2) יצר את מפות השטח הראשונות של צפיפות הפצת 3D ורקמות של chromatophores וendosymbionts zooxanthellae dinoflagellate כמו אצות. אפונה קליטת ספקטרליks של 500 ננומטר ו675 ננומטר, בהתאמה, מצביע על כך שמ ' annularis ומ ' faveolata מכיל סוגים דומים של כלורופיל וchromatophores. עם זאת, מ ' annularis ומ ' faveolata להציג הבדלים משמעותיים בצפיפות הרקמה והפצת 3D של מרכיבים התאיים מפתח אלה. מחקר זה מתמקד בשיטות הדמיה מצביע על כך שSBFI הוא מאוד שימושי עבור ניתוח של דגימות מ"מ בקנה מידה גדולות של רקמות אלמוגי decalcified. FM טיפוח וTPLSM לחשוף עדינים שינויים בקנה מידה submillimeter בהפצה וצפיפות תאיות בדגימות רקמת אלמוגי nondecalcified. טכניקת TPLSM מקנה: (1) הכנה פולשנית מדגם, (2) יכולת חתך אופטית מעולה, ו (3) קליטת אור מינימאלית ופיזור, בזמן שעדיין מאפשר הדמיה רקמות עמוקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התחממות כדור הארץ ושינוי סביבתי נלווה באופן ישיר משפיעים על הבריאות והפצה של אלמוגים ימיים הטרופיים 1-4. השפעות מרובות נתונים למעקב, כולל הלבנת אלמוגים ואת הופעתה של מחלות זיהומיות 5-6. עם זאת, חיזוי מדויק יותר של תגובת אלמוגים בעתיד לאיומים הסביבתיים האלה ידרוש מ" קו בסיס "היסטולוגית יוקם, המגדיר את מורפולוגיה רקמות והרכב תא והפצה לאלמוגים" בריאים לכאורה ". בתורו, "השפיע" אלמוגים אז יכולים להיות בהשוואה כמותית. יתר על כן, נקודת התחלה זו יש לקבוע לאלמוגים בריאים לכאורה תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים, כך ש" תגובה בריאה "יכולה להיות גם תעיד על פני מילויים סביבתיים. כצעד ראשון להקמת קו בסיס זה, מחקר 3D ברזולוציה גבוהה כבר התחייב לאופן שככל הנראה רקמת פוליפ אלמוגים בריאיםמורפולוגיה והרכב סלולארי מגיבים לעליות בעומק מים (WD) וירידות המלוות בקרינת אור שמש. תוצאות לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להקים הבנת מכניסטית מקיפה יותר של הסתגלות אלמוגים, כמו גם כדי לקבל תובנה האבולוציה אלמוגים-הסימביונט והשיפור של קצירת אור.

אלמוגי אבן (Scleractinia) הם בעלי חיים חסרי חוליות ימיות קולוניאליים שישחקו לארח מכלול מורכב של מיקרואורגניזמים אחרים, המכונה באופן קולקטיבי האלמוגים holobiont 7-10. המחקר שנעשה במחקר הנוכחי מבקש להשתמש חבילה של טכנולוגיות הדמיה החדשנית כדי לעקוב אחר שינויים בו זמנית עם עומק הגדלת מים בפיגמנטים הרקמה וzooxanthellae הסימביוטי של אלמוגי מארח בריאים לכאורה. זה יקימו "קו הבסיס" תא רקמה השוואתית הנדרש על פני שיפוע מדידת עומק לאלמוגים בריאים לכאורה ולפעול כמדדים של חימום אלמוגיםLTH 10. פיגמנטים אלמוגים, chromatophores נקרא, לפעול לקליטה, משקפים, פיזור, לשבור, diffract, או להתערב בדרך אחרת עם קרינת שמש תקרית 11. יחסי endosymbiotic zooxanthellae-chromatophore אפשרו האבולוציה המשותפת של אופטימיזציה אור קציר יתרון אסטרטגי ואסטרטגיות צמיחת שלד, כמו גם גמישות טרופית (אסטרטגיות ציד הסטה קדימה ואחורה מautotrophy לheterotrophy) לבעלי חי האלמוגים 12.

