הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

16.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 בינואר 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

תקציר

ניתוח ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה והתפקוד של תאי עצב ביונקים לעתים קרובות דורש genotyping של בעלי חיים בודדים ואחרי הניתוח של תרבויות העיקריות של תאי עצב. אנו מתארים מערכת של נהלים ל: תיוג עכברי יילוד להיות genotyped, genotyping המהיר, והקמת תרבויות בצפיפות נמוכה של תאי עצב במוח מעכברים אלו. עכברים בודדים מסומנים על ידי קעקוע, שמאפשר זיהוי לטווח ארוך שנמשך לבגרות. Genotyping על ידי הפרוטוקול המתואר הוא מהיר ויעיל, ומאפשר להפקה אוטומטית של חומצות גרעין עם אמינות טובה. זה שימושי בנסיבות שבו זמן מספיק לgenotyping הקונבנציונלי אינו זמין, למשל, בעכברים הסובלים מהקטלניות בילוד. תרבויות עצביות עיקריות נוצרות בצפיפות נמוכה, המאפשרת ניסויי הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיטת תרבות זו דורשת ההכנה של שכבות מזין גליה לפני ציפוי עצבי. Protocol מיושם במלואו למודל עכבר של דיסטוניה DYT1 הפרעת תנועה (העכברים לדפוק בΔE-torsinA), ותרבויות עצביות מוכנות מן ההיפוקמפוס, קליפת המוח וסטריאטום של עכברים אלו. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכברים עם מוטציה גנטית אחרת, כמו גם לבעלי חיים ממינים אחרים. יתר על כן, רכיבים בודדים של הפרוטוקול יכולים לשמש למשנה פרויקטים בודדים. כך פרוטוקול זה יהיה יישומים רחבים, לא רק במדעי המוח, אלא גם בתחומים אחרים של מדעים ביולוגיים ורפואיים.

מבוא

מודלים של מכרסמים של מחלות גנטיות הוכיחו שימושיים בהקמת הפונקציות הפיזיולוגיות של חלבונים וחומצות גרעין נורמלים, כמו גם את השלכות pathophysiological של פגמים באלה. דוגמאות כוללות עכברים חסרים לחלבונים מעורבים בתפקודים תאיים מפתח, כמו גם מודלים של עכברים של הפרעות כגון מחלת אלצהיימר. עם זאת, מניפולציות גנטיות מסוימות יכולות להוביל לקטלני בילוד זמן קצר או כמה ימים לאחר לידה. במקרים אלה, תרביות תאים עיקריות הן כלי חשוב, כי ניתן להשיג תאי חיים מהגורים העובריים או ילוד לפני המוות, הם יכולים להישמר במשך לפחות כמה שבועות במבחנה, ובמשך הזמן הזה התפתחות עצבית מוקדם יכולה להיות מלווה ב ניסויים ביוכימיים, פונקציונליים וצורניים. לתרבויות העיקריות, זה יכול להיות מועיל לצלחת הנוירונים בצפיפות נמוכה; זה עושה את זה אפשר לדמיין את somata הבודד, דנדריטים, פירי axonal וtermi עצבאלכסונים ברזולוציה מרחבית גבוהה. עם זאת, ההישרדות וההתמיינות של תאי עצב בצפיפות נמוכה בדרך כלל דורש כי הם מצופים בשכבת מזין גליה, שיתוף תרבותי עם תאי גלייה בהעדר המגע פיזי עימם, או בתרבית בינונית המותנה בגליה 1.

הקמת תרבויות עצביות בצפיפות נמוכה בשכבות מזין גליה יכולה להיות תלויה במהיר ואמין genotyping מראש - תוך כמה שעות בניגוד לכמה ימים. מהירות היא חשובה במיוחד כאשר גנוטיפ העצבי צריכה להיות מתאים לזה של שכבת מזין גליה מוכנה מראש. כדוגמא מעשית יותר, ייתכן שיהיה צורך להחליט איזה גורים שגנוטיפ להשתמש בתרבויות יצירה, כדי לייעל את היעילות של ניסוי.

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול עובד שהיה בשימוש כבר genotyping עכבר מהיר, פשוט ואמין בפרסומים קודמים 2-6. זנבות עכבר ומשמשות ערכה זמינה מסחרי. פרוטוקול זה כולל מיצוי בשלב יחיד של חומצות גרעין מהרקמות, ולא דורש צעד טיהור גרעין חומצה ולא שימוש במאגר סיום ("להפסיק פתרון '). האמינות של שיטת genotyping זה בא לידי ביטוי בהצגת התוצאות של סדרה של בדיקות, כאשר הבדלים הם הציגו ביחס לסכום התחלתי של הדגימות, גילם של בעלי החיים ואת אורכו של amplicons PCR. ערכה זו מציעה את היתרונות של מיצוי ואמינות אוטומטיים.

למען להיות מקיף, השימוש בקעקוע לזיהוי לטווח ארוך של עכברי genotyped הוא הוכיח גם. קעקוע מושגת על ידי החלת דיו קעקוע לדרמיס של העור (מתחת לאפידרמיס) 7. הליך מתואר לקעקוע כפות הרגלי של עכברים ילודים או יום 1 ישן, אם כי ניתן ליישם קעקועים לחלקים אחרים של הגוף, כגון זנבות ורגליים, ועניםals בכל הגילים. בנוסף, הליכים יהיו הפגינו לציפוי ונוירונים culturing עכבר בצפיפות נמוכה, המבוססים על הכנה מותאמת סוגים שונים של שכבות מזין גליה 2,8 של.

