השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

סיכום

עכברים שימשו כמודל לחקר צורות רבות של השתלה, כולל השתלת קרנית. אנו מתארים בדוח זה מודל עכברי להשתלת קרנית חריפה ומאוחרת כאחד.

תקציר

השתלת קרנית היא הצורה הנפוצה ביותר של השתלת איברים בארצות הברית עם בין 45,000 ל-55,000 הליכים המבוצעים מדי שנה. בעוד שקיימים מספר מודלים של בעלי חיים להליך זה ועכברים הם המין הנפוץ ביותר. הסיבות לשימוש בעכברים הן העלות היחסית של השימוש במין זה, קיומם של זנים מוגדרים גנטית רבים המאפשרים חקר תגובות חיסוניות, וקיומו של מערך נרחב של ריאגנטים שניתן להשתמש בהם כדי להגדיר עוד יותר תגובות במין זה. מודל זה שימש להגדרת גורמים בקרנית האחראים למצב הפריבילגיה החיסונית היחסית של רקמה זו המאפשרת להשתלות קרנית לשרוד דחייה חריפה בהיעדר טיפול מדכא חיסוני. הוא שימש גם להגדרת הגורמים החשובים ביותר בדחיית השתלות אלוגרפים כאלה. כתוצאה מכך, הרבה ממה שאנו יודעים על מנגנונים של קבלה ודחייה של השתלת קרנית נובע ממחקרים המשתמשים במודל עכברי של השתלת קרנית. בנוסף לתיאור מודל לדחיית השתלת קרנית חריפה, אנו מציגים לראשונה גם מודל של דחיית אלוגרפט קרנית מאוחרת.

מבוא

השתלת קרנית היא אחד מהסוגים המוצלחים והנפוצים ביותר של השתלה שבוצעו בבני אדם. הסיבות לכך שניתוח זה מבוצע הן תוצאה של פציעה, מחלה זיהומית ^1, או צורות אחרות של מחלה בקרנית שאינה מדבקת ^2. דמויות מעין הבנק האגודה של אמריקה עולות כי מעל 46,000 בוצעו בשנת 2011 (ראה באתר אינטרנט בכתובת: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). אינדיקציה להצלחתו היא ששיעורי כישלון שנה אחת עבור שתלי קרנית אלוגנאית נעים 10-15% ולאחר 5 שנים של ההצלחה היא בעודף של 70% ^3-8. מחקרים רבים הראו, ההצלחה של allografts קרנית קשורה באופן ישיר לעובדה כי העין היא אתר מועדף אימונולוגית. גורמים אחראים למצב הקרניות כאתר זכות חיסוני כוללים חוסר של שני כלי הדם והלימפה בקרנית, היעדר יחסי של תאי הצגת אנטיגן, גורמים המיוצר על ידי הקרנית שsuppresזה funtions מפעיל חיסוני ^9-15, ביטוי נמוך של MHC אנטיגנים ^16, ואת הביטוי של מקאל ^17-20.

עם זאת, למרות גורמים אלה, גורם שתלים אלה להצלחה, הם עוברים דחייה ^3-7. כתוצאה מכך, הבנת מנגנונים אלה שמתווכים דחייה זו, כמו גם בדיקת טיפולים שונים למניעת דחייה היא בעל חשיבות קריטית. לצורך כך, אנו מתארים כאן מודל עכברי של השתלת קרנית שכבר בשימוש במשך 20 שנים כדי ללמוד השתלת קרנית בסביבה ניסויית מבוקרת. מאז תגובות השתלה כרוכות בגורמים רבים ושונים הפועלים בקונצרט שאולטימטיבי לקבוע אם הרקמה המושתלת נכשלת או מצליחה, שלא ניתן להבין את החשיבות של גורמים אלה בכל דגם במבחנה. כתוצאה מכך, מחקרים שנערך בבעלי חיים שלמים נדרשים כדי לקבוע מה גורמים חשובים להצלחה או או failuמחדש של רקמה מושתלת.

בעוד מינים אחרים של בעלי חיים שימשו במחקר השתלה קרנית, יש במודל העכברי מספר יתרונות בהשוואה לשימוש במינים אחרים. הראשון הוא קיומה של זנים רבים של עכברים המבטאים את גנים מושתלים מסוימים או היו ממוקד-גן לחוסר ביטוי של גורמים חיסוניים ספציפיים שתפקידה בהשתלה ניתן ללמוד טוב יותר. בנוסף, יש חומרים כימיים רבים (שני גורמים רקומביננטי ונוגדנים המנטרלים את הגורמים) שהם ספציפיים לעכברים ושאינם קיימים למינים רבים אחרים של בעלי חיים. בגלל קיומם של גורמים אלה, מודל זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לזהות גורמים רלוונטיים מעורבים בתגובה החריפה של קרנית שתל ^{15, 17,18,20 -29.} יתר על כן, רבים מן הגורמים המעורבים בהשתלת קרנית ידוע גם להיות פונקציונלי בהשתלה של רקמות אחרות.

