מאמר שיטה

השתפר בג'ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

DOI:

10.3791/51840

⸱

20 בנובמבר 2014

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE ואחריה עיכול פרוטאוליטי בתוך הג'ל של רצועות חלבון שנפתרו ייצרה ניתוח פרוטאומי ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות. גישות דומות, שיאפשרו ניתוח מעמיק של הגליקנים הנישאים על ידי גליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE, דורשות שיקולים מיוחדים על מנת למקסם את ההתאוששות והרגישות בעת שימוש בספקטרומטריית מסה (MS) כשיטת הזיהוי. מכשול מרכזי שיש להתגבר עליו בהשגת נתונים באיכות גבוהה הוא הסרת מזהמים שמקורם בג'ל המפריעים לניתוח טרשת נפוצה. זרימת העבודה לדוגמה המוצגת כאן היא חזקה, יעילה ומבטלת את הצורך בניקוי HPLC מקוון לפני טרשת נפוצה. חתיכות ג'ל המכילות חלבוני מטרה נשטפות באצטוניטריל, מים ואתיל אצטט כדי להסיר מזהמים, כולל שברי אקרילאמיד פולימריים. גליקנים המקושרים ל-O משתחררים מחלבוני המטרה על ידי חיסול β רדוקטיבי בתוך הג'ל ומתאוששים באמצעות הליכי ניקוי חזקים ופשוטים. היתרון של זרימת עבודה זו הוא שהיא משפרת את הרגישות לאיתור ואפיון גליקנים סולפטיים. הליכים אלה מייצרים הפרדה יעילה של גליקנים פרמתילטים סולפטיים מגליקנים פרמתילטים שאינם סולפטים (סיאלילטים וניטרליים) על ידי חלוקת פאזה מהירה לפני ניתוח MS, ובכך משפרים את הניתוחים הגליקומיים והסולפוגליים של גליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glycosylation היא שינוי חלבון לאחר translational חיוני, תורם לפיזיולוגית האורגניזם, פתולוגיה רקמה, והכרה סלולרית 1-3. למרות התקדמות גדולה בglycoscience אנליטיים, המאפיין את הגיוון של glycans המלא על חלבון מסוים נותרת משימה מאוד מאתגרת, במיוחד בחלבונים מבודדים ממקורות ביולוגיים ראשוניים. יחד עם זאת, microheterogeneity של glycans גליקופרוטאין לעתים קרובות משפיע על אינטראקציות פונקציונליות עם חלבונים אחרים. לכן, אפיון של מגוון סוכרים חיוני להבנת המשמעות הפיזיולוגית של 4,5 glycosylation הסלולרי ורקמה. על מנת להבין את תרומתם של glycosylation גליקופרוטאין לפיזיולוגית רקמה ופיזיולוגית, חזק, רגיש, וטכניקות אנליטיות glycomic מקיפות הפכו חשוב יותר ויותר. בניתוח proteomic, הזדהויות חלבון בדרך כלל מושגת על ידי LC-MS/ ניתוח MS של פפטידים tryptic 6. עיכול חלבון יכול להתבצע באמצעות חלבון מטוהר או חלבונים נפתר על ידי SDS-עמוד הבא עיכול ב- ג'ל עם פרוטאזות כגון טריפסין 7-9. טרום העשרת תערובת החלבונים על ידי SDS-PAGE משפרת את העומק ודיוק של זיהוי חלבון. פיתוח אסטרטגיות דומות לניתוח glycomic של glycosylation גליקופרוטאין נמצא בחוד החנית של glycoscience.

שני סוגים העיקריים של glycans מחוברים לשדרת חלבונים באמצעות שני N-הצמדה או O-הצמדה. glycans N הצמוד צמודים לasparagine (ASN) שאריות נמצאו כחלק מsequon המוגדר כASN-X-Ser / Thr / Cys (X הוא כל חומצת אמינו מלבד פרולין), ויכול להיות שפורסם על ידי עיכול אנזימטי עם N peptide- -glycanase (PNGaseF או), או בפתרון, בג'ל, או בכתם 10-12. glycans צמוד O בעיקר מחובר לסרין (Ser) או תראונין שאריות (Thr). עם זאת, רק אחד אנזים כבר IDENtified כי הוא מסוגל לשחרר glycans צמוד O מגליקופרוטאין ויש לה ייחוד סוכרים מוגבל מאוד, משחרר רק glycans צמוד O הפשוט. אסטרטגיות שחרור כימי תישאר שיטת בחירה של שחרור מקיף של glycans צמוד O מגליקופרוטאינים. β-חיסול מצמצם או שאינו מצמצם, או hydrazinolysis טכניקות שחרור כימי מאופיינות היטב וכיום הגישות הנפוצות ביותר לשחרור glycans הצמוד O מגליקופרוטאינים 13,14. למרות β-חיסול מצמצם נעשה שימוש כדי לשחרר glycans צמוד O מגליקופרוטאינים מופרדים על ידי SDS-PAGE, גישות קודמות נדרשות הפרדת HPLC לניתוח שלאחר מכן 15-17.