אנו משתמשים במודל גנטי עכבר של דיסטוניה DYT1 הפרעת נוירולוגית בירושה - הפרעת תנועה אוטוזומלית דומיננטית הנגרמת על ידי מוטציה בגן TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. החלבון המקודד, torsinA, שייך ל" ATPases הקשורים לפעילויות מגוונות סלולריות "משפחה של חלבונים (+ AAA), שחבריה בדרך כלל לבצע פעולות כמו מלווה-, סיוע ב: חלבון התגלגלות, פירוק חלבון מורכב, סחר בקרום, ואיחוי שלפוחית 10-13. תוצאות המוטציה במחיקה במסגרת של קודון לחומצה גלוטמית, ויכולות להוביל לתופעה של 'התחלה המוקדמת של כללי דיסטוניה המבודדת' 14,15. עם זאת, בדרךמנגנוני ophysiological אחראים להפרעה זו יישארו הבין היטב. במודל של עכברי נוק-ב, אלל מוטנטי הוא Tor1a tm2Wtd, ציינו להלן כTor1a ΔE. עכברי מטופלים אנושיים ברי-קיימא וגנטי לחקות עם דיסטוניה DYT1 הטרוזיגוטיים ΔE-torsinA בנוק-, ואילו הומוזיגוטים לדפוק בעכברים למות לאחר הלידה 16,17, עם זמן האחזור למוות לאחר לידה מושפעת מרקע גנטי 18. המוות המוקדם של עכברים לדפוק בהומוזיגוטים מחייב ששני genotyping של בעלי חיים ואת הקמתה של תרבויות עצביות הושלמו במהירות. כדוגמא נוספת של גנוטיפ, Tfap2a (גורם שעתוק AP-2α, הפעלה משפר מחייב 2α חלבון) ישמשו. החלבון מקודד על ידי הגן הזה הוא חשוב בויסות תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, בידול, הישרדות ואפופטוזיס 19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: נהלי כל החיה שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת איווה.

זיהוי 1. לטווח ארוך של עכברים באמצעות קעקוע רפידות Paw

  1. לשתק כפה עם כרית כף הרגל (plantar המשטח) מול הנסיין. החזק את כף הרגל עם האגודל ואצבע המורה. היזהר שלא לצבוט את הכף.
    הערה: הקיבוע יציב חשוב לוודא כי פיגמנט הקעקוע ממוקם לתוך הדרמיס של כרית כף הרגל, ובכך הוא קבע 7.
  2. ספוגית כרית כף הרגל עם אתנול 70% על ספוג גזה או ספוגית.
  3. החלת שמן עור למוליך כותנה שקצה, ולחץ בעדינות את הקצה נגד פני השטח של כמה פעמים כרית כף רגל. השתמש רק כמות קטנה של שמן לעור; כאשר קיימים בכמויות גדולות, זה ימנע פיגמנט הקעקוע מלהגיע העור.
  4. טובלים את קצות מחטי הקעקוע לתוך דיו הקעקוע רק לפנילקעקוע. השתמש נקייה, ספטית ומחטים קעקוע חדות, כדי להקטין את הכאב ואת האפשרות של זיהום, וגם כדי להגביר את יעילות הקעקוע.
  5. בעוד משטח כרית כף הרגל מכוסה בעור השמן, לחץ על הטיפים מחט קעקוע בצורה אנכית וקל על העור במרכז כרית כף הרגל, ולהזריק את הדיו מספר פעמים. ראה טבלה של חומרים / ציוד לקבלת מידע על מערכת קעקוע חשמלית.
  6. תרסיס אתנול 70% על ספוג גזה, לחץ בעדינות עליו מפני הכפה כדי להסיר קעקוע פיגמנט נוסף על פני העור, ולבדוק את האיכות של קעקוע. בדוק שאמצע כרית כף רגל יש כתם כהה, עגול שונים מפיגמנטציה של עור רגילה. אם הקעקוע הוא לא אפל או גדול מספיק כדי להקל על צפייה, חזור על שלבי קעקוע לפני.

2. עכברים Genotyping יילוד באמצעות ערכת PCR Genotyping מהירה

  1. לחטא את הקצה הדיסטלי של זנב עכבר עם 70% אתנול, לחתוך 5 מ"מ או פחות של הזנבלהטות ולהעביר אותו לצינור של רצועת 8-צינור מהסוג המשמש לPCR. השתמש בסכין גילוח אינו בשימוש לכל גור, כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות. לחלופין, להשתמש במספריים, אבל במקרה הזה, בזהירות וביסודיות להסיר את הרקמה שנותרה על הלהבים באמצעות אתנול 70%. בדוק לדימום. אם דימום מתרחש, להפעיל לחץ על החלק החתוך של הזנב עם ספוג גזה עד דימום הפסק.
  2. הוסף 200 μl של הפקת DNA פתרון לכל צינור PCR המכיל את הדגימה. ראה טבלה של חומרים / ציוד להרכב שלה ומידע על הערכה.
  3. הנח את רצועת הצינור לתוך Cycler תרמית PCR, ולהתחיל את מיצוי DNA באמצעות התכנית הבאה: מחזור 1 ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ומחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: זוהי אותה Cycler תרמית PCR ששמשה מאוחר יותר לPCR.
  4. לאחר מיצוי DNA נגמר, להסיר את רצועת הצינור מCycler התרמיתnd להפוך 5 פעמים.
  5. העברה 4 μl של הפתרון (תמצית ה- DNA) של כל דגימה לצינור של רצועת 8-צינור, ומערבבים עם אינו בשימוש: 10 μl של 2X PCR מוכן Mix II, 2 μl מעורב קדימה ולהפוך פריימרים (מומלץ ב 0.5 מיקרומטר; ראו טבלה של חומרים / ציוד לרצפים), ו -4 μl של H-חופשי nuclease 2 O, עבור כל דגימה. בקצרה ספין (לדוגמא, 3 שניות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. שמור את הצינורות על קרח בכל העת למעט בעת הטיפול.
  6. לבצע רכיבה תרמית. ראה שולחן של חומרים / ציוד לתכנית התרמית.
  7. לזהות את מוצרי DNA מוגברים. טען את הפתרון הכולל תגובה מ( μl 20) PCR ישירות לתוך באר של ג'ל agarose. טען את סמני משקל המולקולריים לתוך באר נפרד. החל שדה חשמלי.
  8. לרכוש תמונות הקרינה של הלהקות באור אולטרה סגול.

