בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Summary

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים. כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

Abstract

מבני שסתומים נורמליים מורכבים משכבות מרובדות של מטריצה חוץ-תאית מיוחדת (ECM) המשובצות בתאי ביניים של שסתומים (VICs) ומוקפות בשכבה חד-שכבתית של תאי אנדותל שסתום (VECs). VECs ממלאים תפקידים חיוניים בביסוס מבני המסתם במהלך ההתפתחות העוברית, והם חשובים לשמירה על שלמות ותפקוד המסתם לכל החיים. בניגוד לאנדותל רציף על פני השטח של עלוני מסתמים בריאים, הפרעה ב-VEC נצפית בדרך כלל במסתמים לא תקינים והיא קשורה לתהליכים פתולוגיים המקדמים מחלות מסתמים ותפקוד לקוי. למרות הרלוונטיות הקלינית, מחקרים ממוקדים הקובעים את תרומתם של VECs להתפתחות ולתהליכי מחלה מוגבלים. בידוד VECs ממודלים של בעלי חיים יאפשר ניסויים ספציפיים לתא. VECs בודדו ממודלים בוגרים של בעלי חיים גדולים, אך בשל גודל האוכלוסייה הקטן, השבריריות והיעדר סמנים ספציפיים, לא דווח על בידוד VEC בעוברים או במודלים של בעלי חיים קטנים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בידוד ישיר של VECs מעכברים בשלבים עובריים ובוגרים. תוך שימוש במודל המדווח Tie2-GFP המסמן את כל תאי האנדותל עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הצלחנו לבודד תאים חיוביים (ושליליים) GFP מאזורי המסתם החצי-ירחי והאטריו-חדרי באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS). VECs מבודדים חיוביים ל-GFP מועשרים לסמני אנדותל, כולל CD31 ו-von Willebrand Factor (vWF), ושומרים על ביטוי תאי אנדותל בעת תרבית; בעוד שתאים שליליים ל-GFP מציגים פרופילים מולקולריים וצורות תאים התואמים לפנוטיפים של VIC. היכולת לבודד VECs עובריים ובוגרים של עכברים מאפשרת לבצע מחקרים מולקולריים ותפקודיים שלא היו ניתנים להשגה בעבר על אוכלוסיית תאי מסתם ספציפית, מה שישפר מאוד את ההבנה שלנו לגבי התפתחות מסתמים ומנגנוני מחלה.

Introduction

השסתום הבוגר מורכב משלוש שכבות מרובד של מטריצה ​​מיוחדת תאית (ECM) וביניהם תאי ביניים שסתום (Vics) ומארז ידי שכבה אחת של תאי שסתום לב האנדותל (VECs) ^1. התפקיד של ECM הוא לספק את כל המאפיינים ביומכנית הצורך להתמודד עם שינויים מתמידים בכוח המודינמית במהלך מחזור הלב. מחזור מסחר של ECM השסתום בשסתום המבוגר מוסדר בחוזקה על ידי Vics שהם במידה רבה שקטים ודמויים פיברובלסטים בהעדר המחלה. בנוסף לאוכלוסיית VIC, תאי שסתום לב האנדותל (VECs) יוצרים האנדותל ללא הפרעה על פני השטח של cusps השסתום ^2. למרות החשיבות של ECM וVics למבנה שסתום ותפקוד תוארה על ידינו ואחרים, התפקיד של VECs ידוע פחות. עם זאת, אוכלוסיית תאים קטנה יחסית זו היא קריטית להיווצרות שסתום בעובר, והוא מתואר כמתפקד בשסתוםמחלה.