ניתוח רב-ממדים של MS (הטרשת הנפוצה n) מספק כיום המקור העשיר ביותר של נתונים מבניים לאפיון glycans שוחרר מגליקופרוטאינים המבודדים בכמויות הצפויות מרוב המקורות ביולוגיים. העומק של MSאפיון מבני מבוסס הוא הקל מאוד על ידי permethylating glycans שוחרר לפני הניתוח שלהם. Permethylation משפר יינון ונוטה להשוות אות תגובות טוחנות על פני מגוון רחב של מבני סוכרים 18,19. בנוסף, באופן חד משמעי permethylation תגי moieties מסוף והחליפה monosaccharide עם המונים ייחודיים, ובכך משפרת את ההבהרה מבנית 20-23. לדוגמא, glycans חומצי קשה בדרך כלל לזהות כמינים-permethylated לא על ידי MS. למרות שניתן לאתרם glycans חומצי במצב יון שלילי על ידי MS, אי אפשר לזהות גם glycans חומצי וניטראלי באותו מצב היון. יתרון עיקרי של permethylation סוכרים הוא שכל הקבוצות חופשיות הידרוקסיל (OH) במתמירים monosaccharide של סוכרים יהיו כתרים עם קבוצה מתיל (och 3 או שת), ובכך החיובים של סוכרי sialylated מנוטרלים, מה שהופך אותם כגילוי כpermethylated ניטראלית (אסיה) Glycans lo. עם זאת, hydroxyls של moieties סולפט בsulfoglycans עמיד בפני permethylation, וכתוצאה מכך בשייר תשלום אניוני, המדכא יינון והירידה ברגישות. דיכוי זה כיום מונע ניתוח glycomic המקיף של גליקופרוטאינים מורכבים מאוד כגון mucins, אשר נושאים שפע גבוה של glycans הגופריתי 24-26.

הדיווחים אחרונים על glycans טיהור הגופריתית השתמשו טעונים, כרומטוגרפיה הפוכה שלב טיהור וglycans permethylated הנפרד לפני ניתוח MALDI. שיטה זו מסתמכת על הפרדת glycans הגופריתי ולא-הגופריתי באמצעות שלבים שונים ניידים לelution, שבו אנו מצאנו להיות מחמירים פחות ממחיצות שלב אורגניות מלאה. לכן, טכניקות חדשות מתאימות לאיתור והעשרת sulfoglycans מוצגות כאן. טכניקות אלו מאפשרות ההתאוששות כמותית של glycans הגופריתי בשלב המימי הבאה מים: DCM (dichloromethane)חילוץ, שמבוצע באופן שוטף בסוף תגובות permethylation סוכרי 27. חשוב לציין, הפרדה החזקה של sulfoglycans permethylated מתערובת של glycans שאינו גופריתי permethylated מעשירה במקביל למינים טעונים בעת גם לפשט MS 2 דפוסי פיצול. פרוטוקול מקיף לניתוח צמוד O משופר בג'ל סוכרים מוצג גם. הפרוטוקול המשופר משפר התאוששות סוכרים, מעלה את המידע המבני בר השגה באמצעות MS n ניתוח של glycans permethylated, ומשפר את הרגישות של ניתוחי sulfoglycomic להחיל גליקופרוטאינים חיוניים מבודדים ממקורות ביולוגיים.

