מאמר שיטה

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

DOI:

10.3791/51845

⸱

9 באוקטובר 2014

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחבור חלופי ממלא תפקיד קריטי במעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית המתרחשת בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה לאיתור שחבור חלופי במהלך EMT באמצעות מודל EMT הניתן להשראה על ידי ביטוי מדכא השעתוק טוויסט. EMT מנוטר על ידי שינויים במורפולוגיה של התא, אובדן לוקליזציה של E-cadherin בצמתים של תא-תא, וביטוי מיתוג של סמני EMT, כגון אובדן סמני אפיתל E-cadherin ו-γ-catenin ורווח של סמנים מזנכימליים N-cadherin ו-vimentin. באמצעות ערכות פריימר ספציפיות לאיזופורמים, השחבור האלטרנטיבי של mRNAs מעוניינים מנותח על ידי RT-PCR כמותי. הייצור של איזופורמים חלבונים מתאימים מאומת על ידי מבחני אימונובלוטינג. השיטה לאיתור איזופורמים של אחוי המתוארת כאן מתאימה גם לחקר שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) הוא תכנית התפתחותית שמניעה המורפוגנזה איבר ושיפוץ רקמות במהלך embryogenesis. כאשר מופעלים באופן חריג, EMT מקדם גרורות סרטני ואיבר סיסטיק 1,2. מחקרים משכנעים שתיארו את החשיבות של רגולציה תעתיק במהלך התהליך של EMT, שהוגדרו על ידי כמה גורמי שעתוק, כגון טוויסט, חילזון, וZeb, שמדחיקים את הביטוי של חלבון צומת E-cadherin adherens, וכתוצאה מכך האובדן של cobble- אבן כמו מורפולוגיה ורווח של פנוטיפ mesenchymal דמוי כישור 3-8 אפיתל. מחקרים שנעשה לאחרונה באמצעות ניתוח הגנום של RNAs חשפו כי קיים קבוצה של גני שחבור שדפוסים קשורים גם עם פנוטיפים אפיתל או mesenchymal 9,10. עבודה מהמעבדה שלנו מבחינה תפקודית מחוברת שחבור חלופי וEMT. על ידי לימוד CD44 מולקולת הידבקות פני תא, הראינו כי altern CD44שחבור יצירתי מוסדר בחוזקה במהלך EMT, ויותר מכך, שאיזופורם אחוי CD44 מיתוג סיבתי תורם לEMT 11.

שחבור חלופי מהווה מודל נפוץ ומשומר של ויסות הגנים, כעד 95% מהגנים רב אקסון אדם שחבור 12-14 לחלופין. על ידי יצירת מוצרי חלבון מרובים מגן יחיד, שחבור חלופי מהווה מנגנון חיוני לגיוון חלבון, הוספת שכבה נוספת של מורכבות לגנום האנושי. ככזה, חוסר ויסות של שחבור חלופי שעלול להוביל להשפעות ביולוגיות עמוקות גורמות למחלות בבני אדם. ואכן, שחבור חלופי חריג במחלות תועד במשך למעלה מעשור 15-25, כולל אחרונים ממצאים שמוטציות בגני מקודדי מכונות הספלייסוזום נמצאות בדרך כלל בתסמונות myelodysplastic 26-28. לכן, פיתוח שיטות אמינות לזיהוי של i שחבור החלופיsoforms הוא בעלת חשיבות רבה בחקר תהליכים ביולוגיים המגוונים כולל EMT.

כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שינויים בשחבור חלופי באמצעות מודל EMT מושרה. השיטות לעיצוב פריימרים PCR וגילוי isoforms אחוי הן מתאימות לא רק למחקר של שחבור חלופי במהלך EMT, אלא גם למחקר של שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים. חוקר שחבור חלופי במהלך EMT הוא הכרחי על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים של EMT וגרורות סרטניים, ובכך להקל את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות לטיפול בגרורות סרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 תרבית תאים של EMT אינדוקציה

הערה: EMT יכול להיגרם על ידי טיפול בTGFβ או ביטוי חוץ רחמי של טוויסט גורמי שעתוק, חילזון, או Zeb1 / 2 בתאי האפיתל. שתואר בפרוטוקול זה הוא מערכת EMT מושרה באמצעות ביטוי של חלבון היתוך טוויסט-ER בתאים הונצחו אנושיים החלב אפיתל (HMLE / טוויסט-ER, מתנתו של ד"ר J יאנג, UCSD) 9,11,29. עם 4 hydroxytamoxifen טיפול (TAM), טוויסט-ER חלבון היתוך translocates לגרעין לנהוג שעתוק ותוצאות במעבר EMT מלא ב12-14 ימים 9,11,29. מערכות נוספות EMT מושרה, כגון HMLE / החילזון-ER, HMLE / TGFβ, וMCF10A / TGFβ, ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו 11,30.