3. יסודי תרבות של עכבר המוח Neuronים על שכבת מזין גליה

הערה: ההליכים לנתיחה המוח והתא דיסוציאציה (3.1) משותפים לכל הנהלים שלאחר מכן. הנהלים לתרבויות גליה עכבר (3.2), תרבויות גליה חולדה (3.3), ותרבויות עכבר עצביות (3.4) מתוארים בנפרד לאחר מכן.

  1. מוח Dissection והסלולרי Dissocaiation
    1. להקריב את גור עכבר או עכברוש אחד על ידי עריפת ראש, במהירות להסיר את המוח, ולמקם אותו לתוך הפתרון "הנקס (ראה טבלה 1 לרכב) + 20% בסרום שור עוברי (FBS) בצלחת 35 מ"מ (כל הזמן על קרח).
    2. חותך את המוח דרך קו האמצע לשתי ההמיספרות. הסר את האזור של עניין (למשל, קליפת המוח, סטריאטום וההיפוקמפוס) מכל חצי הכדור של המוח. הסר את קרומי המוח וכלי דם גדולים מהמשטח. חותך את האזור במוח ל4-10 פרוסות דקות באמצעות סכין כירורגית.
    3. יש לשטוף את פרוסות המוח בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, פעם שנינות"הפתרון + 20% FBS, 3 פעמים ולאחר מכן עם הנקס 'h הנקס פתרון (כלומר, ללא סרום) (כל 4 ° C). כדי לשטוף, להוסיף פתרון מיליליטר 5-10, בואו מוח פרוסות להתיישב בחלק התחתון של הצינור, לשאוב את הפתרון מהחלק העליון, ולהוסיף פתרון טרי. לסיים את הליך השטיפה על ידי aspirating הפתרון.
    4. סנן 2 מיליליטר של פתרון העיכול המכיל טריפסין (ראה טבלה 1 לרכב) באמצעות מזרק 3 מיליליטר ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לתוך הצינור המכיל את פרוסות המוח. בואו trypsinization להמשיך במשך 13 דקות ב RT.
    5. לנטרל את פתרון טריפסין הראשון על ידי aspirating ביותר שלו ולאחר מכן על ידי הוספת 7-10 מיליליטר של התמיסה 'הנקס + 20% FBS (4 ° C).
    6. יש לשטוף את פרוסות המוח, פעמיים עם הנקס 'FBS + 20% הפתרון, ולאחר מכן שלוש פעמים עם הנקס' פתרון (כלומר ללא סרום) (כל 4 ° C). לסיים את הליך השטיפה על ידי aspirating solutיון.
    7. סנן 2 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה (ראה טבלה 1 לרכב) באמצעות מזרק 3 מיליליטר ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לצינור עם פרוסות המוח.
    8. מכאני לנתק את התאים בעדינות על ידי triturating 10-20 פעמים, עד שפיסות רקמה גלויות תיעלם. השתמש ב, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה ולהימנע מבועות במהלך טחינה דקה.
    9. חכה 3 דקות לחתיכות קטנות להתיישב.
    10. העבר את רוב הפתרון (~ 1.5 מיליליטר, והותרתי חלק מפתרון בתחתית) לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגה המכיל פתרון FBS + 20% 3 מיליליטר הפתרון "הנקס (4 מעלות צלזיוס), באמצעות פקוק כותנה, Fire- פיפטה פסטר המלוטשת. לא להעביר את כל הפתרון, כי ההכללה של משקעים בתחתית בדרך כלל תוצאות הידרדרות של התרבות.
    11. צנטריפוגה למשך 13 דקות ב ~ 185 גר '(~ 1,100 סל"ד) בשעה 4 ° C.
    12. לשאוב supernatant בעדינות,להוסיף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני (37 ° C) לגלולה, וresuspend זה בעדינות על ידי pipetting מספר פעמים באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה מראש חימם.
      הערה: שלושה סוגים שונים של ציפוי תקשורת המשמשים למטרות תרבות שונות: ציפוי בינוני-1 לתאי גליה עכבר, ציפוי בינוני 2 לנוירונים עכבר, וציפוי בינוני-3 לתאי עצב חולדה ותאי גליה (ראה טבלה 1 ליצירות) .
    13. להוציא 10 μl של ההשעיה התא, לערבב אותו עם 10 μl של פתרון trypan הכחול 0.4%, ולמדוד את הצפיפות של תאי חיים, או באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
  2. תרבויות עכבר גליה
    1. שטוף את coverslips כדי לעזור להקים תרבויות בריאים של תאי עכבר.
      1. לטבול את coverslips זכוכית (עגול, קוטר 12 מ"מ) ב- 70% חומצה חנקתית בצלחת פטרי מזכוכית. להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום, ומניח אותו על שייקר O / N מסלולית.
      2. יש לשטוף את coversli הזכוכיתלפחות שלוש פעמים ps בצלחת פטרי עם מים מזוקקים. לטבול אותם במים מזוקקים. מניחים את הצלחת על N / O ייקר מסלולית.
      3. יבש coverslips על נייר סינון 150 מ"מ Whatman בארון הבטיחות הביולוגי.
      4. החיטוי coverslips.
      5. מניחים את coverslips לתוך צלחת תרבות 24 גם.
    2. עכברים שזה עתה נולד לייבל וגנוטיפ לפי שלבי 1 ו -2.
    3. השג את תאי המוח מגורי העכבר, על פי שלב 3.1.
      הערה: השימוש בקליפת המוח אופייני להכנת שכבת מזין גליה עכבר. עם זאת, אזורים אחרים במוח, כגון ההיפוקמפוס וסטריאטום, יפעלו לאחר התאמה נכונה של צפיפות תאים עקב מספרים ותשואות של תאים מאזורים שונים.