פרוטוקול זה מיועד לניתוח סוכרים צמוד O של תמציות גליקופרוטאין כולה או של גליקופרוטאין ספציפי של עניין ייפתר על ידי SDS-PAGE והוא מורכב משלוש הפרוצדורות; ניקוי ג'ל), ב ') β-חיסול מצמצם בג'ל, ו- C) permethy סוכריםlation. המטרה היא להשיג נתונים glycomic צמוד O מקיפים לגליקופרוטאינים שנקטפו ממקורות ראשוניים של עניין ביולוגי (איור 1). גליקופרוטאינים מופרדים על ידי SDS-PAGE הם דמיינו על ידי צביעה ולהקות של עניין הם נכרת ולהקת ג'ל וכתוצאה מכך נחתכה לחתיכות קטנות. חתיכות ג'ל destained ונתונים לשטיפת אתיל אצטט להסרת מזהמי ג'ל (איור 2 א). שחרור סוכרים מושגת על ידי β-חיסול מצמצם ב- ג'ל (איור 2) וglycans שוחרר הם permethylated. permethylation החילוץ ימי-האורגני הבא כמותית מחיצות glycans אניוני גופריתית מglycans שאינו גופריתי הניטרלי (איור 2 ג). בג'ל β-חיסול מצמצם מצמידים את המיצוי המימי-אורגני מאפשר אפיון של glycans צמוד O וsulfoglycans שוחרר מכמויות קטנות של גליקופרוטאין מופרד על ידי SDS-PAGE. הסקירה האסטרטגית היא summariZed באיור 1 והפרטים מוצג באיור 2. בנוסף, חלק מחתיכות ג'ל destained ורחצו יכול לשמש לזיהוי חלבון על ידי טכניקות proteomic LC-MS / MS סטנדרטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: חששות בטיחות מעבדה

בקנה אחד עם שיטות עבודה מומלצות מעבדה סטנדרטית, לצפות הבא. אחסן את כל הממסים האורגניים במקומות מתאימים. שמור את כל חומרי הפסולת במיכלים פסולת כימיים עם תיוג ברור של הרכב כימי. כמו כמה חומרים כימיים המשמשים בפרוטוקולים אלה הם פוטנציאל לסרטן או ליצור גזים דליקים נדיפים, לטפל בכל חומרים כימיים במנדף עם אוורור. ללבוש ציוד מגן אישי כגון כפפות, מעבדה מעיל, ומשקפי מגן בעת ​​עבודה עם ממסים אורגניים.

figure-protocol-1
איור 1. נוהל O-glycomics בג'ל. חלבונים (א) לעניין נפתרים על ידי SDS-PAGE, זוהו על ידי נהלים המתאימים צביעה (Coomassie או כסף), ונכרתו. חתיכות ג'ל נכרת פרוסותלקוביות קטנות, destained, ושטף עם אתיל אצטט כדי להפחית מזהמים שמפריעים לניתוח MS שלאחר מכן. חלק מפרוסת ג'ל ניתן להזמין לעיכול tryptic בג'ל ואפיון proteomic לאחר מכן על ידי LC-MS / MS. glycans (ב ') צמוד O משתחררים מגליקופרוטאינים נפתרו על ידי β-חיסול מצמצם בג'ל. צעדים חיוניים כוללים desalting והסרת borate ידי אזיאוטרופ עם מתנול. (ג) O צמוד glycans שפורסם על ידי β-חיסול מצמצם הם permethylated ומחולק למחיצות בהמשך לשלבים מימיים ואורגניים. Sulfoglycans הם התאוששו כמותית בשלב העליון (המימי), בעוד שמחיצת glycans הניטרלי וsialylated לשכבה התחתונה (DCM).

figure-protocol-2
תרשים זרימה 2. פרט נתון לglycomics בג'ל. כל experimenצעד טל שמוצג באיור 1 ממחיש באופן אישי. () Destaining ג'ל וחילוץ EtOAc, (ב) לכוון β-חיסול בג'ל מצמצם לשחרור סוכרים O הצמוד, ו- (ג) מחיצת permethylation ושלב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