פרוטוקול

הערה: מטופלים כל בעלי החיים המשמשים בהליך זה בהתאם לאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש בבעלי החיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, כמו גם את ההנחיות שנקבעו על ידי הוועדה לפיקוח על בעלי החיים באוניברסיטת סנט לואיס.
הערה: כל המכשירים ופתרונות כירורגיים הם מעוקרים לפני ניתוח, כדי לצמצם את זיהום חיידקים של העין. יש לציין, כי בעוד שבעלי החיים עושים לחוות קצת כאב מהליך זה, אנחנו לא מעסיקים משככי כאבים. הסיבה לכך היא כי כל משככי הכאבים אנטי דלקתיים ומאז תגובות השתלה הקרנית כרוכות דלקת, השימוש בתרופות אנטי-דלקתיות יפגע ביכולת שלנו כדי לקבוע אילו גורמים מעורבים בכישלון שתל קרני.

1. הרדמה

1. הנח עכברי תורם למקבל בהרדמה כללית על ידי זריקות IP של קטמין (86.98 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (13.04 מ"ג / קילוגרם).
2. שמור את עכבר הנמען בהרדמה לאורך כל ההליך אשר בדרך כלל לוקח 30 דקות לשעה. כתוצאה מכך, כל הזמן לפקח על העכבר עבור כל סימנים של חזרה להכרה.
3. החל המשחה puralube לעין עד שלא תעבור ניתוח אחרי בעל החיים הוא מורדם כדי למנוע יובש.

2. הארכת קרנית

1. קבלתן של קרנית התורם.
   1. ברגע שבעלי החיים הוא בהרדמה מלאה, להשיג mydriasis ההולם מצד ממשל של כמה טיפות עיניים של tropicamide 1% ו -2.5% hydrochloride phenylephrine.
   2. מקם את הראש של החיה התורמת בצורה אופקית על לוח מונח על תמיכת מטלטלין חסון. תקן את הראש עם רצועה של סרט על פני הצוואר, כדי להבטיח כי העין היא במצב אופקי לאורך כל הפעולה.
   3. שימוש במקדחה בקוטר 2 מ"מ, שקצה שלו היה צבוע עם מתיל הכחול, החוצהמרפד את האתר שתל קרנית המרכזית.
   4. בסכין חד, לחדור הקרנית ולהזריק healon ללשכה הקדמית להעמיק אותו כדי להפחית את הסיכוי לניזק לאנדותל התורם והעדשה בסיסית.
   5. בלו שתל התורם במספריים Vannas ומקום לצלחת המכילה תמיסת מלח מאוזנת "הנקס ועד שימוש.
   6. אחרי שתל התורם כבר הוסר, להרדים את העכבר התורם באמצעות CO ₂ שאיפה.
2. הכנת מיטת השוחד.
   1. חזור על אותם השלבים כפי שמתואר ב2.1.1 דרך 2.1.2 לנמען.
   2. שימוש במקדחה בקוטר 1.5 מ"מ, מתאר את אתר שתל נמען.
   3. בסכין חד, לחדור הקרנית ולהזריק healon ללשכה הקדמית להעמיק אותו כדי להפחית את הסיכוי לניזק לעדשה הבסיסית.
   4. הסר את הכפתור קרני המרכזי שהותווה מהנמען באמצעות מספריים Vannas וזורקים.
3. תפירתשתל
   1. הנח את קרנית התורם מעל שתל המיטה בקרנית של הנמען. הקפד שhealon נאות הוא תחת קרנית התורם להגנה על תאי האנדותל תורם מנזק על ידי מגע ישיר עם עדשה.
   2. באמצעות microforceps היטה Super Fine, למקם את הנגיסה הראשונה של 11-0 תפר ניילון לצד התורם, דרך התורם עם עומק 90% מעובי מלא לצד של הנמען, ואז לקשור את.
   3. ברגע שהקרנית מעוגנת במקום, לבצע תפרי midcardinal קטע כזה שיש לו את הקרנית 8 עד 10 תפרים כולל וקרנית התורם היא בשורה בצורה מאובטחת עם ומחוברת למיטת השתל הקרנית הנמען.
4. העמקת הלשכה הקדמית
   1. להעמיק את הלשכה הקדמית על ידי הזרקת HBSS או בועת אוויר ללשכה הקדמית ובעדינות לבדוק את התקינות של השתל קרני לדליפה עם ספוג.
      הערה: אם לא ניתן רפורמה הלשכה הקדמית אז יש הסתברות גבוהה של גataract אשר יהפוך את ההערכות עתידיות של הקרנית המושתלת קשות מאוד וגם להוביל לבעיות בתפקוד תורם קרנית האנדותל וכישלון ובכך שתל.
5. הערכה סופית
   1. שים לב לעין לקבוע כי התלמיד הוא עגול ועומק הלשכה הקדמית הוא נורמלי.
      הערה: אם התלמיד אינו עגול זה עולה כי בתפירת איריס נפגעה וכך השתל נחשב לכישלון טכני.
   2. החל משחה אנטיביוטית לעין. אופציונאלי: סגור את המכסה עין עם תפר 7-0 משי.
   3. שים לב עכברים עד שהם התעוררו לגמרי ולאחר מכן בנפרד לשכן אותם למינימום של שני ימים שלאחר ניתוח.