האומה דרום האיים הקריביים האי קוראסאו (לשעבר חלק מהאנטילים ההולנדיים) שוכנת כ 65 קילומטר צפוני ונצואלה בתוך ממזרח למערב במגמת ארכיפלג (איור 1 א) ארובה-La Blanquilla. החוף הדרומי הארוך 70 קילומטר קוראסאו מכיל מערכת שונית אלמוגים רצופה מודרנית והמיוקן-הפליוקן-הפלייסטוקן-ההולוקן fringing העתיק 13,14. אומר SST השנתי על קוראסאו משתנה כ 3 ° Cnually, הנע בין מינימום של 26 מעלות צלזיוס בסוף ינואר למקסימום של 29 ° C בתחילת ספטמבר, עם טמפרטורה שנתית ממוצעת של 27.5 ± 0.5 ºC (NOAA SST נתונים סטים, 2000-2010). שונית האלמוגים בPlaya Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), שוכבת ליד הקצה הצפון מערבי של קוראסאו (איור 1 א), נבחרה לדגימה כי זה כבר בעבר גם נלמד ו המערכת האקולוגית ימית במיקום זה היא טובל במי ים 7,15-19 nonpolluted טריים. . שני מינים קרובים scleractinian אלמוגים, annularis מ 'וM faveolata, נבחרו לניסויים וניתוח במחקר זה, כי כל מין: (1) חלוקת מדידת עומק מוצגים שונה וnonoverlapping מובהקות על מערכת השונית ביחס להפסקה והמדף סביבות הצטברות משקע פחמה קשורות (טווח annularis מ = 0-10 מ 'WD; faveolata מ'טווח = 10-20 מ 'WD 20; 1B דמויות, 2A, 2B ו); (2) הוא בונה מסגרת שונית אלמוגים נפוצים בכל הים הקריבי 21; ו (3) חקר היטב אקולוגי, פיסיולוגי, ויחסים האבולוציוניים 22.

דגימת שדה למחקר הנוכחי נערכה תוך שימוש בטכניקות צלילה סטנדרטית מהחוף של Playa Kalki בקוראסאו. חתך מדידת עומק מים רדוד לעמוק נקבע כי חצו בריצה את המדף, על הפסקת המדף, ולתוך סביבות שונית קדמי מים עמוקות. כנראה ראשי אלמוגים בריאים לאחר מכן זיהו לדגימה לאורך חתך מדידת עומק זה, ובכלל זה: (1) שלוש בודד ~ 1 מ 'ראשי אלמוגים בקוטר של מ' annularis, שכולן היו בשעה 5 מ 'עומק מים (WD); ו (2) שלושה בודדים ~ 1 מ 'ראשי אלמוגים בקוטר של מ' faveolata, שכולן היו ב12 מ WD. קרינה פעילה Photosynthetically (PAR) נמדדה כ33-36% P AR ב 5 מ 'WD וPAR% 18-22 ב10 מ WD. דגימה התבצעה בחודש ינואר כאשר SST היה 26 ° C במעמקי המים של שני מ '5 מ' ו12. כל אחד מששת ראשי האלמוגים אלה ידגם בשלושה עותקים בעמדות מרחבי מקבילים (כלומר., 45 כ ° קו רוחב N בכל אחד מששת ראשי האלמוגים חצי כדור). כל דגימה בודדת מורכבת מביופסית 2.5 סנטימטר קוטר אלמוגי רקמות שלד ליבה שנאסף עם אגרוף קשת ניקה. שלוש ביופסיות רקמות שלד אלמוגי נדגמו בצלילה רגילה עם ידיים בכפפות מכל אחד מראשי האלמוגים (9 מ 'מannularis מושבות ב5 מ WD ו -9 ממ faveolata ב12 מ WD). מייד עם אוסף בעומק, כל דגימת ליבת הביופסיה הוצבה בצינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל סטרילי, בורג העליון אטום, וחזר אל פני השטח. מי הים היה יצק מכל צינור צנטריפוגות וכל ביופסיה ליבה הייתה שקוע אז, מאוחסנת, ומועברת בparaformaldehyde 4%.