1. ג'ל כריתה והסרה של מזהמים שמקורם בג'ל

  1. לפני שמתחיל את ההליך, להכין כימיקלים וחומרים כימיים המופיעים בחומרי רשימה.
  2. לפתור חלבון על ג'ל SDS-PAGE באמצעות מערכות חיץ טריס-גליצין סטנדרטיים. כתם נפתר חלבונים עם או הכחול Coomassie מבריק או כסף כתם. באופן כללי, התאוששות של glycans צמוד O מג'לי כסף מוכתם היא כ 80-90% מההתאוששות שהושגה מCoomassie מוכתם ג'לי.
  3. לאחר אלקטרופורזה, מניח את הג'ל על צלחת זכוכית ולא בלוהוא האזור של עניין באמצעות אזמל נקי או סכין גילוח.
  4. כדי להגדיל את התשואה של O-glycans, להעביר את להקת ג'ל של עניין על צלחת זכוכית אחרת ולחתוך חתיכת ג'ל נכרתה לכ 2 קוביות מ"מ. להימנע מחתיכות ג'ל קוביות מ"מ קטן מ 1 כי התאוששות סוכרים מצטמצמת. העבר את חתיכות ג'ל הקטנות לתוך צינור בורג עליון זכוכית (13 x 100 מ"מ) עם microspatula נירוסטה.
  5. הוסף 1 מיליליטר של 25 יקרבונט מ"מ אמוניום (AMBIC, NH 4 HCO 3) לצינור הדגימה, מכסה את שפופרת הזכוכית עם מכסה בורג בראש מרופד טפלון, ולערבב בעדינות על ידי מצליף את הצינור לפני שנותן לי לעמוד במשך 10 דקות. אין להעסיק תסיסה נמרצת על מנת להימנע מקריעת החלקים ג'ל.
  6. להסיר AMBIC בזהירות מצינור הזכוכית או באמצעות פיפטה זכוכית פסטר או פיפטה מצוידת בקצה פלסטיק ארוך במיוחד. הימנע מלנפץ והעברת החלקים ג'ל הקטנים תוך הסרת פתרון AMBIC.
  7. הוסף 1 מיליליטר של אצטוניטריל (ACN) לשפופרת זכוכית, כובע, ומערבבים בעדינות על ידי מצליף צינור לפני שנותן לי לעמוד במשך 10 דקות. ודא שהחלקים ג'ל מכוסים לחלוטין עם ממס. במידת צורך, לדחוף חתיכות ג'ל מקיר צינור ולתוך ממס עם קצה פיפטה.
  8. פיפטה את ACN משפופרת הזכוכית וחזור על שלבים 1.5-1.7 עד שהצבע הכחול הבהיר מתבטל. חזור על מינימום של חמישה שוטף AMBIC / ACN רציף במידת צורך. לג'לים כסף מוכתם, השתמש בערכת destain. להמשיך לשלב הבא כאשר חתיכת ג'ל הופכת אחיד לבן ואילו בACN.
  9. פיפטה את כל נוזל מצינור הזכוכית, לסכם את הצינור, להוסיף 1 מיליליטר של AMBIC ולתת לעמוד במשך 5 דקות.
  10. הסר AMBIC ולהוסיף 2 מיליליטר של אתיל אצטט (EtOAc) לשפופרת הזכוכית. צינור לסכם עם ברדס מרופד טפלון ומקום על 4 מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה קצה על קצה או לחלופין לבצע שלושה שוטף EtOAc בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות כל אחד. כבר לשטוף EtOAc, יעילה יותר להסרת מזהמים.
  11. הסרEtOAc הסופי לשטוף ולבצע שלוש שוטף כל אחד עם 2 מיליליטר של H 2 O. הסרה מלאה של EtOAc תבטיח תגובת β-חיסול מצמצם חזקה.
  12. פיפטה את H 2 O ומייבש את הג'ל על ידי שטיפת פעם אחת עם 1 מיליליטר של ACN.
    הערה: לאחר ייבוש, ג'לים המיובשים מוכנה לβ-חיסול בג'ל. ניתן לאחסן חלקים ג'ל מיובשים ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  13. לעצור את תהליך הכביסה בכל צעד ולאחסן את החלקים ג'ל על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה, ללא קשר לחיץ או פתרון מוחל על ג'ל (AMBIC, ACN, H 2 O). הפעל מחדש את הכנת מדגם בכל עת בתוך 2 ימים הקרובים.
  14. השתמש בחלק מחתיכות ג'ל destained והמיובשות לזיהוי חלבון על ידי גישות proteomic סטנדרטיים.

2. שחרר את O-סוכרים בג'ל על ידי β-ביעור Reductive

  1. הכן פתרון מניות של הידרוקסיד 1 M נתרן (NaOH) באמצעות 50% NaOH או חנות NaOH ומוצקה על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      קח 5.2 מיליליטר של 50% NaOH (או 4 גרם של NaOH המוצק) ולהתאים את עוצמת קול עד 100 מיליליטר כדי להפוך 1 פתרון M NaOH. פתרון לדלל את מניות 1 M NaOH 100 מ"מ NaOH, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים ללא פגיעה ביעילות בתגובות β-חיסול מצמצמים.
  • הפוך 2 M borohydride נתרן (4 NaBH) ב100 מ"מ NaOH. לפזר 38 מ"ג של 4 NaBH ב0.5 מיליליטר של 100 מ"מ NaOH. בדרך כלל, להשתמש 0.5-1.0 מיליליטר של תמיסת borohydride עבור כל דגימה. להשתנות היקף פתרון התגובה על כמות החלקים ג'ל מיובשים מוכנים בשלב 1. מצפה להשתמש 0.5 מיליליטר של תמיסת borohydride ל1-2 חתיכות נכרתה ג'ל (שלב 1.3).
  • הוסף 500 μl של 100 מ"מ NaOH לחתיכות ג'ל המיובשים ולתת לעמוד במשך 3-5 דקות על קרח כדי לאזן את הג'ל לתנאים הבסיסיים אשר משפרים התאוששות סוכרים.
  • הוסף 500 μl של 2 מ '4 NaBH ב100 מ"מ NaOH, וכתוצאה מכך ריכוזים סופיים של 1 M NaBH
  • במהלך השעה הראשונה של דגירה, לערבב בעדינות את הצינור כל 15 דקות. למנוע תסיסה חזקה, כי זה עלול לפצל את חלקי ג'ל. בצע את התגובה בחממה / תנור equilibrated היטב או בבלוק חימום. ודא שחתיכות ג'ל מכוסות בפתרון תגובה.
  • לעצור את התגובה על ידי הסרת צינור הדגימה מן החממה או בלוק חימום ולהניח אותו על קרח.
    הערה: לאחר המאפשר תגובת β-החיסול כדי להמשיך במשך 18 שעות, תהליך desalting חייב להתבצע באותו היום.