    4. להוסיף ~ 4 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-1 להשעית התא הסופית (~ 1 מיליליטר). לתקשורת ותרבות התחממות מראש, הנח את הפתרון בחממת התרבות (5% O CO 2 -95% 2, 37 ° C) O / N, ללאפשר ערכי הטמפרטורה ו- pH לייצב.
    5. מעביר את ההשעיה התא לבקבוק תרבות T25 ללא ציפוי, באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה. מניחים את הבקבוק בחממת התרבות.
    6. ביום 1 במבחנה (DIV), לשטוף את התאים בתרבית בבקבוק T25 פעמיים עם ציפוי בינוני-1 (4 ° C). מניחים את הבקבוק בחזרה לתוך החממה. לבצע שטיפה על ידי aspirating הבינוני בתוך הבקבוק עם טפטפת פסטר לחלוטין, והוסיף ~ 5 מיליליטר של מדיום חדש והטה את הבקבוק מספר פעמים בתנועות סיבוביות.
    7. ב6-9 DIV, (כלומר, יום אחד לפני trypsinization וציפוי על coverslips, בצעדי 3.2.8-3.2.13), מקומו של חומר הציפוי 100 μl עם חלבוני מטריצה ​​תאיים (ראה טבלה של חומרים / ציוד להערות על חומר הציפוי) על coverslips הזכוכית בצלחת תרבות, והנח את המנה התרבות בחממת התרבות.
    8. ב7-10 DIV, כאשר התאים 20-4מחוברות 0% (מרחבית רציפה), trypsinize.
      1. יש לשטוף את הבקבוק פעם אחת, על ידי aspirating כל הפתרון בתוך הבקבוק וההוספה ~ 13 מיליליטר של התמיסה "הנקס (4 ° C), בעדינות להטות את הבקבוק מספר פעמים בתנועות סיבוביות, ולשאוב את הפתרון לחלוטין.
      2. הוסף 40 μl של פתרון DNase (ריכוז סופי, 750 יחידות / מיליליטר) ל -4 מיליליטר פתרון טריפסין-EDTA, להעביר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לתאי הבקבוק.
      3. בואו trypsinization להמשיך במשך 13 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה.
      4. לנטרל את פתרון טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של 100% FBS (4 ° C) לבקבוק.
      5. להעביר את תאי trypsinized לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגה באמצעות 5 לפיפטה 10 מ"ל, להוסיף ~ 4 מיליליטר של התמיסה 'הנקס + 20% FBS (4 ° C), צנטריפוגות ב ~ 185 גר' ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 13 דקות , ולשאוב supernatant.
    9. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של טרום-warmeבינוני-1 ציפוי ד.
    10. למדוד את הצפיפות של התאים בהתאם לצעד 3.1.13.
    11. לשאוב את חומר הציפוי לחלוטין מcoverslips הזכוכית, וצלחת ~ 50 μl של תאי הגלית resuspended על coverslips.
      הערה: תאים אלה יקימו שכבת מזין גליה.
    12. מניחים את צלחת התרבות עם coverslips בחממה.
    13. 20-60 דקות מאוחר יותר, להוסיף 1 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-1 זה טוב, ומניח את הצלחת בחזרה בחממה. שים לב: בעוד בינוני הציפוי הוא הוסיף, זה יהיה מועיל להשתמש פיפטה נוספת לחץ כלפי מטה בפריפריה של coverslip (שבו אין תאים מצופים), כך שcoverslip לא יצוף במדיום.
    14. יום 1 DIV של שכבת גליה המזין (כלומר, על coverslip הזכוכית), להחליף את המדיום עם 1 מיליליטר של ציפוי מראש חימם בינוני-1, על ידי aspirating כל הפתרון בבאר ולאחר מכן למלא אותו במדיום חדש.
    15. ב2-3 DIV של שכבת מזין גליה כאשר cells הם 80-100% ומחוברות, להוסיף מעכב mitotic (10 μl מתערובת של 5-fluoro-2'-deoxyuridine + uridine; ריכוזים סופיים של 81.2 ו204.8 מיקרומטר, בהתאמה) זה טוב, לעכב שכפול הדנ"א, ולכן ל לדכא התפשטות גליה תאים.
    16. ב7-9 DIV, כאשר התאים% ומחוברות 90-100 (1-2 שעות לפני ציפוי הנוירונים בשכבת מזין גליה), להחליף את התרבות בינונית עם ציפוי מראש חימם בינוני-2 (37 ° C).
      הערה: נוירונים יהיו מצופים באותו היום, תוך שימוש בשלב 3.4.
  3. תרבויות עכברוש גליה
    1. מעיל בקבוק תרבות T25 עם אותו חומר הציפוי.
      הערה: זו היא הכרחית להסרת מאוחר יותר של תאים שאינם חסיד בשלב 3.3.5.
      1. להוסיף 2.0 מיליליטר של חומר הציפוי לבקבוק, ומניח את הבקבוק בחממת התרבות.
      2. לאחר 2-3 שעות, לשאוב את חומר הציפוי לחלוטין, כך שהרצפה של הבקבוק הופכת יבשה.
    2. השג את התאיםמגורי החולדה, על פי שלב 3.1.
      הערה: אזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס משמשת להכנת שכבת מזין גליה חולדה. עם זאת, אזורים אחרים במוח, כגון קליפת המוח וסטריאטום המוחי, יעבדו לאחר ההתאמה להבדלים בצפיפות תאים עקב מספרים ותשואות של תאים מאזורים שונים.