היווצרות שסתום לב בעובר מתחילה כאשר תת קבוצה של תאי האנדותל באזורי תעלה ודרכי יצוא בין העליות וחדרים לעבור אנדותל לשינוי mesenchymal (EMT) ונפיחויות טופס הידוע כ כריות endocardial ^1,3. תאי מזנכימה הפכו עתה בתוך מבנים אלו מאוחר יותר להתמיין Vics ויוצרים את השסתומים הבוגרים. ברגע שEMT הוא מלא, תאי האנדותל המקיפים את הכריות, כינו VECs, יוצרים שכבת תאי האנדותל רציפה המגנה על הסתום הבוגר מפני פגיעה. בנוסף, VECs לחוש את הסביבה המודינמית והוכח מולקולריים לתקשר עם Vics הבסיסי להסדיר ECM הומאוסטזיס ^1,3. בשסתומים חולים, monolayer VEC מופר בשיתוף עם שינויים חריגים בארגון ECM וביומכניקה שינתה ^4,5. בנוסף, מחקרים במודלים של עכברים מראים כי בעיות בתפקוד VEC היא הסיבה הבסיסית של ד השסתוםisease ^1,6-9. כVECs לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות שסתום, תחזוקה, ומחלה, חשוב שאנו מגדירים באופן מלא פנוטיפים זמניים שלהם על מנת לקדם את התחום ולהבין את המנגנונים של מחלה.

העבודה קודמת על ידי מספר מעבדות הצליחה לבודד בהצלחה VECs מדגמים חזירי וכבש ^10-12. בשל גודלו הגדול של שסתומים האלה, בידודים דרך ו / או עיכול אנזימטי בניקוי, ואחריו במספר שיטות בידוד השונים כולל הפרדה מגנטית של תאי חרוז והרחבה משובט תא הבודד היה יעיל ליצור אוכלוסיות טהורות ^11-13. עם זאת, מודלים אלו יכולים להיות מגבילים בשל הביאור שלם של הגנום החזיר וכבשים המגביל את הזמינות של כלים מולקולריים, בנוסף לעלויות גבוהות. לכן ניסויים של חזירי וVECs כבש לאחר הבידוד יכולים להיות מגבילים. מודלים עכבר עדיפים בשל אפשרויות רבות לmanipula הגנטיtion וכלים מולקולריים בעובר והמבוגר, אך עד היום, לא בידודי VEC במודלים של בעלי חיים קטנים כבר דיווחו. זה כנראה עקב הקושי של עבודה עם דגימות רקמה קטנות הכוללות אוכלוסיית תאי מיעוט שכיום אין זהות ייחודית של סמני VEC ספציפיים, ובכך למנוע שיטות בידוד מבוסס נוגדנים.

במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה חדשה לבידוד ישיר של VECs העכברי בשלבים עובריים ובוגרים. פרוטוקול זה מנצל עכברי Tie2-GFP, אשר מבטאים GFP בכל סוגי אנדותל התא ונעשה שימוש נרחב ללמוד אוכלוסיות תאי אנדותל ^14. עם זאת, החידוש של המחקר הנוכחי הוא שעכברים אלה, בפעם הראשונה כבר נוצלו לבודד תאי אנדותל מהשסתומים. על ידי נתיחה מדוקדקת של רקמת השסתום וסדרה של תשעה digestions האנזימטית ואחרי מיון FACS, יכול להיות מבודד VECs ומשמש לניסיוני בטכניקות שונות בcluding מיצוי RNA ותרבות, ישירות הבא מיון.

Protocol

.1 הכנת הציוד ופתרונות

1. לעקר את הכלים לנתיחה - מספריים רקמה עדינים כדי לחלץ את לב מבוגר ו2 מלקחיים עדינים לנתיחה באזור מסתמית - ידי מעוקר במגש כלי מכוסה. תרסיס כלים עם 70% אתנול (EtOH) לפני לנתיחה.
2. הכן את כל הפתרונות באופן מיידי לפני הניסוי ולעקר פתרונות על ידי עובר אותם דרך מסנן 0.2 מיקרומטר סטרילי. שמור פתרונות על קרח עד לשימוש.
   1. סטרילי דיסוציאציה חוצץ (15 מ"ל בסך הכל / מדגם). לשלב 1.2 מ"ל IV collagenase, 300 טריפסין μl 2.5% ו150 סרום חומוס μl. תביא נפח עד 15 מ"ל עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS).
   2. סטרילי מיון חוצץ (12 מ"ל בסך הכל). לשלב 25 μl 0.5 חומצת M ethylenediaminetetraacetic (EDTA) וDNase μl 12 אני (RNase חינם). תביא נפח עד 12 מ"ל עם HBSS.
   3. VEC תרבות מדיה. Gro אנדותל Mixwth תקשורת על פי הוראות היצרן (ראה גיליון אלקטרוני חומר) על ידי הוספת רכיבי aliquoted מהערכה ל500 מ"ל של תקשורת EBM2.
   4. שלילית תרבות מדיה GFP (תקשורת מסוג תאים לא אנדותל). מערבבים 445 מ"ל של מדיום 199 1x עם 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) (1% ריכוז סופי) ו50 FBS מ"ל (10% ריכוז סופי).