  1. שמור על תאי HMLE / טוויסט-ER במדיום גידול של תאי אפיתל החלב סרום ללא (MEGM) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2. מעבר התאים כל 2-3 ימים שבם מגיעים למפגש 80%. דגירה תאים עם טריפסין 0.15% ב37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להשבית טריפסין עם עגל בסרום 5% / DMEM. ספין למטה תאי resuspend אותם בMEGM. פלייט תאים בצלחת תרבית רקמה חדשה ביחס של 1 עד 4.
  2. לפזר TAM באתנול כדי להפוך את פתרון 200 מיקרומטר. הגן על TAM מהאור והחנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, טרי להוסיף TAM לתקשורת MEGM בדילול 1: 10,000 כדי להפוך את הריכוז סופי של 20 ננומטר TAM.
  3. לאינדוקציה של EMT, תאי צלחת 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר בשני עותקים. תרבות תאים עם 20 תקשורת ננומטר MEGM TAM המכיל.
  4. פלייט תאי 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת 10 סנטימטר בשני עותקים ולטפל בתאים עם אתנול 0.01% כביקורת שטופל הלא TAM.
  5. יומיים לאחר הדגירה, לצלם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x להקליט שינויים מורפולוגיים של תאים.
  6. לשאוב את המדיום מצלחת אחת של שליטה או שטופל TAMתאים. שטוף תאים עם PBS הקר, ותאי קציר על ידי מבטל מחצית מהצלחת במאגר תמוגה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני בחיץ Ripa לניתוח חלבונים.
  7. תאי מעבר מהשליטה או המנות שטופלו על ידי TAM 1.6 x 10 6 תאי ציפוי מחדש בצלחת 10 סנטימטר בשני עותקים. רציפות טיפול בתאים עם 20 ננומטר TAM או רכב.
  8. חזור על שלבים 5 עד 7 פעם אחת בכל יום אחר עד היום 14, בו בזמן, תאי טוויסט-ER טופל TAM להראות מורפולוגיה mesenchymal דמוי כישור, ואילו תאי שליטת רכב שטופל לשמור על מורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת-.

.2 אפיון EMT

הערה: השלמת EMT הוא הצביע על ידי: (1) תא שינויים מורפולוגיים ממורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת למראה דמוי כישור כמו fibroblastic-; הפסד של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (2); ו (3) הביטוי עבר של סמני EMT, שהוגדר על ידי האובדןשל סמנים ורווח של סמני mesenchymal אפיתל.

שינויים מורפולוגיים תא נתפסו על ידי מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x במהלך האינדוקציה EMT הזמן, שתוארו בסעיף 1 זיהוי חיסוני הקרינה של E-cadherin בתא צמתים מתואר בסעיף זה. הביטוי של סמני EMT הוא זוהה על ידי immunoblotting. סמני אפיתל נפוצים הם E-cadherin, γ-catenin, וoccludin, וסמני mesenchymal כוללים פיברונקטין, N-cadherin וvimentin. נהלים כלליים של immunoblotting מתוארים בסעיף 4.

  1. ביום 12 טיפול TAM, זרע 1 x 10 5 תאים על coverslip מעגלי מ"מ זכוכית 12 להציב גם צלחת 24 גם.
  2. 48 שעות לאחר זריעת תאים, בינוניים לשאוב ולשטוף עם PBS המחומם מראש.
  3. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% מחוממים מראש במשך 15 דקות.
  4. שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  5. דגירה תאים עם 0.2% טריטון X-100 בPBS ל15דקות ב RT.
  6. שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  7. דגירה תאים בBSA / PBS 5% עבור שעה 1 ב RT לחסום הלא ספציפי מחייב.
  8. דגירה תאים עם E-cadherin הנוגדן הראשוני ב01:50 דילול של 1% BSA / PBS בO תא humidified / N ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 01:50 ו1: 200, והדילול האופטימלי עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן ניסיוני.
  9. למזוג את הנוגדן הראשוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  10. דגירה תאים עם נוגדנים משני שכותרתו ניאון בדילול 1: 500 עבור שעה 1 ב RT. משלב זה על, להגן על התאים מפני אור.
  11. למזוג נוגדנים משני ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  12. תאי כתם עם 0.1-1 גר '/ מ"ל ​​DAPI או Hoechst עבור 10 דקות.
  13. יש לשטוף את תאי פעמים עם PBS שלוש.
  14. הר coverslips עם ירידה של מדיום הרכבה, וcoverslips חותם עם לק.
  15. שימו לב תאים ולקחתתמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 63X.