    3. להוסיף ~ 4 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-3 להשעית התא הסופית (~ 1 מיליליטר).
    4. מעביר את ההשעיה התא לתוך בקבוק תרבות T25 המצופה, באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה. מניחים את הבקבוק בחממת התרבות (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. ב2-3 DIV, כאשר תאים הם 20-40% ומחוברות, להסיר שאינם חסיד או חלש תאים חסיד, על ידי סגירת המכסה בחוזקה, לוחץ את הבקבוק במרץ ~ 10 פעמים, aspirating הפתרון, והוסיף 4-5 מיליליטר של ציפוי בינוניים-3 (ב 4 מעלות צלזיוס). חזור על תהליך זה פעם אחת. לבחון את התאים בתרבית על רצפת הבקבוק השלם (כגון,באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד) כדי לאשר כי אלו המופיעים עצביים (כלומר, אלה שעבורם השפה החיצונית של גוף התא מופיעה שלב בהיר) יוסרו לחלוטין. חזור על התהליך כמה שצריך כדי להסיר תאים אלה, ולאחר מכן להחזיר את הבקבוק לחממה.
      הערה: כוח ואת המספר הכולל של 'יקים' הנדרשים עשויים להיות שונה בין הנסיינים בודדים. הדבר החשוב הוא לא לשמור על המספר הכולל של יקים למספר קבוע, אבל כדי לוודא שתאים כמו נוירון בוטלו.
    6. ב6-8 DIV, כאשר תאים הם 90-100% ומחוברות, מעבר תאי גלייה ידי trypsinizing כמו בשלב 3.2.8.
    7. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), להעביר את תאי trypsinized לבקבוק T75 מצופה un, והתרבות ב החממה.
      הערה: תאי גליה עכברוש יהיה passaged פעמיים; בניגוד לתאי גליה עכבר arדואר passaged רק פעם אחת כי הם הופכים להיות לא בריאים לאחר מעברים מרובים. תאי גליה עכברוש יהיה passaged בצלוחיות T75 שאינם מצופים בכל חומר ציפוי. הציפוי מאפשר לתאי גליה העכברוש לגדול מהר מדי ויניבו הרבה תאי ריסי (תאי ependymal משוערים), שידרדרו את מצב התרבות העצבי מאוחר יותר.
    8. ב17-19 DIV של תרבות גליה בבקבוק (כלומר, 11 ימים לאחר passaging ויום אחד לפני trypsinization וציפוי על coverslips על ידי צעדים 3.3.9-3.3.14), מקומו של חומר הציפוי 100 μl על coverslips זכוכית רחוץ ( עגול, קוטר 12 מ"מ) בצלחת תרבות, והנח את המנה התרבות בחממת התרבות.
      הערה: לתרבויות גליה חולדה, הבדל לא היה שם לב בתוצאות התרבות עם או בלי לשטוף את coverslips.
    9. ב18-20 DIV של תרבות גליה בבקבוק (כלומר, 12 ימים לאחר passaging), להכין את שכבת מזין גליה ידי trypsinizing התאים בתרבית, על פי step 3.2.8.
    10. במהלך צנטריפוגה, לשאוב חומר הציפוי לחלוטין מcoverslips הזכוכית.
    11. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), ולמדוד את צפיפות התאים, על פי שלב 3.1.13.
    12. התאם את צפיפות גליה עד 10 4 תאים / מיליליטר בשידור חי, וצלחת של ההשעיה תא גליה 100 μl על coverslips הזכוכית המצופה.
      הערה: תאים אלה יקימו שכבת מזין גליה.
    13. מניחים את צלחת התרבות עם coverslips לתוך החממה ל20-60 דקות.
    14. הוסף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C) זה טוב, ומניח את הצלחת בחזרה בחממה.
    15. ב-3-4 DIV של שכבת מזין גליה, כאשר התאים על coverslip הם 40-80% ומחוברות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום הגידול מראש התחמם (ראה טבלה 1 לרכב) המכיל ציטוזין β-D-arabinofuranoside ( ARAÇ, ריכוז סופי של 4 מיקרומטר) כדי לעצור את התפשטות גליה תאים. נוירון צלחתים ב7-9 DIV של שכבת מזין גליה כאשר התאים 60-80% ומחוברות, באמצעות צעד 3.4.
  4. תרבויות עכבר עצביים
    1. עכברים שזה עתה נולד לייבל וגנוטיפ לפי שלבי 1 ו -2.
    2. השתמש בגורי העכבר לשלב 3.1.
    3. התאם את הצפיפות של השעיה לחיות תאים ל~ 2.0 x 10 5 מיליליטר תאים / באמצעות ציפוי בינוני 2 לציפוי בתאי גליה עכבר, או באמצעות מראש חימם ציפוי בינוני-3 לציפוי בתאי גליה חולדה.
    4. צלחת התאים בשכבת מזין גליה, על ידי הוספה בעדינות את ההשעיה התא הבינוני התרבות של כל אחד. הערה: הנפח של ההשעיה התא שיש להוסיף שייקבע על ידי מספר היעד של תאים בתרבות היטב. לדוגמא, צלחת ~ 60 μl של השעיה תא להשיג 12,000 תאים / טובה.
    5. שים לב שלא חלו שינויי פתרון נחוצים לאחר נוירונים הם מצופים. להיות זהיר, כדי למנוע אידוי של הפתרון מהבארות במהלך התרבות, על ידי humidifying o בתוךf תרבות החממה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדוגמא ליישום של פרוטוקול זה, תוצאות נציג מוצגות לתיוג עכברים על ידי קעקוע, genotyping אמין תחת תנאי ניסוי שונים, והקמת תרבויות עצביות עיקריות בשכבות מזין גליה.