.2 Dissection של האזור מסתמית מעכברים בוגרים וE14.5 עובר

• נהלי כל החיה אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות בית החולים למחקר מכון IACUC הילדים הארצית.
• עכברי Tie2-GFP נרכשו מג'קסון מעבדות (מספר מניות 003,658) ¹⁴ ונשמרו כגנוטיפים הומוזיגוטים על רקע FVB / N, ולכן להבטיח כי כל GFP המפורש מחוץ האביב בתאי האנדותל Tie2 חיובי.
• למיון FACS, להכין samp השלילי גיל מתאים אחדle שאינו מכיל GFP כגון C57 / BL6 לפרמטרים שנקבע שער GFP למיון FACS. הערה: פרוטוקול זה ותוצאות נציג מבוססים על שימוש בשלושה, עכברים בוגרים ארבעה בן חודש או המלטה אחת ביום עוברי (E) 14.5.

1. עכברים בוגרים: הקרבה על ידי CO ₂ אנוקסיה מייד לאחר, להשתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח בעדינות את חלל החזה ולחשוף את הלב וריאות. ברגע שנחשף, אחיזת הלב עם מלקחיים בעורקים הגדולים ולהתרחק מהגוף. הסרה של רקמת ריאה, אם בשלמותה, ואת לבם מקום בHBSS הקר כדי לשטוף. הסר את החדר ולהתרחק אטריה עוזב 'הזירה' התעלה בין העליות וחדרים ואזורי אב העורקים ללא פגע. לעשות חתך אחד למטה בצד של תעלה בין עליות וחדרים כדי לפתוח את 'הזירה' ולחשוף את המבנים מסתמית. הסר את שריר הלב ואזורי אב העורקים הפרוקסימלי בעדינות על ידי מתגרה משם עם מלקחיים. זהה את עלוני שסתום כמו רקמה לבנה, צפופה מעל שריר הלב הוורוד. בעדינות DETACH tendinae chordae מהשסתומים בין העליות וחדרים ולהסיר כמה שיותר שריר הלב שנותר ככל האפשר. היה זהיר שלא למשוך או לגרד את עלוני שסתום במהלך תהליך זה מאז VECs ניתן וחילצה. הנח אזורים מסתמית גזוזות בצינור 1.5 Eppendorf מ"ל המכיל 1 מ"ל HBSS ולשמור על קרח. הערה: לנתיחה זהירה היא קריטית לחיסול תאי האנדותל אינו מסתמית שיכול לזהם את הדגימה.
2. עוברים: קורבן נקבות עכברים 14.0 ימים לאחר תקע ההזדווגות הוא ציין (בבוקר של תקע הזדווגות = 0.5 ימים).
   1. מייד לאחר הקרבה, לנתח את הרחם (המכיל עובר) ולשטוף בHBSS הקר. לנתח את עוברים בודדים מהרחם ולהסיר את שק החלמון העוברי המקיף את כל עובר. הסר את הלבבות מכל אחד מהעוברים ובצעו את שלב 2.1. (הערה: לוחץ בעדינות את העובר עם מלקחיים ממש מתחת לאיברים העליונים אמורים לעזור כדי לחשוף את הלב ולעשות הסרה קלה יותר.)