צביעה עם נוגדנים נוספים ניתן לבצע על מנת לאשר את הפנוטיפ EMT. לדוגמא, N-cadherin ויקטינו שריר α-חלק יכולים להיות מוכתם ל29,31,32 פנוטיפ mesenchymal. ארגון מחדש של מבנה cytoskeletal יכול להיות במעקב על ידי צביעת תאים עם phalloidin לF-אקטין 11. בנוסף, ניתן לבצע מבחני לתנועתיות תא והתנגדות תא מוות לבחון את המאפיינים של 11 EMT.

.3 איתור של isoforms Splice שימוש מבחני qRT-PCR

  1. עיצוב פריימר
    הערה: זוגות פריימר צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת להגביר isoforms אחוי ברור. אקסון דילוג, אירוע שחבור החלופי הנפוצה ביותר שנצפה, מוצג כאן כדוגמא כדי להמחיש את האסטרטגיה של עיצוב פריימר. איור 1 א מציג מראש mRNA ארבעה אקסון, עם אקסון השלישי כאקסון משתנה. הכללת אקסון 3 תוצאות בהייצור של איזופורם אחוי יותר, ואילו דילוג של אקסון 3 יוצר איזופורם אחוי קצר יותר. Primers צריך להיות מתוכנן להבחין איזופורם כלול אקסון-3-ואיזופורם אקסון-3-לדלג עליו, וכדי לזהות את התמליל הכולל של mRNA זה.
    1. לצורך זיהוי של הכללת אקסון, לעצב בקפידה פריימר קדימה בתוך אקסון משתנה 3, ופריימר הפוכה בתוך אקסון המכונן הסמוך 4, המאפשר להגברה הספציפית של איזופורם-כלול אקסון משתנה. הקפד לא לתכנן שני קדימה לאחור פריימרים בתוך אותו אקסון משתנה על מנת להימנע ממוצרי PCR מוגברים מהדנ"א הגנומי או הרנ"א ראשוני.
    2. כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג אקסון, עיצוב אחד של פריימרים פורש הצומת של אקסון המכונן 2 ואקסון 4 שאחרת היה נהרס כאשר אקסון משתנה 3 כלול. עיצוב פריימר האחר בתוך אקסון המכונן .4 ככזה, מוצרי PCR נוצרים רק כאשר אקסון משתנה 3 הוא excludעורך ומכונן אקסון 2 ואקסון 4 לאחר מכן חברו יחד.
    3. כדי לזהות את התמלילים הכולל של הגן, עיצוב פריימרים בתוך שני אקסונים מכוננים 1 ו -2 וכך, מוצרי PCR הם מוגברים מכל isoforms.
    4. ודאו את טמפרטורת ההתכה (TM) עבור כל פריימרים הוא כ 55 ° C, לאורכו של כל צבע יסוד הוא כ 18-22 נוקלאוטידים, ואת הגודל של מוצרי PCR הוא בין 80 ו150 זוגות בסיסים.
  2. מיצוי RNA: חלץ RNA באמצעות כוללת ערכת בידוד RNA (ראה טבלה של חומרים).
    1. איסוף תאים ב350 מאגר תמוגה RNA μl.
    2. הוסף 350 μl של 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב.
    3. להעביר את המדגם לעמודת טיהור RNA.
    4. צנטריפוגה ב XG 10,000 דקות 1 וזרימה דרך קלפים שנזרקו.
    5. לשטוף את העמודה פעם אחת עם 500 μl שלי לשטוף חיץ RNA ופעמים עם חיץ לשטוף RNA II.
    6. הסר חיץ לשטוף RNA שיוריתהשני מהטור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות.
    7. העבר את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש, להוסיף מים nuclease ללא 50 μl במרכז מטריצת העמודה וelute RNA על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית.
  3. סינתזה של cDNA הראשון הגדיל
    1. קבע את הריכוז ואיכות של RNA על ידי מדידת ספיגת UV. הערה: RNA באיכות טובה צריכה יחס הספיגה / 280 ננומטר 260 ננומטר של כ 2.0.
    2. הגדר את תגובות טרנסקריפטאז (RT) המכילות 250 RNA ng סך הכל, 0.05 מיקרוגרם פריימרים hexamer האקראי, 50 pmol MgCl 2, 10 dNTP pmol, 2 μl 5 × חיץ GoScript, ואנזים RT μl 1 בנפח סופי של μl 20.
    3. לבצע תגובות RT ב42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ואחריו דגירה ב70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את אנזים RT.
  4. בזמן אמת PCR
    1. הגדרה 20 תגובות μl שמורכבות מתערובת הורים הירוקים SYBR 10 μl,.1-1.0 תבנית μl cDNA, וpmol 5 קדימה הפוך פריימרים.
    2. הפעל בזמן אמת PCR עם 40 מחזורים מהשלבים הבאים: 95 מעלות צלזיוס denaturation עבור 10 שניות, 58 ° C חישול עבור 10 שניות, ו60 ° C הארכה ל30 שניות. לבצע PCR תגובות בשלושה עותקים.
    3. בדקו עקומות דיסוציאציה ולוודא ששיא יחיד הוא ציין עבור כל קבוצת פריימר.
    4. השג את ערכי מחזור כימות (CQ) על ידי חישוב הערכים נגזרים השני של עקומות הגברה.
    5. לחשב את הכמות היחסית (RQ) של mRNAs היעד בדגימות מושרה בהשוואה למדגם uninduced באמצעות "דלתא הדלתא Cq (ΔΔCq) 'שיטה כפי שמוצג על ידי הנוסחא הבאה. השתמש בגני משק בית, כגון GAPDH או TBP, כנקודת התייחסות.