    • 3. desalting על כרומטוגרפיה קטיון מטבע

    1. תוך שמירה על צינור הדגימה על קרח כדי למנוע היווצרות חום גבוהה, מוסיף באיטיות 10% dropwise חומצה אצטית (AcOH) כדי לנטרל את הבסיס. בעדינות מערבולת צינור המדגם בין תוספות של AcOH. להיות זהיר כדי להוסיף חומצה לאט ושחררו חכם כמו additiעל החומצה יפיק "הר געש" של בועות. צנטריפוגות הצינור לחסל בועות וימנעו זליגה, במידת צורך.
      1. על מנת להסיר הכמות הגדולה של נתרן בתערובת התגובה, להעביר את תערובת התגובה דרך עמודה קטיון מטבע קטנה (Dowex או שרף AG-50W-X8, צורת H +).
      2. שטוף את שרף חילוף קטיון עם 1 M NaOH ו 1 M HCl לפני השימוש כדי להסיר מזהמים שמפריעים לניתוח MS, גם אם השרף הוא של כיתה אנליטיים.
      3. משרים את השרף ב 1 M NaOH ולהסיר פתרון על ידי decantation. הוספת דה מיונן מים, להסיר את המים, לאחר מכן להוסיף 1 M HCl.
    2. חזור על שלבים אלה עד לפתרון מעל השרף הוא חסר צבע. שטוף את השרף לנקות עם מים וחנות ללא יונים ב 5% AcOH על 4 מעלות צלזיוס.
    3. כדי להפוך זכוכית קטנה טור, שריטה ולשבור את קצה פיפטה זכוכית פסטר, בעזרת סכין קרמיקה, כך שלהתחדד של פיפטה הקצה הוא באורך של כ 1 סנטימטר. להפריד פקק של צמר זכוכית ולדחוף לכיוון הקצה ויוצר תמיכה למיטת השרף. לאבטח את טור פיפטה עם מהדק או אטב כביסה ומקום על פני מבחנת זכוכית.
    4. שטוף את פיפטה הריקה עם 1 מיליליטר של מתנול (MeOH) ו- 3 מיליליטר של 5% AcOH. מערבולת H + Dowex או תרחיף שרף חילוף קטיון AG50 מאוחסן ב 5% AcOH ולהעביר מספיק סלארי לייצר 1 מיליליטר מיטת נפח בעמודת פיפטה פסטר.
    5. יש לשטוף את העמודה באמצעות חמישה כרכים של 5% AcOH. בדקו לזרום דרך להופעה של חלקיקי שרף ולא משתמש בטור אם שרף מזוהה.
    6. מקום עמודה מעל צינור חדש זכוכית בורג בראש (16 x 125 מ"מ) ומדגם עומס. לאסוף את הזרימה דרך וelute glycans עם לפחות 3 כרכים של 5% AcOH לתוך הצינור.
    7. מכסה את הצינור עם Parafilm ולעשות חורים זעירים עם מחט. מניחים את צינור המדגם ב -80 מעלות צלזיוס או על קרח יבש. ברגע קפוא, לייבש את המדגם על ידי lyophilization. אחסן את החומר היבש ב -20 °צלזיוס עד לשימוש.