"Jove_content"> ההדמיה SBFI כבר בעבר בוצע על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כוללים מוח כולו ורקמות אנושיות כולו לב, עוברי עכבר ללא פגע, עוברי דגי זברה, וסוגים רבים של דגימות של בעלי חיים עם עצמות שלמות 23-30. רוב המחקרים הללו מנוצלים אופטי מיקרוסקופ אור / עם או הקרינה או טכניקות שדה בהירות. עם זאת, מחקרים שנערכו בהגדלה גבוהה במיוחד תוך שימוש באלקטרונים סורק בלוק סדרתי פנים הדמיה ביום 31 בעבר. במחקר הנוכחי, פרוטוקול SBFI שונה פותח ולמוחל על אלמוגים בפעם הראשונה. כי מ ' annularis ומ ' פוליפים אלמוגי faveolata הם 1-2 מ"מ עובי, אף אחד משיטות מיקרוסקופיה אור השגרה יהיה מסוגל לחדור את כל העובי של רקמת פוליפ האלמוגים. לכן, יש לנו פרוטוקול הכנת מדגם SBFI שתוכנן במיוחד עבור דגימות אלמוגים. בנוסף, יש לנו מנהג שנועד בעל סטראו, אשר ממונע לנוע בשני כיווני x ו y. מנגנון זה לוקח תמונות של הפנים הבלוק של המדגם ולא איסוף החלקים באמצעות microtome רגיל מול מיקרוסקופ. אנחנו גם הצגנו טכניקה נוספת אופטית קוי שני פוטונים מיקרוסקופיות לתמונה אותה הפוליפים אלמוגים בכל העובי של רקמות האלמוגים. זה מתגבר על המגבלות שהוטלו על ידי SBFI במונחים של decalcification ואפשרות לשינויים במורפולוגיה רקמות ונפח (התכווצות) שעלול להיגרם על ידי הכנת מדגם (התייבשות) ופרוטוקולי עיבוד. יתר על כן, פרופילי הפליטה מהאלמוגים היו ספקטרלי החליטו לזהות את פליטת השיא והווריאציות שלהם בין chromatophores וzooxanthellae הפוטוסינתזה. תוצאות אלו הוערכו בהקשר של השיטה והיתרונות האישיים שלהם בנוגע לזמן רכישה, זמן ניתוח, ואת היכולת לפתור פרטים מבניים בסדר מבלי להתפשר על strשלמות uctural של רקמת האלמוגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ריאגנטים להיות מוכנים לבלוק סידורי פנים הדמיה של דוגמאות אלמוג

.1 Preinfiltration שעווה

  1. ממסים 3.6 גרם של פתיתי שעוות בכוס זכוכית. מערבבים היטב על צלחת חמה (60-70 ° C).
  2. הוספת 400 מ"ג של סודאן IV (כדי למזער את הקרינה רקע שעווה). מערבבים היטב ולהמתין עד לפתרון שקוף אדום מושגת.
  3. הוספת פרפין 96 מ"ל החם המותך (100%) ומערבבים היטב.

1.2) הטבעת שעווה

  1. ממסים 7.2 גרם של פתיתי שעוות בכוס זכוכית ומערבבים היטב על צלחת חמה (60-70 ° C).
  2. הוספת 0.8 גרם של סודאן IV. מערבבים היטב ולהמתין עד לפתרון שקוף אדום מושגת.
  3. הוספת גרגירי פרפין (162 ז) ומערבבים עד שנמס לחלוטין פרפין.
  4. הוסף 30 גרם של Vybar גרגרים הלבן ולהמס לחלוטין באותה הכוס; פעם אחת נמס, לערבב.
  5. באופן רופף לסגור את בקבוק הזכוכית עם מכסה. מניחים את בקבוק הזכוכית בov הסעת C ° 60en לשמור את החומרים במצב צבירה נוזלי. לבצע את כל החדירות בתנור זה.
  6. לפצל את הנפח הכולל של השעווה האדומה 200 מ"ל בשני בקבוקי זכוכית של 100 מ"ל כל אחד. השתמש aliquot אחד לחדירה והשנייה להטבעה סופית.