קִעקוּעַ

יילוד גורים תויגו על כריות כף הרגל באמצעות מערכת קעקוע ("יילוד" באיור 1). התוויות נשארו גלויות לעין בשעה 3 שבועות ("3 שבועות בן") וגיל 32 שבועו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המובא כאן כולל נהלים לקעקוע לתייג / לזהות עכברים, לgenotyping עכברים מטיפי זנב, ולתאי עצב במוח עכבר culturing בצפיפות נמוכה. בסיבוב ניסויים באמצעות 6-8 גורים אחד, נהלים אלה בדרך כלל דורשים ~ 0.5 שעות, ~ 4 שעות ו~ 2 שעות, בהתאמה, על סך של 6-7 שעות. זה עושה את זה מעשי לניסוי אחד כדי להשלים את כל ההליכים הנדרשים מעת הלידה "הגורים לציפוי של תרבויות עצביות - בתוך פחות מיום עבודה אחד (למעט הכנה המוקדמת של שכבות מזין גליה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר (Zhengmin Huang) הוא נשיא EZ BioResearch LLC המייצרת ריאגנטים המתוארים במאמר זה.

תודות

המחברים מודים לחוקרים מאוניברסיטת איווה, לד"ר לואיס טסדור, אינס מרטינס ובוורלי דייווידסון על ההנחיות וההערות המועילות בנוגע לתרביות סטריאטליות, ולד"ר קארה גורדון, ניקול בודה ופדרו גונזלס-אלגרה על הסיוע והדיונים בגנוטיפ. אנו מודים גם לד"ר אריק ויאנד (מערכות זיהוי וסימון של בעלי חיים) על הערות מועילות בנוגע לקעקועים, ולד"ר שוטארו קטסוראביאשי (אוניברסיטת פוקואוקה) על הערות מועילות בנוגע לתרבות העכברים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי, משרד ההגנה (פרס תוכנית המחקר הרפואי W81XWH-14-1-0301), קרן המחקר הרפואי של דיסטוניה, קרן אדוארד מלינקרודט ג'וניור, הקרן הלאומית למדע וקרן וייטהול (NCH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריאגנטים
ניקויזיהוי וסימון בעלי חיים, בע"מNMCR3זה משמש לניקוי המחטים והמחזיק לאחר קעקוע.
סוכן ייבוש מכונהמערכות זיהוי וסימון בעלי חיים, בע"מNDAR4זה משמש לייבוש המחטים והמחזיק לאחר הניקוי.
Neonate Tattoo פיגמנט שחורמערכות זיהוי וסימון בעלי חיים, בע"מNBP01
מוליך הכנת עורמערכות זיהוי וסימון בעלי חיים, בע"מNSPA1Q-tip.
פתרון הכנת עורמערכות זיהוי וסימון בעלי חיים, בע"מNSP01מגיב זה מספק שכבה דקה של שמן המשפרת את יעילות הקעקוע ומונעת דהיית קעקוע, על ידי (מידע מהספק): 1) מניעת הכתמה זמנית של עור שאינו מקועקע, ובכך מאפשרת להעריך בקלות את איכות קעקוע כרית הכפות לפני החזרת הגור לכלוב הביתי שלו; ניתן לבלבל בין משטח העור המוכתם לעור המקועקע, 2) הפחתת נזק לעור במהלך הקעקוע – ריכוך העור ושימון המחט יסייעו למחט לחדור לעור מבלי לגרום נזק לעור, ו-3) מניעת כניסת חמצן מולקולרי לעור, ובכך להפחית את התגובות הדלקתיות למיני חמצן תגובתיים שיכולים להיווצר.
ריאגנטים
ערכת גנוטיפ PCR מהירה של רקמות/זנב EZ (פורמט צינור רצועה)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100צבע אדום נטען לאלקטרופורזה כלול בתמיסת 2X PCR Ready Mix.
תמיסת ליזיס רקמות AEZ BioResearch LLCG2001-100הכן תמיסת מיצוי DNA על ידי ערבוב 20 ומיקרו; l של תמיסת ליזיס רקמות A ו-180 ומיקרו; l של תמיסת ליזיס רקמות B לדגימה.
פתרון ליזיס רקמות BEZ BioResearch LLCG2001-100הכן תמיסת מיצוי DNA על ידי ערבוב 20 ומיקרו; l של תמיסת ליזיס רקמות A ו-180 ומיקרו; l של תמיסת ליזיס רקמות B לדגימה.
חומצה אצטית, קרחוניVWRBDH 3092
כיתה אופטימלית של אגרוז, כיתה ביולוגיה מולקולריתrpiA20090-500 אנו משתמשים בג'ל אגרוז 2% במאגר TAE המכיל את כתם הג'ל SYBR Safe DNA (מדולל פי 10,000) או אתידיום ברומיד (0.5 ומיקרו; גרם/מ"ל נפח ג'ל).
אתידיום ברומידSigma-AldrichE7637-1G
חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)FisherBP120-500
קצות פיפט מסוננים, ללא אירוסול, 0.1-10 ומיקרו; lדוט סיינטיפיק בע"מUG104-96RS השתמש בקצות פיפטה סטריליות וללא DNA, RNase ו-DNase. עבור כל השלבים הכרוכים ב-DNA, השתמש בקצות פיפטות מסוננות כדי למנוע זיהום צולב.
קצות פיפט מסוננים, קצות מסנן פרימיום, 0.5-20 ומיקרו; lDot Scientific IncUG2020-RSהשתמש בקצות פיפטה סטריליות וללא DNA, RNase ו-DNase. עבור כל השלבים הכרוכים ב-DNA, השתמש בקצות פיפטות מסוננות כדי למנוע זיהום צולב.
קצות פיפט מסוננים, טיפים לסינון פרימיום, 1-200 ומיקרו; lDot Scientific IncUG2812-RSהשתמש בקצות פיפטה סטריליות וללא DNA, RNase ו-DNase. עבור כל השלבים הכרוכים ב-DNA, השתמש בקצות פיפטות מסוננות כדי למנוע זיהום צולב.
סמן משקל מולקולרי, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001אנו משתמשים באחד משלושת סמני המשקל המולקולרי הללו.
סמן משקל מולקולרי, EZ DNA אפילו סולמות 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
סמן משקל מולקולרי, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