figure-protocol-1
כדי לחשב בצורה מדויקת יותר את הערכים יחסי של isoforms אחוי, tהוא משתמש בגני התייחסות מרובים, צריך להיחשב. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות שיטת כימות ערך המוחלט שונה שתוארה על ידי אל Pfaffl et 33,34.

.4 בחינת isoforms אחוי ברמת החלבון

  1. איסוף תאים ב100 חיץ Ripa קר כקרח μl.
  2. הגדר lysates על קרח למשך כ 10 דקות.
  3. צנטריפוגה ב XG 14,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, ולאסוף את supernatant.
  4. למדוד ריכוז חלבון על ידי מבחני ברדפורד.
  5. לדלל דגימות חלבון בחיץ טעינת SDS ולטעון 20-40 מיקרוגרם של חלבונים לתוך ג'לי SDS-PAGE 10%.
  6. הפעל ג'לי SDS-PAGE ב20 mA ל1.5 שעות.
  7. העברת חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ב85 V. התאם את זמן העברה על פי המשקל המולקולרי של חלבוני יעד.
  8. קרום בלוק ב5% חלב דל שומן ל30 דקות ל1 שעות ב RT.
  9. דגירה wi קרוםth נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 1: 200 ו1: 5,000, לקבוע את הדילול האופטימלי עבור כל נוגדן באופן ניסיוני. ניתן למצוא הדילול של נוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה ב" טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים ".
    1. כדי לזהות isoforms אחוי, להשתמש בנוגדנים ספציפיים שיכירו איזופורם מסוים. לחלופין, להשתמש בנוגדן שמכיר אפיטופ באזור אקסון המכונן הקידוד ולזהות isoforms אחוי בו זמנית המבוסס על גדלי החלבון השונים שלהם.
    2. בה בעת, לפקח EMT ידי immunoblotting לסמני EMT. השימוש E-cadherin, γ-catenin, וoccludin כסמני אפיתל, ופיברונקטין, N-cadherin וvimentin כסמני mesenchymal.
  10. פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T (50 מ"מ טריס, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) במרווח של 5 דקות.
  11. דגירה קרום עם נמלה משנית HRP-מצומדותibody בדילול 1: 10,000 לשעה 1 בRT.
  12. פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T במרווח 5 דק '.
  13. דמיין חלבון עם מערכת איתור chemiluminescence ולחשוף את הקרום לסרט autoradiography.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים שתוארו לעיל מספקים שיטה חזקה כדי לזהות שחבור חלופי במהלך EMT. תוצאות נציג של מיתוג איזופורם אחוי CD44 במהלך EMT-Induced טוויסט הן כדלקמן לדוגמא ירושלים.