3. דיסוציאציה תא והכנה לFACS

1. בעזרת הטיפים פיפטה סטרילית, להסיר HBSS מצינור Eppendorf המכיל את האזורים מסתמית.
2. החלף עם חיץ ניתוק 1 מ"ל ואני DNase 4 μl
3. סובב את הצינורות ב37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
4. פיפטה מעלה ומטה 3 פעמים ואז לתת לי המדגם להסתפק 15 שניות. לאסוף את supernatant (המכיל את התאים ניתק) לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
5. כדי לעצור את תגובת collagenase, להוסיף 125 μl של סרום סוס לצינור האיסוף. שמור צינור איסוף על קרח.
6. חזרו על שלבי ניתוק (3.2-3.5) תשע פעמים כדי לאסוף תשעה שברים של supernatant.
7. להעביר את אוסף fractioned דרך מסנן ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור איסוף חדש כדי להבטיח השעיה תא בודדת על ידי הסרת כל פסולת וגושים.
8. ספין ההשעיה ב400 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
9. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל מיון הצפת ולשמור על קרח עד FACS.

.4 FACS מיון VECs GFP החיובי

1. קבע שערים לקדימה ופיזור בצד להוציא פסולת וללכוד תאים בודדים; לא לכלול כפילויות באמצעות gating אפליית כפיל. רשום את מדגם ביקורת השלילי ולהגדיר הגדרות שער כדי להשוות ולהגדיר במדויק את אוכלוסיית תאי GFP החיובי במדגם Tie2-GFP.
2. לנתח תאי GFP חיוביים באמצעות FACS ולחדד את הגדרות שער.
3. מיין המדגם וTie2-GFP לאסוף שני תאי GFP החיובי וGFP-שלילי. אם תאים ישמשו להפקת RNA, סוג ישירות למאגר המיון. לתאי תרבות אחרי FACS, לאסוף תאי GFP חיוביים בצינור סטרילי המכיל 1 מ"ל תקשורת VEC עם 1 FBS מ"ל, ולאסוף תאים שליליים GFP ב 1 מ"ל של תקשורת הלא אנדותל עם FBS 1 מ"ל. השתמש 50% שילוב סרום מדיה / 50% זה כדי לשפר את כדאיות תא. שמור על קרח עד לניתוח שלאחר FACS.

.5 ההודעה FACS Analysiשל

1. הפקת RNA:
   1. מייד לאחר FACS, תאים חיוביים ושליליים GFP צנטריפוגות ב 1,500 XG במשך 8 דקות.
   2. פיפטה בזהירות את supernatant (חיץ מיון) וזורקים.
   3. Resuspend התא גלולה (גלולה אינה גלויה לגודל המדגם המומלץ כאן) ב200 μl Trizol.
   4. להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס או להתחיל מיצוי פנול, כלורופורם סטנדרטי לבודד mRNA כולל, כפי שתואר בעבר על ידי המעבדה שלנו ^15.
   5. השתמש 50-200 ng של רנ"א לסינתזת cDNA באמצעות Mastermix על פי הוראות היצרן.
   6. cDNA בכפוף להגברת PCR כמותי באמצעות בדיקות IDT Primetime qPCR נגד סמני תא האנדותל עכבר (CD31, פון Willebrand פקטור (vWF)), סמני תא ביניים שסתום (אקטין שריר α-חלק (α-SMA), Periostin (Postn)), myocyte סמנים (Mhc6, Mhc7) וGAPDH.
2. Culturing Murine VEC:
   1. לאחר מיון FACS וגביית תא (שלב 4.3), תאי צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות.
   2. זהירות פיפטה את supernatant (מיון החיץ + מדיה) וזורקים.
   3. Resuspend גלולה GFP חיובי התא ב1 מ"ל של תקשורת VEC וגלולה GFP-שלילי ב 1 מ"ל תקשורת הלא אנדותל.
   4. צלחת מדגם זה ובאחד משקופיות קאמריות פלסטיק ולגדול עד מחוברות. תרבות כ 1 שבוע לתאים שליליים GFP להפוך מחוברות ויותר מ -2 שבועות לתאי GFP חיוביים להפוך מחוברות (ממדגם של 3, עכברים בוגרים). שינוי בתקשורת בכל יומיים.
3. מכתים Immunofluorescent:
   1. הסר את המדיה מהתאים ולתקן paraformaldehyde 4% (PFA) ל30 דקות ב RT. שטוף תאים קבועים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד בפתרון בופר פוספט (PBS).
   2. הסר בארות קאמריות משקופיות ולחסום ב5% בסרום שור אלבומין / 1x PBS עבור שעה 1 ב RT.
   3. דגירהשקופיות O / N ב 4 ° C. עם נוגדנים ראשוניים (CD31, 1: 1,000 או אקטין α-שריר החלק (α-SMA), 1: 100). לשטוף 3x עבור 5 דקות בPBS.
   4. לדלל את הנוגדנים משני (Alexa פלואוריד 568 עז אנטי העכברוש) 1: 400 בPBS, להוסיף לשקופיות, ודגירת שעה 1 בRT. שקופיות לשטוף 3x עבור 5 דקות בPBS.
   5. ההר בVectashield המכיל DAPI דגירה שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס לפני הצפייה.