1.3) רקמות אלמוגים הטבעה לסידורית בלוק פנים הדמיה

  1. שטוף את הפוליפים אלמוגים שנאספו בשטח (SI וידאו 1) ומאוחסנים (3-6 חודשים ב4-5 C ° בparaformaldehyde) שבנאגר מלוח פוספט (3x 5 דקות) וdecalcify כאשר מוכן להיות צילם. Decalcify הפוליפים בפתרון ExCal ל24 שעות או עד שהפוליפים הם לגמרי נטולי CaCO 3. דגירה כמה פוליפים אלמוגי decalcified כגוש אחד בסדרת אתנול 25, 50, 75, ו100%, ואחריו 1x תחליף קסילן לייבש את הדגימות.
  2. הנח את הפוליפים מעובד בתנור שחומם מראש C ° 65 מכיל 100% תחליף קסילן. דגירה של 30 דקות פעמיים על ידי צ'אנגיng לפתרון טרי. כוון את הפוליפים בצורה כזאת, שהחלק העליון של הפוליפים יפנה כלפי מטה ופני השטח העליונים הוא שטוח ככל האפשר.
  3. הפוך את הפתרונות של 2: 1, 1: 1, ו1: 2 קסילן תחליף ושעוות preinfiltration (שלב 1.1) ב50 צינורות מ"ל פלקון.
  4. דגירה פוליפים אלמוגים עם שלושת ריכוזים אלה הולכים וגדל של שעוות preinfiltration, ואחריו 3x דגירה ב100% שעוות preinfiltration ל30-60 דקות בכל פעם.
  5. הערה: בהתאם לעובי של הדגימות, צעדים 1.3.1-1.3.5 יכולים להיות מוגברים עם תקופות זמן ארוכות יותר.
  6. הזז את הדגימות להטבעת שעווה (ראה שלב 1.2.6) לאחר הדגירה 3x ב100% שעוות preinfiltration.
  7. הסר את שעוות ההטבעה לאחר 30 דקות. החלף עם שעוות הטבעה טריות ולהמשיך דגירה למינימום של 4 שעות על 65 מעלות צלזיוס.

1.4) Embedding באדום שעווה

  1. לצלם את הבלוק (מגש הנירוסטה שבו השעווה הלבנה ממוקמת ועל גבי אשר סםple ממוקם). זה נחוץ משום מוטבע פעם אחת בשעווה, את מיקומו של המדגם יהיה בלתי נראה כמו השעווה האדומה ההטבעה היא אטומה.
  2. הנח טיפות קטנות של שעוות נקודת התכה גבוהה סביב העובש שחומם מראש החדש הנירוסטה ההטבעה ולאפשר לו להתקרר. יוצקים נפח קטן של טרי נמסה שעוות הטבעה מיכל שני כאמור בצעד 1.2.6.
  3. מקם את פוליפ האלמוגים פונה כלפי מטה במהירות על נקודת השעווה הלבנה, ואז למקם את בעל מדגם פלסטיק על מגש הנירוסטה ושופך שעוות הטבעה יותר, כך שהשעווה עולה אל פני השטח של תבנית הפלסטיק.
  4. קח את כל ההתקנה מתוך 65 ° C תנור ולאפשר לו להתקרר על ספסל או משטח קריר עד השעווה מתקשה לחלוטין.
  5. פעולה זו עשויה להימשך 6 שעות עד יום או ימים. מניחים את הגוש המיובש במקרר ב 4 מעלות צלזיוס, המוגן מפני אור, לאחסון לטווח ארוך.

1.5) חתך בהגדרת בלוק הפנים הסידורי

  1. Trim לחסום ולחתוך סעיפי 1 מיקרומטר באמצעות microtome. אל תאספו את החלקים כפי שהם תהיו כמו אבקה. זכור, אנחנו הדמיה רק ​​הפנים הבלוק. המדגם מופיע כאשר השעווה הלבנה מתחילה להיעלם.
  2. צלם תמונות של הפנים בלוק החלקים המכיל את המדגם בכל פעם שסעיף יוסר. המשך עד שפוליפ האלמוגים נעלם כמו בSI וידאו 2.
  3. רשומות / ללכוד את התמונות עם מצלמה בצבע אחד באמצעות מסנן ניאון FITC להרים אוטומטי הקרינה של chromatophores / פוליפ האלמוגים. תמונת 3-4 ליבות decalcified מכל מין.