    4. הסרת Borate

    1. הכן 10% AcOH בMeOH. קח 10 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית ולהתאים את עוצמת קול לעם מתנול 100 מיליליטר. אחסן מגיב זה בבקבוק זכוכית עם מכסה מצופה טפלון לעד 6 חודשים.
    2. להוסיף 300 μl של 10% AcOH בMeOH למיובשת, צינור הדגימה lyophilized ומערבולת. הסר את borate trimethyl וכתוצאה מכך על ידי אידוי תחת זרם N 2.
      הערה: ערבוב מלחי borate עם מתנול בתנאים חומציים מייצרת borate trimethyl שהוא תרכובת נדיפים.
    3. יבש תחת N 2 זרם על 37 מעלות צלזיוס. לאחר ייבוש, מוסיף aliquot אחר של AcOH בMeOH כמתואר בשלב 4.2. ייבש את הנוזל למשך 5 דקות תחת חנקן (N 2) זרם על 37 מעלות צלזיוס.
      1. resuspension חזור וייבוש לפחות 3 פעמים. אחסן את החומר היבש ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

    5. C18 הנקי-עד

    1. לאזן טור מחסנית C18(שרף מיליליטר 1 גודל, 100 מ"ג) תוך שימוש בשלושה כרכים של ACN וחמישה כרכים של 5% AcOH. להאיץ את המעבר של פתרונות equilibrating על ידי הפעלת לחץ אוויר חיובי מתון.
    2. הוסף 500 μl של 5% AcOH לצינור מדגם desalted וללא borate ותתמוסס ממערבולת.
    3. לטעון מדגם resuspended על טור C18 equilibrated לאסוף את הזרימה דרך לתוך צינור כובע בורג זכוכית (13 x 100 מ"מ). Elute O-glycans עם 3 מיליליטר של 5% AcOH לתוך הצינור.
    4. Parafilm הצינור, לעשות חורים קטנים עם מחט קטנה או להשתמש בברדס מרופד PTFE רופף סגור כדי לכסות את הצינור, ולהקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס או על קרח יבש. הסר ממס על ידי lyophilization. חנות המדגם המיובש ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

    הכנת בסיס 6. לPermethylation

    הערה: על מנת להשיג permethylation חזק, להכין NaOH טרי תרחיף. כל כלי הזכוכית המשמשות לתגובות permethylation יש לנקות באופן נרחב.

    1. כדי להכין את מגיב הבסיס לpermethylation, להוסיף 400 μl של 50% NaOH לשפופרת זכוכית נקייה בורג העליון (13 x 100 מ"מ). להוסיף 800 μl של MeOH ומערבולת נטול מים.
    2. הוסף 4 מיליליטר של sulfoxide נטול מים דימתיל (DMSO) ומערבולת כדי ליצור משקע לבן.
    3. צנטריפוגה ב 600 XG 1 דקות עד גלולה המשקע. פיפטה את supernatant וזורקים. להוסיף 4 מיליליטר נוסף של DMSO נטול מים לגלולה. וורטקס.
    4. חזור על שלב 6.2 ו -6.3 מינימום של שלוש פעמים או יותר עד שלא צורות משקע לבנה.
    5. ממיסים את בסיס pelleted בDMSO נטול מים 3 מיליליטר ולערבב בעדינות על ידי pipetting ומעלה מטה עם פיפטה פסטר נקייה.
    6. השתמש בבסיס באופן מיידי לתגובת permethylation הבאה שלא ניתן לאחסן אותו.

    7. Permethylation של glycans שוחרר

    1. הוסף 200 μl של DMSO נטול מים למדגם מטוהר-C18 ומערבולת או sonicate לresuspend.
    2. להוסיף 300 μl של resuspסלארי הבסיס הסתיימה לדוגמא ולהוסיף באופן מיידי של iodomethane 100 μl (MEI). לאטום צינור עם ברדס מרופד טפלון ונמרץ לערבב במשך 5 דקות על ידי מערבולת.
    3. כדי לעצור את תגובת permethylation, להוסיף 2 מיליליטר של 5% AcOH על קרח ומערבולת. פתרון עד פיפטה ולמטה 5 פעמים כדי לצמצם את הנפח הנותר של מיי על ידי אידוי.
      הערה: AcOH מנטרל את הפתרון וההסרה של מיי מגבירה את יעילות השאיבה של glycans הגופריתי לשלב מים במהלך השלב-המחיצה.
    4. הוסף 2 מיליליטר של dichloromethane (DCM) ומערבולת. צנטריפוגה ב 600 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר כדי להפריד בין השלבים מימיים ואורגניים.
    5. מעביר את השכבה העליונה (שלב המימי המכיל את רוב permethylated glycans הגופריתי) לתוך צינור חדש זכוכית (13 x 100 מ"מ).
    6. הוסף 2 מיליליטר של H 2 O השלב והמערבולת האורגניים. צנטריפוגה ב 600 XG עבור 1 דקות כדי להפריד את השלבים מימיים ואורגניים, ולשלב שלב המימי שני זה עם האשוחשלב רח המימי (שלב 7.5).
    7. חזור על שלב 7.6 ו -7.5 שלוש פעמים נוספות, אבל אין צורך לשמור את השלבים מימיים וכתוצאה מהמחיצות שלאחר מכן.
    8. להסיר את השכבה העליונה הסופית (שלב המימי) עד כמה שניתן מהשכבה התחתונה (שלב אורגני) ולהעביר את השכבה התחתונה (שלב אורגני) לתוך צינור זכוכית חדש נפרד באמצעות פיפטה פסטר נקייה.
    9. ייבש את השלב האורגני תחת N זרם 2 על 42 מעלות צלזיוס.
    10. מכסה את הצינור עם Parafilm ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש.