Results

תאי Tie2-GFP שיתוף למקם עם סמני תא האנדותל במסתמי לב העובריים ובוגרים.

על מנת לאשר את הספציפיות של ביטוי Tie2-GFP בVECs מעכברים עובריים ובוגרים, immunofluorescence בוצע על מנת לקבוע שיתוף לוקליזציה עם סמן תא אנדותל, CD31 בסעיפי רקמות הוכנו מE14.5 והמבוגר בן 3 חודש Tie2-GFP עכברים תוך שימוש בשיטות שפורסמו בעבר על ידי המעבדה שלנו ^16. כפי שניתן לראות באיור 1, GFP שיתוף מפורש VECs (איור 1, B, E, F) וCD31 (איור 1 C, D, E, F) בשני המבוגרים (איור 1 B, D, F) ועוברי ( איור 1, C, E) שלבים, ולכן אימות המודל שלנו לבידוד VEC שלאחר מכן.

ניתוח FACS זיהה אוכלוסיות תאי GFP חיוביות וGFP-שלילי מובהקות במסתמי לב עובריים ובוגרים מבודדים מעכברי Tie2-GFP.

t הפראיעכברי ype C57 / BL6 שמשו לפרמטרים שנקבעו GFP וכ -2% מתאים מגודרת יחידים מעכברי Tie2-GFP להראות העשרה משמעותית בתאי GFP החיובי על ידי ניתוח FACS בשתי דגימות עובריים ובוגרות (איור 2). בהתבסס על מחקרי שיתוף לוקליזציה שמוצגים באיור 1, תאים אלה נחשבים VECs ולהניב ממוצע של 61800 תאים בסך הכל (דוגמאות נעות בין 39,000-77,000 תאים / מדגם) בדגימות מבוגרות (n = 3), ו8,928 תאים (8,015- 11,000 תאים / המלטה) מהמלטה אחת E14.5 עובר.

ניתוח PCR מאשר העשרה של סמני תא האנדותל בGFP חיובי תאים ותא סמני ביניים שסתום בתאי GFP-שלילי המבודדים מעכברי Tie2-GFP.

ניתוח ביטוי גנים של אוכלוסיות תאים חיוביות ושליליות GFP על ידי FACS הבא qPCR להראות פרופילים מולקולריים שונים. בהשוואה לאוכלוסיות תאים שליליים GFP המבודדים מעוברי Tie2-GFP וadults, תאי GFP חיוביים מועשרים לביטוי של CD31 אנדותל סמני תא וvWF, (איור 3). יתר על כן, ביטוי של סמני myocyte (Myh6, Myh7) באוכלוסיות תאים אלה הוא נמוך מאוד, מפגין זיהום מינימאלי של תאים שאינם אנדותל. בניגוד לכך, תאים שליליים GFP המבודדים ממבוגרי עכברי Tie2-GFP וE14.5 עובר מועשרים לסמני תא ביניים (ויק) שסתום, תאים חיוביים α-SMA ויחסיים Periostin (POSTN) לGFP. העשרה של סמנים אלה היא גבוהה יותר בתאים שליליים GFP המבודדים מדגימות E14.5 בהשוואה למבוגרים בשל פנוטיפ השקטים של Vics המבוגר וביטוי ולכן נמוך של סמנים הופעלו.