צינורות PCR, רצועות 8 צינורות עם מכסי כיפה עליונים מחוברים בנפרד, טבעי, 0.2 מ"ל USA Scientific1402-2900השתמש בצינורות סטריליים וללא DNA, RNase ו-DNase. קל לטפל ברצועה בעלת 8 צינורות ולקבץ את הדגימות מאשר צינורות בודדים.
צינורות PCR, Ultraflux Individual rpi145660השתמש בצינורות סטריליים וללא DNA, RNase ו-DNase.
Seal-Rite 0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה, טבעיUSA Scientific1605-0000השתמש בצינורות סטריליים וללא DNA, RNase ו-DNase.
כתם ג'ל DNA בטוח SYBR * ריכוז פי 10,000 ב-DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
פריימרים להגברת גן Tor1a ב-Δ עכברי E-torsinA 5 פריימרים אלה שימשו בריכוז סופי של 1.0 ננוגרם מיקרו; l (~0.16 & M) (התייחסות 2).
פריימרים להגברת הגן Tfap2a בעכברים5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (קדימה), 5'-CGT GTG GCT GTT GGT GCT GCT GAG GTA-3' (הפוך) למגבר 498 bp, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (קדימה), 5'-AGA CAC TCG TTT GGA GAT CAT TC-3' (הפוך) למגבר 983 bp, ו-5'-CAC CCT ATC AGG GGA CAA CTT TCG-3' (קדימה), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (הפוך) עבור מגבר 1990-BP. פריימרים אלה משמשים ב-0.5 ומיקרו-מ'.
ריאגנטים - תרבית
5-פלואורו-2&פריים;-דאוקסיורידיןסיגמא-אולדריץ'F0503-100MGראה סעיף הערות של אורידין למידע נוסף.
תוסף B-27GIBCO-Invitrogen17504-044
כלי תרבית תאים 35 x 10 מ"מ כלים,תאים353001
, T25, טיפול בתרבית רקמות, צוואר משומר, פקק אטם, 25 ס"מ2 אזור גידול, 70 מ"לבז BD353082
צלוחיות תרבית תאים, T75, טיפול בתרבית רקמות, צוואר משומר, כובע מאוורר, 75 ס"מ2 אזור גידול, 250 מ"לבז BD353136
צינור חרוטי, פוליפרופילן, 15 מ"לבז BD352095
שקופיות תא רוזנת (מונה מספרי תאים)GIBCO-InvitrogenC10312
ציטוזין ובטא;-D-Arabinofuranoside הידרוכלוריד (Ara-C הידרוכלוריד)Sigma-AldrichC6645-100 מ"ג
D-(+)-גלוקוז (דקסטרוז) נטול מים, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
צלחת, פטרי 100 x 15 מ"מPyrex3160-101
מים מזוקקיםGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUתמיסת המלאי מוכנה ב-1,500 יחידות/20 μ l = 75,000 יחידות/מ"ל במים מזוקקים.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובטGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 מ"ל
יחידת סינון PES מהירה, 250 מ"ל, ממברנה בקוטר 50 מ"מ, 0.2 ומיקרו; m גודל נקבוביותNalgene568-0020
יחידת סינון PES מהירה, 500 מ"ל, קרום בקוטר 90 מ"מ, 0.2 & מיקרו; m גודל נקבוביותNalgene569-0020
סרום בקר עוברי (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
כיסוי זכוכית, 12 מ"מ עגול, עובי 0.09– 0.12 מ"מ, מס' 0קרולינה633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
מלחים מאוזנים של הנקססיגמא-אולדריץH2387-10X
HEPES, ≥ 99.5% (טיטרציה)סיגמא-אולדריץ'H3375-250G
חומצה הידרוכלורית, 37%, מגיב ACSסיגמא-אולדריץ'258148-100 מ"ל
אינסוליןסיגמא-אולדריץ'I5500-250 מ"ג
מגנזיום סולפט הפטהידרט, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99.5% (פלוקה)סיגמא-אולדריץ'63138-250G
תמיסת מטריצת ממברנת מרתף של מטריג'ל, פנול ללא אדוםBD Biosciences356237זהו חומר הציפוי לכיסויים וצלוחיות. 1) כדי להכין אותו, יש להפשיר את תמיסת מטריצת ממברנת המרתף של מטריג'ל על קרח, מה שבדרך כלל לוקח ~ יום אחד. בעזרת פיפטה מקוררת מראש, יש להוציא את התמיסה המופשרת לצלוחיות T25 מקוררות מראש על קרח, ולאחסן את הצלוחיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תמיסת המטריגל העובדת, יש להפשיר את המטריגל המוזכר בבקבוק על קרח, לדלל פי 50 על ידי הוספת תמיסת MEM מקוררת מראש ולשמור על התמיסה המדוללת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חשוב לקרר מראש את כל כלי התרבות והמדיה שבאים במגע עם Matrigel, למעט במהלך ואחרי ציפוי הכיסויים, כדי למנוע ממנו להיווצר ג'ל בטרם עת. 2) כדי לצפות את כיסויי הזכוכית או צלוחיות התרבות במטריג'ל, מרחו את תמיסת המטריג'ל על פני השטח. לפני ציפוי תאים, חשוב לייבש לחלוטין את פני השטח. למטרה זו, ייתכן שיהיה מועיל לשאוב מטריג'ל במהלך הצנטריפוגה התאית מיד לפני ציפוי התאים ולאפשר מספיק זמן לייבוש.
מדיום חיוני מינימלי (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+, 5 מ"לBD Biosciences355006
פלקון BD353047שטופלו בתרבית רקמות
פלקוןBD 6 בארות שטופלו בתרבית רקמות353046
Neurobasal-A Medium (1X), נוזלGIBCO-Invitrogen10888-022
חומצה חנקתיתVWRbdh 3044
NS (תוסף עצבי) 21 מוכן במעבדהמקור: הפניה 69
פיפטות פסטר, 5 ו-frac34; ”  פישר13-678-6Aהשתמש ב-5 ¾ מכותנה זה; ” פיפטה פסטר לטריטורציה תאית. יש ללטש את הקצה באש מראש כדי להחליק את המשטח החיתוך ולהקטין את הקוטר הפנימי ל-50-80% מהמקור. קצה קטן מדי ישבש את התאים ויפחית את כדאיות התאים, אך קצה גדול מדי יפחית את יעילות הטריטורציה.