הסרת 3. תפר

1. במקרים בם תפר מכסה משמש, להרדים עכברים כפי שתואר לעיל ולהסיר את תפר המכסה ב 48 שעות.
2. הרדימי עכברים ביום 7 לאחר הניתוח. הסר את sutures אבטחת השתל קרני. ברגע שהתפרים יוסרו ובעלי החיים התעוררו באופן מלא, להחזיר אותו לכלוב שלה.

4. הערכה קלינית

1. בדוק את העין לאינדיקציות של סיבוכים פרוצדורליים הכוללים, קטרקט (ערפול של העדשות), hyphema (דם בלשכה הקדמית), לשכה קדמית שאינה של העומק הנכון, או אטימות משמעותיות של הקרנית. שקול אלה המדגימים סיבוכים אלה כ" התפשר "ולהרדים אותם משאיפת CO _2.
   1. לבצע את כל הבדיקות על עכברי unanesthetized. החזק את העכבר ביד אחת ובכך מרסן את העכבר, כך ששני יכול proptose עין כדי לאפשר תצפית טובה יותר של העין. ברגע שהתצפיות הושלמו, להחזיר את בעל החיים לכלוב שלה.
2. האם צופה שאינו מכיר את קבוצות הטיפול העריך את השווי מושתל קרניות 2 עד 3 פעמים בשבוע לסימנים של שתל קרניפרקי דחייה או כישלון שתל קרני. להשתמש במיקרוסקופ הניתוחי או biomicroscope מנורת סדק אופקי לתצפיות אלה.
   1. להעריך כל קרנית לאטימות באמצעות סולם של 0 עד 5. קנה המידה מוגדרת באופן הבא:
      1. הקצאת ציון של 0 עד אלה קרניות שאין להם סימנים של אטימות.
      2. הקצאת ציון של 1 לאלה קרניות שמראות אטימות שטחיות מינימליות.
      3. הקצאת ציון של 2 עד קרניות המציגות אטימות קלות ועמוקות יותר, אבל התלמיד ואיריס שהבסיס עדיין ניתן להבחין.
      4. הקצאת ציון של 3 עד קרנית המציגות אטימות סטרומה בי לא ניתן לראות את איריס בפירוט למעט השוליים התלמיד.
      5. הקצאת ציון של 4 לקרנית, המציגות אטימות סטרומה צפופות ואם ניתן לראות אין מבנים שבבסיס.
      6. הקצאת ציון של 5 עד קרנית המציגות אטימות מלאים ובצקת סטרומה אינטנסיבית, עם תלמיד ואיריס טשטש לחלוטין.
   2. גם להעריך כל קרנית למידת חדירה של כלי דם (ניאו-וסקולריזציה) משתמש בסולם דירוג של 1 עד 8. לשם כך, להציג את הקרנית כמורכבת של 4 רביעים שווים ולקבוע את הסכום של כלי דם בכל אחד מרביעים עם ציון שטווח הרצון בין 0 (ללא כלי) 2 לכלי דם נרחבים של הרבע הזה. הוסף את הציונים הבודדים מכל רבע כדי לחשב את הציון הסופי ניאו-וסקולריזציה.
   3. לסווג קרניות בחריפות כזאת בדחו אם יש להם ציון של 3 לשתי תצפיות רצופות במשך זמן מצביע עד 5 שבועות.
   4. לסווג עכברים שהקרניות היו ברורים בשעה 5 שבועות, אבל לפתח עננות בזמנים> 45 ימי הודעה קליטתם, עם ציון של 3 לשתי נקודות זמן ברציפות, כבעל דחיית שתל קרני לטווח מאוחר עבר. השתמש בעקומות הישרדות קפלן-מאייר לנתח הישרדות שתל.