    8. C18 ניקוי של Permethylated הגופריתי O-glycans מאת השלב מימיים

    1. לאזן טור מחסנית C18 עם שלושה כרכים של ACN וחמישה כרכים של 5% AcOH.
    2. טען את השלבים מימיים שנאספו ומשולבים מצעדים 7.5 ו -7.6 על הטור.
    3. לשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של H 2 O לdesalting.
    4. Elute permethylated הגופריתי O-glycans לתוך צינור זכוכית חדש עם 2 מיליליטר50% ACN. השתמש elution נוספת עם 85% ACN כדי לשפר את ההתאוששות של permethylated הגופריתי O-glycans על אוליגוסכרידים גדולים יותר.
    5. eluates יבש תחת זרם חנקן על 42 מעלות צלזיוס.
    6. אחסן את החומר היבש בC עד -20 ° עד 6 חודשים לפני ניתוח MS.

    9. ספקטרומטריית מסה של Permethylated O-glycans

    1. לנתח O-glycans permethylated על ידי עירוי ישיר לספקטרומטר מסה מתאים באמצעות מקור nanoelectrospray בקצב זרימת מזרק של 0.40-.60 μl / דקה ב 210 מעלות טמפרטורת נימי C. לפיצול על ידי CID בMS / MS ו- MS n של מכשיר מלכודת יונים, להחיל 30-40% אנרגיית התנגשות.
    2. למצב יון שלילי, מחדש permethylated הגופריתי O-glycans ב -50 μl של מתנול / 2-propanol / 1-propanol / 13 מ"מ אצטט המימי אמוניום (16: 3: 3: 2 לפי נפח). למצב יון חיובי, מחדש permethylated O-glycans ניטראלי / sialylated ב -50 μl של נתרן 1 מ"מ הידרוxide במתנול / מים (1: 1).
    3. השתמש במיפוי הכולל היון (TIM) ופונקציונליות סריקת אובדן ניטראלית (סריקת NL) של גרסת חבילת תוכנת Xcalibur 2.0 לניתוח MSN לאפיין מבני O-סוכרים בודדים 13,19.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    השפעה של אתיל אצטט טיפול לפני בג'ל β-ביעור Reductive