2 אלמוגי הדמיה תחת שני הפוטונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. תקן את ליבות פוליפ אלמוגים, כל אחד המכיל סביב 10-12 פוליפים על סנטימטר בקוטר, בparaformaldehyde 4% באתר של אוסף (חוף ים) ברגע שהם נקצרים מתחת למים.
  2. שמור דגימות על 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. ליבות שטפו ממוקמות בהאותו פתרון דואר במהופך בצלחת תחתית מכסה זכוכית (0.17 מ"מ עובי).
  3. שימוש בליזר שני פוטונים ב780 עירור ננומטר, תמונת 3-4 פוליפים בשתי הגדלה שונה (זום דיגיטלי) באמצעות מטרת 10X (0.3 NA). צורת פוליפ האלמוגים והגובה משתנים בין דגימות (בדרך כלל 1-2 מ"מ) ועומק ההדמיה גם הוא מוגבלת על ידי מרחק העבודה של מטרת ההדמיה.
  4. השתמש במצב סריקת האריח לאסוף כ 25-100 (5 X 5 או 10 x 10 אריחים) תמונות למישור מוקד בXY ו50-100 תמונות דרך ציר z במרווח 10 או 20 מיקרומטר, בהיקף של סביב 5,000-10,000 תמונות / פוליפ אלמוגים.
  5. תמונה תלת לארבעה תחומי פוליפ לייצג מיני ליבה ואלמוגים. הערה: זמן רכישת תמונה משתנה בין האזור / פוליפ 2-5 שעות.
  6. אחסן את כל התמונות בפורמט נתונים גולמיים בדיסק הקשיח של המערכת כLSM .5 לדקלם 3D בניתוח תמונת 3D ותוכנת עיבוד.