GFP חיובי תאים המבודדים מעכברים בוגרים Tie2-GFP יכולים להיות מתורבת במבחנה.

יכולת תאי תרבות GFP חיוביים ושליליים GFP המבודדים מדגימות מבוגרות נבדקה בסיסד על מורפולוגיה של תאים ומכתים immunohistochemical. תוך שימוש בפרוטוקולים שתוארו בעבר על ידי ¹⁷ אנו מראים באיור 4 שתאי GFP חיוביים להופיע בסיבוב במורפולוגיה (איור 4 א) וGFP שיתוף מפורש עם CD31 סמן תא אנדותל לאחר שבועיים בתרבות (איור 4C). בניגוד לכך, תאים שאינם אנדותל הם שליליים עבור GFP, להציג מורפולוגיה כמו mesenchymal-(איור 4) ולהביע את הסמן VIC α-SMA לאחר תשעה ימים (איור 4D).

.1 תאים Tie2-GFP חיובי איור שיתוף למקם עם CD31 במסתמי לב עוברי ובוגר. Immunofluorescence להראות קשר בין הביטוי של GFP (Tie2-) (A, B) עם סמן תא אנדותל, CD31 (C, D) ב שלעלוני eptal של שסתום צניפי בE14.5 (A, C, E) ומבוגרים (B, D, F) שלבים. אזור השסתום מודגש, C, E. (E, F) תמונות ממוזגות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתן לזהות 2 VECs Tie2-GFP חיובי איור על ידי FACS. בהשוואה לקבוצת ביקורת באותו גיל C57 / BL6 (A, C), שסתומים מבודדים מעוברי Tie2-GFP (B) ומבוגרים (D) מכיל GFP- מובחן אוכלוסייה חיובית תא, כפי שצוין בירוק. אירועי GFP-שלילי, מוצגים באדום נאספו כביקורת. מספרים ב( B) ו( ד ') מצביעים על% הממוצע של GFP-pתאי ositive מהמספר הכולל של אירועים מסודרים על ידי FACS (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3 תאי GFP חיובי איור מועשרים לסמני תא האנדותל ואילו תאים GFP-שליליים מבטאים גנים הקשורים לתאי ביניים שסתום. נציג qPCR של סמני תא האנדותל (CD31, פון Willebrand פקטור (vWF)) ומבוגרים (Myh6) ועובריים ( Myh7) סמני myocyte בGFP חיובי התאים המבודדים מאזורים מסתמית של E14.5 () ומבוגרים (B) עכברי Tie2-GFP. העשרת הערה של סמני תא האנדותל ורמות נמוכות מאוד של גנים הקשורים myocyte. (C, D) מקפלים צ'הnges בביטוי של סמני תא ביניים שסתום. α-SMA וPostn בתאי GFP-שלילי מבודדים מE14.5 (C) ומבוגרים (D) עכברי Tie2-GFP אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

.4 תאי Tie2-GFP חיובי איור לשמור על ביטוי של סמני תא האנדותל במבחנה. FACS בעקבות, GFP החיובי (A, C) ושלילי (B, D) אוכלוסיות תאים מעכברים בוגרים היו בתרבית עד מחוברות ובכפוף לשלב הדמיה ניגוד (A, B) וimmunostaining ניאון (C, D). GFP חיובי תאים לבטא CD31 (אדום) (ג) לאחר10 ימים של התרבות. בניגוד לכך, הביטוי של GFP לא זוהה באוכלוסיית התא השלילית, שמוכתמת חיובי עבור α-SMA, סמן של Vics מופעל (ד ').