פיפטות פסטר, 9 אינץ'  פישר13-678-6B
אשלגן כלורי (KCl), SigmaUltra, ≥ 99.0%סיגמא-אולדריץ'P9333-500G
פיפט סרולוגי, 2 מ"לבז BD357507
פיפט סרולוגי, 5 מ"ל פלקון BD357543
פיפט סרולוגי, 10 מ"לבז BD357551
פיפט סרולוגי, 25 מ"לבז BD357525
פיפט סרולוגי, 50 מ"ל בז BD357550
נתרן ביקרבונט (NaHCO3, נתרן מימן פחמתי), SigmaUltra, ≥ 99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
נתרן כלורי (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
נתרן הידרוקסיד (NaOH), כדוריות, 99.998% מתכות קורט בסיסSigma-Aldrich480878-250G
נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראט (Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99.99%, אולדריץ'סיגמא-אולדריץ'431478-250G
סוכרוז, סיגמאאולטרה, ≥ 99.5% (GC)מסנן מזרק Sigma-AldrichS7903-250G
, סטרילי, 0.2 ומיקרו; mמזרק 431219
, 3 מ"לבז BD309585
טרנספרין, הולו, פלזמה בקרCalbiochem616420
כתם כחול טריפאן, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282זה משמש לספירת תאים חיים/מתים. חדש תמיסה ישנה של טריפן כחול אם נעשה בה שימוש חוזר פעמים רבות (למשל מספר פעמים בשבוע למשך מספר שבועות), מכיוון שהיא תיצור משקעים ותגרום לקריאות שגויות של צפיפות התא.
טריפסין, סוג XISigma-AldrichT1005-5G
תמיסת טריפסין-EDTA, 0.25% תמיסת מלאי GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5Gמוכנה ב-50 מ"ג 5-fluoro-2'-deoxyuridine ו-125 מ"ג אורידין ב-25 מ"ל DMEM (8.12 ו-20.48 מ"מ, בהתאמה).
ריאגנטים - אימונוציטוכימיה
נוגדן, ארנב פוליקלונלי אנטי-MAP2Merck MilliporeAB5622
נוגדן, קוקטייל חד שבטי נגד GFAP עכברMerck MilliporeNE1015
ציוד - קעקוע
NEO– 9מערכת קעקוע מכרסמים זו היא מערכת חשמלית הפועלת על ידי הזזה מהירה של מחטי קעקוע 1 או 3 נקודות אנכית לתוך העור. הפעל את מכונת הקעקועים פעם אחת למשך כ-0.5 שניות, בעוד קצות מחטי הקעקוע נשמרים בניצב לפני העור. אנו מעדיפים קעקוע בשלוש מחטים כדי למקסם את האזור המקועקע, אך קעקוע במחט אחת יעיל באזורים צרים יותר, למשל בהונות, או אם יש צורך בשליטה מכנית עדינה, למשל כאשר מקעקעים מספרים. שני סבבים של קעקוע במהירות האיטית ביותר (הגדרת "1" מתוך 3 שלבים) מספיקים בדרך כלל כדי לייצר קעקוע גלוי וארוך טווח של כריות הכפות.
ציוד - גנוטיפ
מערכת אלקטרופורזה, אופקית, Wide Mini– תת-תא GTBIO– RAD170– 4405פרמטרים אופייניים לאלקטרופורזה הם עוצמת שדה חשמלי ב-6 וולט/ס"מ ומשך של 25 דקות עבור ג'ל של 10 ס"מ.
FluorChem 8800חלבון פשוטFluorChem 8800
PCR, MJ מיני מחזור תרמיBIO-RADPTC-1148EDUתגובות ה-PCR שלנו לגן Tor1a ב Δ E-torsinעכברים דפוקים הם כדלקמן: מחזור אחד של דנטורציה ב-94 & #176; C למשך 3 דקות, 35 מחזורי דנטורציה ב 94 & # 176; C למשך 30 שניות, חישול ב-58 ° C ל-30 שניות, הארכה ב-72 ו-#176; C למשך 2 דקות. לאחר מכן באה הארכה סופית ב-72 ו-#176; C למשך 10 דקות, והחזקה ב-4 °C.
ספק כוח, ציוד PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
- תרבית
מונה תאים אוטומטי, הרוזנתGIBCO-InvitrogenC10310מונה תאים אוטומטי זה מודד בנפרד את הצפיפות של תאים חיים ומתים (לא מוכתמים ומוכתמים על ידי טריפאן כחול, בהתאמה). חשוב לדעת את הטווח האופטימלי של מדידות הצפיפות: למונה בו אנו משתמשים יש את הדיוק הגבוה ביותר בטווח שבין 1 x 105 ל-4 x 106 תאים/מ"ל. אם ערכי צפיפות התאים הנמדדים נמצאים מחוץ לטווח המומלץ, כוונן את נפח ההשעיה מחדש בהתאם.
ארון בטיחות ביולוגי, Class II, סוג A2NUAIRENU-425-400מכסה מנוע זה משמש לכל הליכי תרבית התאים, למעט דיסקציה של המוח.
חממת CO2 חממה, זרימה אוטומטית, בקרת לחותNUAIRENU-4850
ספסל נקי אופקיNUAIRENU-201-330ספסל נקי זה משמש לדיסקציה של המוח (שלבים 3.1.1 ו-3.1.2 של "דיסקציה מוחית ודיסוציאציה תאית)".
Orbit LS שייקר במהירות נמוכהLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed צנטריפוגהפישר46910 (צנטריפוגה)/46922 (רוטור)
- מכונת קעקוע מערכות - גנוטיפ'-AGT, CTG, TGG, CTG, CTC, CTC, CC-3' (קדימה) ו-5'-CCT, CAG, GCT, CAC, AAC, CAC-3' (הפוך) (הפניה 18). מסוג בר תאים צלוחיות תרבית בז BD שטופלו בתרבית רקמות' מאריך סרום צלחות Multiwell, צלחות Multiwell, קורנינג AIMS מערכות זיהוי וסימון בעלי חיים, בע"מ תאים

מקורות

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרביות נוירונליות ראשוניותשכבת תאי תמיכה גליאלייםמיצוי DNAהגברה באמצעות PCRאלקטרופורזה של ג'לדיסקציה של מוחעיכול רקמותדיסוציאציה של תאיםזריעת נוירונים
המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.