EMT-Induced טוויסט בתאי HMLE / טוויסט-ER התאפיין במעבר ממרצפות כמו פנוטיפ אפיתל לפנוטיפ fibroblastic מוארך (איור 2 א), העדר סמני אפיתל E-cadherin, γ-catenin וoccludin ו גברת ביטוי של פיברונקטין סמני mesenchymal, N-cadherin, וvimentin

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי של שחבור חלופי במודל EMT מושרה. כשינויים כאלה, דינמיים ביטוי איזופורם אחוי יכולים לנפול בפח בכל המהלך של EMT הזמן. לשיטה זו יתרונות על פני השימוש בepithelial- שונה או שורות תאים המייצגים-mesenchymal להשוואה של שחבור חלופי בגלל רקע גנטי שונה משורות תאים הקשורים לבלתי יכול להשפיע יתר על המידה שחבור חלופי. עם זאת, האינדוקציה המוצלחת של EMT חייבת להיות מאושרת בזהירות באמצעות ניתן להסיק סמני EMT שונים לפני כל מסקנות על שינויים בשחבור חלופי. יתר על כן, בנוסף...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לוונשנג ליו על עזרתו שלא תסולא בפז בהדמיית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01 CA182467), האגודה האמריקאית לסרטן (RSG-09-252-01-RMC), קרן לין סייג' וקרן תקווה של אחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-hydroxytamoxifenSigmaH7904הכינו תמיסת מלאי על ידי המסת 4-hydroxytamoxifen באתנול ל-200 μM. שמור את התמיסה ב-20 ° C מוגן מפני אור.
E.Z.N.A. ערכת בידוד RNA כוללתאומגה ביו-טקR6731ערכת בידוד RNA כוללת
GoScript מערכת שעתוק הפוךPromegaA5001מגיב לבדיקת qRT-PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002מגיב לבדיקת qRT-PCR
LightCycler 480 בזמן אמת PCRRocheציוד לבדיקת qRT-PCR
נוגדן CD44מו"פ D SystemsBBA10דילול 1:1,000
נוגדן E-cadherinטכנולוגיית איתות תאים40651:2,500 דילול לאימונובלטינג; דילול 1:50 לאימונופלואורסצנציה
וגמא;-Catenin antibodyCell Signaling Technology23091:1,000 דילול
נוגדן אוקלודיןSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-55621:500 דילול
נוגדן פיברונקטיןBD Transduction Laboratories6100771:5,000 דילול
נוגדן N-cadherinTransduction Laboratories6109201:2,000 דילול
נוגדן וימנטיןNeoMarkersMS-129-p11:500 דילול
נוגדן GAPDHMilliporeCorporation MAB3741:10,000 דילול
Amasham ECL Western Blotting Detection ReagentGE Health Life ScienceRPN2209מערכת כימילומינסנציה
מערכת BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
  2. Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 14, 818-829 (2008).
  3. Yang, J., et al. a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 117, 927-939 (2004).
  4. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).
  5. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).
  6. Comijn, J., et al. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).
  7. Bolos, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).
  8. Eger, A., et al. DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells. Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).
  9. Shapiro, I. M., et al. An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype. PLoS Genet. 7, e1002218(2011).
  10. Warzecha, C. C., et al. An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition. EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).
  11. Brown, R. L., et al. CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression. J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).
  12. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  13. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  14. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).
  15. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell. 47, 277-284 (1986).
  16. Krangel, M. S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).
  17. Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse. Nature. 306, 756-760 (1983).
  18. Barbaux, S., et al. Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome. Nat Genet. 17, 467-470 (1997).
  19. Charlet, B. N., et al. Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell. 10, 45-53 (2002).
  20. Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature. 393, 702-705 (1998).
  21. Kohsaka, T., et al. Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome. Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).
  22. Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy. Science. 280, 737-741 (1998).
  23. Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet. 29, 40-47 (2001).
  24. Spillantini, M. G., et al. Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).
  25. Wang, J., et al. Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation. Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).
  26. Graubert, T. A., et al. Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 44, 53-57 (2012).
  27. Papaemmanuil, E., et al. Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts. N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).
  28. Yoshida, K., et al. Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia. Nature. 478, 64-69 (2011).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133, 704-715 (2008).
  30. Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition. J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).
  31. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).
  32. Zavadil, J., Bottinger, E. P. TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions. Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).
  33. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).
  34. Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8, R19(2007).
  35. Boutz, P. L., et al. A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons. Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).
  36. Salomonis, N., et al. Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).
  37. Calarco, J. A., et al. Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein. Cell. 138, 898-910 (2009).
  38. Grabowski, P. Alternative splicing takes shape during neuronal development. Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).
  39. Seol, D. W., Billiar, T. R. A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis. J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).
  40. Srinivasula, S. M., et al. Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis. Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).
  41. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications. Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).
  42. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37, 331-340 (2005).
  43. Cheng, C., Sharp, P. A. Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion. Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RT PCREMTCD44Twist

מאמרים קשורים