5. מניפולציה של הדגם

בשמאל: 40px; ">

הכנה של תאים בודדים מהטחול.

1. כדי להכין תאים בודדים, להרדים את עכבר התורם ראשון. לאחר מכן, להסיר את הטחול.
2. הנח את הטחול במסננת תא ולשבש אותה עם בוכנת מזרק ממזרק 3 מיליליטר.
3. שטוף תאים וגלולים ב 10 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת הנקס.
4. הסר 10 μl של השעיה תא ולהוסיף עד 10 μl של trypan 0.4% כחולים ולערבב. תוסיף את זה לhemocytometer ולספור את התאים ברשת המרכזית. מספר התאים בצינור הוא ספירת התאים 10 ⁴ x 2 (גורם לדילול בtrypan הכחול) X X 10 (נפח בצינור).

הזרקה ללשכה הקדמית.

1. הרדימי עכברים כפי שתואר לעיל.
2. לבצע זריקות באמצעות מיקרוסקופ לנתח. לכל הזרקה intracameral, להשתמש ⁶ 10 תאי טחול ב0.005 מיליליטר נפח ומצויד במחט 33 G מזרק microliter 0.25 מיליליטר.
   הערה: מניפולציות אחרותשל המודל יכול להתבצע על ידי טיפול בבעלי חיים עם חומרים כימיים הפועלים כשני יריבים או אגוניסטים כדי לקבוע את התפקיד שגורם מסוים עשוי לשחק לאחר ניתוח שתל קרני orthotopic.

תוצאות

המודל העכברי של השתלת קרנית היה בשימוש כבר למעלה מ -20 שנים לאפיין בהצלחה מנגנונים של שני דחיית קרנית שתל ^19-23 וקבלת קרנית שתל ^{13, 15,16,18, 24-27.} מודל זה שימש להקמת חשיבות ביטוי מקאל בקבלת שתל קרנית, שבבעלי חיים שאין לי מקאל לא היו מסוגל לקבל allografts קרני ^15. כמו כן, נעשה שימוש על מנת להוכיח כי הטיפול בכלי דם צמיחת אנדותל גורם קולטן 1 morpholino מגביר את הישרדות שתל הקרנית ²⁸ באופן משמעותי. בדו"ח האחרון מאוד מודל זה שימש כדי לבדוק ...

דיון

המודל העכברי של השתלת קרנית המתוארת כאן מאפשר לחוקר ללמוד דחיית שתל קרנית אדם במודל שהוא ניבוי של מה גורמים הקשורים הטובים ביותר עם ​​שתי הדחייה ^{15,17,18,20, 26-30} וקבלת ^21-25 של קרנית allografts. בשונה השתלת קרנית אנושית, שבו מטופלים מקבלים גם טיפול בסטרואידים מקומי או מערכתי לדחייה או לטפל או למנוע ^31, מודל זה משמש בדרך כלל כדי לקבוע מי גורמים שרלוונטיים לדחייה של שתל, בהעדר טיפול כזה. בנוסף למודל לדחיית שתל חמור של קרנית, אשר מתרחש בדרך כלל בתוך...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Zeiss מיקרוסקופ כירורגי	Zeiss	Rebuilt
1 מ"ל מזרק	BD	305122
3 מ"ל מזרק	BD	309657
10 מ"ל מזרק	BD	309602
מספריים ואנוס	Stortz	E-3387
11-0 תפרים	אלקון	717939M
טרפין 2.0 מ"מ	Katena	K 2-7520
טרפין 1.5 מ"מ	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
מלקחיים	FST	11251-20
7-0 תפרים	אלקון	8065
2.5% פנילפרין הידרוכלוריד	אלקון	NDC 61314-342-02
1% טרופיקמיד	באוש & Lomb	NDC-24208-585-59
מזרק המילטון	המילטון	7654-01
33 מחט מד	המילטון	90033
מסננת תאים (100 μ m ניילון)	BD Falcon	352360
המוציטומטר	בריאות קרדינלית	B3175
טריפן כחול	סיגמא	T8154