    ספקטרום המוני נציג של דגימות סוכרים צמודים O permethylated שוחררו מהשור mucin באמצעות β-חיסול מצמצם בג'ל מוצג באיור 3. לשטוף EtOAc של חתיכות ג'ל מסיר ביעילות מזהמי SDS וpolyacryl אשר מפריעים לניתוח MS לאחר מכן 27.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    שילוב של חיסול β רדוקטיבי בתוך הג'ל עם מיצוי מימי-אורגני משפר את הרגישות והעומק של נתונים מבניים שניתן לרכוש לאפיון גליקנים מקושרים O סולפטיים ולא סולפטיים שנאספו מכמויות קטנות של גליקופרוטאינים מסוג מוצין שנפתרו מחלבונים אחרים על ידי SDS-PAGE. ההתקדמות החיונית של הגישות הטכניות שהוצגו במחקר זה הן: (א) הסרה קלה של מזהמים שמקורם בג'ל על ידי שלבי כביסה פשוטים; (ב) התאוששות כמותית של סולפוגליקנים פרמתיליים בשלב המימי לאחר חלוקה מהירה של מים-DCM. זרימת העבודה המתוארת כאן משפרת באופן דרמטי את רגישות הזיהוי של גליקנים סולפטיים...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    עבודה זו נתמכה על ידי P01HL107151 המענקים מה-NHLBI/NIH. המחברים גם מודים בהכרת תודה על התמיכה והגישה למכשור הניתנים באמצעות P41GM103490 מענקים מ-NIGMS/NIH.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    מים, מים נטולי יוניםסיגמא-אולדריץ' 270733-4LCHROMASOLV, עבור
    חומצה אצטית HPLC, GlacialFisherA38-500מוסמך ACS ≥ 99.7% עם
    מתנולסיגמא-אולדריץ' 34860-4L-RCHROMASOLV, עבור HPLC, ≥ 99.9%
    אמוניום ביקרבונטפלוקה09830-500 גרםBioUltra, ≥ 99.5% (T), שלב 1
    אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ' 34998-4LCHROMASOLV Plus, עבור HPLC, ≥ 99.9%, שלב 1
    אתיל אצטטפלוקה34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV, שלב 1
    נתרן בורוהידרידאולדריץ'213462-25Gריאגנטפלוס, 99%, שלב 2
    יודומתאןסיגמא-אולדריץ' 289566-100Gריאגנטפלוס, 99.5%,  שלב 6.  יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד השימוש.  יש לשבת בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    תמיסת נתרן הידרוקסיד, 50% w/wפישרSS254-1, שלב 6
    דימתיל סולפוקסיד,סיגמא-אולדריץ' נטול מים 276855-1Lנטול מים, ≥ 99.9%, שלב 6
    מתנול,סיגמא-אולדריץ' נטול מים 322415-100 מ"לנטול מים, 99.8%, שלב 6
    דיכלורומתאןסיגמא-אולדריץ' 34856-4LCHROMASOL®, עבור HPLC, ≥ 99.8%, מכיל עמילן כמייצב, שלב 7
    Dowex 50WX8 צורת מימןצורת מימן 100-200  רשתסיגמא-אולדריץ' 217506-500Gשלב 3
    AG 50W-X8 שרף Bio-Rad142-1441שלב 3
    BAKERBOND spe 1 מ"ל x 100 מ"ג עמודת מיצוי שלב מוצק, PP, אוקטדציל (C18) שלב הפוךJT BakerJT-7020-01שלב 5 ו-8
    7.5% ג'ל Mini-PROTEAN TGX Precast Bio-Radשלב 1
    כתם קומאסי בטוח ביולוגית Bio-Rad161-0786G-250,
    ערכת כתמי כסף שלב 1 לספקטרומטריית מסהPierce24600שלב 1
    ערכת אוליגוסכרידים (Maltotriose, Dp3: R474140)Supelco 47265
    ערכת אוליגוסכרידים (Maltotetraose, Dp4: R474135)Supelco 47265
    צנרת פסטר חד פעמית, זכוכית, קצה קצרVWR14673-010שטיפה לפני השימוש
    PYREX 13 x 100 מ"מ צינורות תרבית הברגה חד פעמיים תחתונים עגוליםקורנינג99447-13שטיפה לפני השימוש
    PYREX 16 x 125 מ"מ צינורות תרבית הברגה תחתונים עגולים חד פעמייםקורנינג99447-16שטפו לפני השימוש
    מכסים/סגירות פנוליים עם תוחם גומי עם PTFEKimble45066C-13שטיפה לפני השימוש
    מכסים/סגירות פנוליות עם תוחם גומי עם PTFE Kimble45066C-15שטיפה לפני השימוש
    מזרק המילטון HPLCHAMILTON81265נפח 500  μ l, גודל מחט 22 גרם
    מזרק המילטון HPLCהמילטון81165נפח 250  μ l, גודל מחט 22 גרם
    מזרק המילטון HPLCהמילטון81065נפח 100  μ l, גודל מחט 22s G
    מזרק המילטון HPLCהמילטון80965נפח 50  μ l, גודל מחט 22s G
    מזרקים מכוילים המילטוןHAMILTON80300נפח 10  μ l, גודל מחט 26s G
    פטרי צלחת זכוכית 100 מ"מ x 15 מ"מGSC INTERNATIONAL INC1500-4שטיפה לפני השימוש, שלב 1
    להבים כירורגיים Bard-Parkerפישר371310שלב 1
    מודול חימום/ערבוב Reacti-Thermפירס18870שלב 1, 4 ו-7
    בלוקים לחימוםפישר125Dשלב 2
    פיירקס סיבי זכוכית צמר בורוסיליקט גודל נקבוביות 8  μ mAldrichCLS3950שלב 3
    חותך סיליקה התמזגחותחותך צינורותalltech3194שלב 3
    מערבולות מרובות צינורות VWR444-7063שלב 6
    ליופילייזר 25EL FreezemobileVirtis25EL
    צנטריפוגהVWRקליני 50
    LTQ Orbitrap Discoveryתרמו פישר מדעי
    מוסמך

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    OSDS PAGEC18

    מאמרים קשורים