Discussion

כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, שיטה חדשנית לבידודה של VECs העכברי העוברי ובוגרת מעכברי Tie2-GFP. בעוד קו עכבר זה נעשה שימוש נרחב לבידוד של אוכלוסיות תאי אנדותל, זה הדו"ח הראשון, המראה בידוד סלקטיבי של VECs. בשל שבריריותה של אוכלוסיית VEC, פיתחנו פרוטוקול מחמיר המאפשר בידוד תא בודד של GFP החיובי (ושלילי GFP) תאים מסתמי לב של עוברי עכברים ומבוגרים. בהשוואה לפרסום המקורי לשימוש בעוברים או באיברים שלמים מעכברי Tie2-GFP ^14, יש לנו מותאם צעדי collagenase ונתיחה מבוססים על השפע הנמוך של אוכלוסיית תאי אנדותל השבירה הזה כדי לבודד אוכלוסייה נבחרת של תאים.

בידודי VEC בעבר כבר דיווחו רק במודלים של בעלי חיים גדולים עם כלים גנטיים וbiomolecular מוגבלים. כלים אלה מבוססים היטב בעכברים, ולכן, ABIlity לבודד VECs העכברי מאפשר לקבוצה מורחבת של עיצובים ניסיוניים שישמשו לשסתום לב מחקר. לכן, יתרון משמעותי של גישה זו הוא כי ניתן לבודד VECs temporally מעכברים פראיים סוג, ומודלים של מחלת שסתום ופציעה. יתרון שני הוא שיכול להיות מבודד VECs ונותח כמעט מייד לאחר נתיחה, שימור דפוסי ביטוי שמשקפים את מצב in vivo בצורה מדויקת יותר. יתר על כן, פרוטוקול הבידוד די בכך כדי לחסל תרבית תאים להרחבת מספר ושינויי פנוטיפי לכן פוטנציאל הנגרמים על ידי הסביבה במבחנה מנועים.

למרות החידושים והטבות ניסיוניות של פרוטוקול זה, אנחנו מכירים בכך שמגבלות עדיין קיימות. ראשית, גודלה של אוכלוסיית VEC בתוך שסתומים עכבריים הוא מאוד קטן, ולכן, יש צורך בהמלטות עוברית מתוזמן מרובים על מנת ליצור RNA מספיק לניתוח ביטוי גנים. בעוד thiים ניתן להתגבר באמצעות מגדלים מרובים, עשוי להיות לכך השפעה על היישום של כמה כלי ניתוח שלאחר בידוד. מגבלה זו כבר אתגר במיוחד להקמת תרבויות ומחוברות של VECs GFP החיובי על מנת לבצע יותר ניתוחים מעמיקים של פנוטיפים VEC כוללים פרופילים מולקולריים ומבחנים פונקציונליים. לכן אנו מכירים בכך שלא כל הקשיים היו להתגבר על ידי הגישה שלנו, אבל זה שטח של עניין שאנו שואפים להתגבר.

גישה זו של בידוד VECs מאזורים מסתמית מציגה את האפשרות של זיהום מתאי העניבה-GFP -positive, שאינם מסתמית האנדותל של endocardium, או מבנים של כלי דם בתוך שריר הלב של החדר. נכון להיום, הבחנה מולקולרית של VECs מאוכלוסיות תאים אחרות לב אנדותל לא זוהתה. עם זאת אזור משפר של גן Nfatc1 זוהה ומוצג לתייג במיוחד VECs שלאעובר EMT, ולא אוכלוסיית תאי אנדותל אחרת בתוך הלב ^18. כמודל Cre (Nfatc1 ^enCre) זמין, מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הספציפיות של קו זה כדי להקטין את סיכוני זיהום. בנוסף לתאים חיוביים Tie2-GFP- לא מסתמית, תמיד יש את האפשרות של זיהום מmyocytes בנקודה שבי עלוני השסתום לצרף לאזור טבעתי של המחיצה וקירות שריר לב ציור קיר. במידע לא מוצג כאן, אנחנו בהתחלה החלו את הלימודים כדי לבודד VECs מאזורים מסתמית גזורים באמצעות חרוזים נוגדן מצומדות- מצופים באנטי-GFP ואנטי CD31. בעוד גישה זו הייתה מוצלחת לבידוד תאי האנדותל, שחווינו בצעדים כבדים תא משמעותיים מסוגים סמוכים, שאינו אנדותל תא ולכן Vics ותאי שריר לב מזוהמים מדגם הניסוי שלנו. זה כבר נמנע מלהשתמש בניתוח FACS כפי שנקבעו פרמטרים לבודד את ההשעיה תא בודדת בלבדים וניתוח PCR לזיהוי הביטוי של גני myocyte ספציפי שולט למגבלה זו (איור 3). בעוד הזיהום שלנו יכול להיחשב כמינימאלי, הוא נשאר מורכבות ניסוי פוטנציאליות אשר יכול להימנע בעתיד עם הבחירה הכפולה של GFP וסמנים פני תא ספציפי אנדותל.

שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו VECs המבודד בהצלחה מעכברים עובריים ובוגרים ודוגמאות הניתנות לאופן שגישה זו יכולה לשמש לבידוד RNA ותרבית תאים של אוכלוסיות תאים שליליים חיוביות וGFP GFP. עם זאת, גישה זו אינה מוגבלת ליישומים אלו וניתן להשתמש בו לשפע של גישות מולקולריות, תאיות ופונקציונליות. בנוסף, רקע Tie2-GFP ניתן התרבה ​​עם מודלים עכבר גנטיים שיאפשר למחקרים השוואתיים של אוכלוסיות VEC בבריאות ובחוליים. פיתוח מתודולוגיה רומן זה, בפעם הראשונה, לאפשר ללימודים ממוקדיםבחינת התרומה של VECs בפיתוח שסתום ותחזוקה ויכול לחשוף את מנגנונים שלא מעריכים את העבר של מחלת שסתום אנדותל תלוי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 568 עיזים נגד חולדות IgG (H+L)	Life Technologies	A-11077
70 μ m מסננת תאי ניילון	BD Falcon	352350
2.5% Trypsin	Invitrogen LT	15090-046
אלבומין סרום בקר (BSA), Fraction V, מטופל בהלם חום	Fisher Scientific	BP1600-100
CD31 נוגדן נגד עכבר עכברים	BD Pharmingen	553370
Chick Serum	Invitrogen LT	16110-082
קולגנאז IV	Invitrogen LT	17104-019	מוכן על פי הוראות היצרן
DNase I, ללא RNase (10,000 יחידות)	Roche	4716728001
EBM-2	Lonza	CC3156	למדיה VEC
EDTA, פתרון 0.5 M	Hoefer	03-500-506
EGM2 SingleQuot, Bulletkit	Lonza	CC-4176	עבור מדיה VEC
סרום בקר עוברי (FBS),	Hyclone	SH3007103IH
Hanks תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)	Life Technologies	14025-092
סרום סוסים	Invitrogen LT	16050-130
תנור היברידיזציה	VWR	230301V
בינוני 199 1X	Corning cellgro	10-060-CV
Paraformaldehyde 16% תמיסה EM כיתה	אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences	15710
עט/סטרפטוקוק	MP-Biomed	ICN1670049
Permanox שקופית תא סטרילית עם כיסוי	Thermo-Scientific	177429
מי מלח חוצץ פוספט, 1X	Corning cellgro	21-040-CV
PrimeTime Mini qPCR מבחן	DNA משולב טכנולוגיות	Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF
StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת	Applied Biosystems	4376600
SuperScript VILO Mastermix	Invitrogen LT	11755050
[header]
עכברי Tie2-GFP	מעבדות ג'קסון	3658
מלקחיים רקמות #5 11 ס"מ	Dumont	14096
Trizol	Ambion	15596018
α-SMA נוגדן נגד עכברים	Sigma-Aldrich	A2547
VECTASHIELD מדיום הרכבה קשיח עם DAPI	Vector Laboratories	H-1500