Rendering נפח 3 3D וVisualization של SBFI ושני פוטונים ספקטרלי הקרינה נתונים

  1. חתוך את נתוני 2D כדי להקטין את גודל הקובץ על ידי ההתמקדות בפוליפ בודד באמצעות כלי חיתוך מרובעים בתכנית ולעבד כקובץ TIFF יחיד (להקטין את גודל הקובץ גם על ידי שמירת הקובץ בפורמט 8 סיביות) בתוכנת הרכישה.
  2. פתח את הקבצים שנאספו מנתוני SBFI (שנאספו בשלב 1.5.1) או z-ערימות מרובות רעפים סעיפים שני פוטונים אופטיים (שנאספו בשלב 2.1.4) בתכנית Imaris לעלות מודול תחת אלגוריתם נפח.
  3. פרויקט נתונים SBFI שניתנו ב3D באמצעות הקרנת צל. צור מצב שבו isosurface voxels הם thresholded כדי ליצור דפוס משטח מוצק (SI וידאו 3).
  4. דמיינו את תחזיות 3D באמצעות אלגוריתם מטוס גזיר בxy, xz, ומצבים מאונך YZ לחשוף מבנה 3D ובצורה של אלמוגים.
  5. הנפיש את התחזיות באמצעות מודול אנימציה מסגרת מפתח באותה תכנית Imaris (SI ViDeos 3-7).
  6. ליצור קבצי וידאו ב5 דחיסת% וליצור סרט וידאו בפורמט AVI באמצעות נפח (וידאו SI 4 ו -6), שיטות 3D וIsosurface (וידאו SI 5 ו -7).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מנגנון מותאם אישית שנועד SBFI (מיוצר במיוחד עבור המחקר הנוכחי; איור 3) המיוצר על המפות מפורטות הראשונות 3D הדיגיטליות הגובה (Dems) של המרקם החיצוני פני השטח והמורפולוגיה של מ ' annularis ומ ' פוליפים faveolature אלמוגים (איור 4 ווידאו SI 1-2). זה הניב תמונות של לא תוארו בעבר אונות מוערמות של רקמת אלמוגים מעגליות מקרינה כלפי חוץ ממרכזו של כל (4B דמויות, 4D, ו4E) פוליפ. אונות אלו נערמות לאורך הרכס העליון של septa ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר שונית אלמוגים הוא מאמץ מחקר בינתחומי מאוד, הכולל ניתוח של פיזי, כימי בו זמנית, ותופעות ביולוגיות הפועלים בסביבה הימית. המחקר של מערכות אקולוגיות שונית אלמוגים מורכבות לכן הטוב ביותר יושלם בתוך מעצמות של עשרה 'מסגרת ההקשרים (איור 10). אוסף גרפי זו ממחיש כי המערכת האקולוגית האלמוגים מכסה מגוון רחב של ממדים מרחביים (10 -9 ל10 5 מ '). יתר על כן, התרגיל הזה ממחיש שgeobiological מנתח באורך קנה מידת ביניים של 1 סנטימטר מ"מ-1 הוא הג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לדונה אפס, היסטולוגית במכון לביולוגיה גנומית, אוניברסיטת אילינוי אורבנה-שמפיין (UIUC), על הסיוע הטכני המוכשר שלה בהכנת דגימות וחתך. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר ל-B.W. Fouke מהמשרד למחקר ימי (N00014-00-1-0609). בנוסף, C.A.H. מילר קיבל מענקים ממלגת Wanless של המחלקה לגיאולוגיה של UIUC, קרן לייטון של המחלקה לגיאולוגיה של UIUC וקרן עבודת השדה של המחלקה לגיאולוגיה של UIUC רוסקו ג'קסון. הפרשנויות המוצגות בכתב יד זה הן של המחברים ואינן מייצגות בהכרח את אלה של המוסדות המעניקים. אנו גם מודים למעבדת המחקר והניהול של המגוון הביולוגי בקריביים (Carmabi) בקוראסאו על תמיכתם ושיתוף הפעולה שלהם באיסוף דגימות הביופסיה של רקמת האלמוגים. אנו מודים לקלאודיה לוץ, מומחית לתקשורת מדיה ב-IGB על תיקון השפה המוצלח שלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רקמת אלמוגים2.5 ס"מ ביופסיה מבית גידול טבעי
מכשיר ליבה של אגרוף קשתC.S. אוסבורן וחברהמס' 149לאיסוף ביופסיית אלמוגים
ParaformaldehydeElectron Microscopy SciencesRT 1570016% היסטוקלר מדולל מראש
/ Safeclear IIמדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתRT 64111-04חלופה לא רעילה לקסילן, התייבשות ודפרפיניזציה
קסילן ואתנולהתייבשותמדעית
שעוות פרפיןריצ'רד אלן מדעיסוג H REF 8338תמיסת הסתננות
Vybarמרכיב יצרןשל שעווה אדומה
סטאריןמרכיב יצרןשל שעווה אדומה
סודן IVפישר כימיקלS667-25שעווה אדומה-רקע אטום
נבט חיטה אגלוטינין (WGA)Life TechnologiesW32466לתיוג  ריר אלמוגים
להאריך את חיי הזהבטכנולוגיותP36095מדיה הרכבה נגד דהייה
פלואורו צלחתעולם דיוק מכשיריםFD-35-100להדמיה דו-פוטונית
XY מנוע, נהג ובקרלין הנדסה211-13-01R0, R325, R256-ROXY תנועה תרגומית
פלטה חמהקורנינגDC-220המסת כל שעווה
תנור הסעהYamatoDX-600חדירה והטמעה
מעבד רקמותLeicaASP 300התייבשות, הסתננות
מיקרוטוםLeicaRM2055סכינים חד פעמיות
מיקרוסקופ סטריאוקארל זייססטריאולומר V 121.5x (30 מ"מ WD)
מיקרוסקופ פלואורסצנטי אובייקטיבי עם ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, ApoTome I SystemImaging קטע דק של פוליפ: מצלמת Zooxanthellae
AxiocamCarl ZeissMRmמצלמה מונוכרום 1388x1040 פיקסלים
תוכנת Axiovision CarlZeiss גרסה 4.8תוכנית רכישת תמונה
ספקטרפיזיקהלייזר דו-פוטוניMaitai eHP, לייזר פועם (70 fs)עם מודול DeepSee
מיקרוסקופ סריקת לייזרCarl ZeissLSM 710 עם גלאי ספקטרלי34 ערוצים זיהוי PMT
Zen SoftwareCarl Zeiss2010 ומעלהלרכישת תמונות דו-פוטוניות וספקטרליות
Imaris Suite SoftwareBitplane, Inc.,גרסה 7.0 ומעלהנפח תלת מימד, עיבוד משטחי איזו, הדמיה
שלד פישר הנרות הנרות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535(2013).
  2. Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
  3. Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
  4. Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
  5. Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
  6. Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
  7. Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
  8. Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
  9. Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
  10. Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
  11. Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3(2006).
  12. Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
  13. Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
  14. Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
  15. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
  16. Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
  17. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
  18. Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
  19. Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
  20. van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
  21. Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
  22. Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
  23. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591(2012).
  24. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
  25. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575(2012).
  26. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
  27. Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
  28. Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
  29. Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
  30. Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
  31. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  32. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
  33. Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
  34. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Coral Polyp ImagingSerial Block Face ImagingTwo Photon MicroscopyFluorescence MicroscopyTissue Morphology AnalysisChromatophore DistributionZooxanthellae LocalizationDecalcified Coral TissueWax Embedding TechniqueMicrotome Sectioning

מאמרים קשורים