הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51880

⸱

18 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים על מכשיר שיטה חדשה ללמוד תאי עוברים. תאים בודדים מסודרים דווקא מערכי microcavity. כליאת 3D שלהם היא צעד לקראת סביבות 3D נתקלו בתנאים פיסיולוגיים מאפשרת התמצאות אברון. על ידי שליטת צורת תא, התקנה זו ממזערת השתנות שדווחה מבחני תקן.

תקציר

תאים ביולוגיים בדרך כלל הם נצפו על משטחים שטוחים (2D). מצב זה אינו פיסיולוגי, פנוטיפים וצורות הם משתנים מאוד. הקרנה מבוססת על תאי בסביבות כאלה ולכן יש מגבלות חמורות: אברונים בתא להראות פנוטיפים קיצוניים, מורפולוגיה תא וגדלים הם אברונים בתא הטרוגנית ו / או ספציפיים לא ניתן מדמיינים כמו שצריכים. בנוסף, תאים in vivo ממוקמים בסביבת 3D; במצב זה, תאי להראות פנוטיפים שונים בעיקר בשל האינטראקציה שלהם עם מטריקס שמסביב של הרקמה. על מנת לתקנן וליצור סדר תאים בודדים בסביבת 3D-רלוונטי מבחינה פיזיולוגית עבור מבחני מבוססי תאים, אנו מדווחים כאן את microfabrication ויישומים של מכשיר תרבית תאים במבחנה 3D. מכשיר זה מורכב מערך 2D של microcavities (בדרך כלל 10 5 חללים / 2 סנטימטר), כל אחת מהן מלא עם תאים או עובר יחידים. posi הניידtion, צורה, קוטביות וארגון תא פנימי להיות אז מנורמל מראה ארכיטקטורה 3D. השתמשנו העתק דפוס דפוס מערך של microcavities, 'eggcups', על גבי polydimethylsiloxane דק (PDMS) שכבת דבק על coverslip. חללים היו מכוסים פיברונקטין כדי להקל הידבקות. תאים הוכנסו על ידי צנטריפוגה. אחוז המילוי היה מותאם עבור כל מערכת המאפשרת עד 80%. הכדאיות תאים ועוברים אושרה. יישמנו מתודולוגיה זו ההדמיה של אברונים הסלולר, כגון מכשירים בגרעין Golgi, וכדי ללמוד תהליכים פעילים, כגון סגירת טבעת cytokinetic במהלך מיטוזה תא. מכשיר זה אפשר זיהוי של תכונות חדשות, כגון הצטברויות תקופתיות inhomogeneities של שרירן יקטין במהלך סגר טבעת cytokinetic פנוטיפים דחוסים עבור Golgi ויישור גרעין. אנחנו שאפיינו את השיטה עבור בתאי יונקים, שמרים ביקוע, שמרים ניצנים, ג elegans wההסתגלות הספציפית ה- i בכל מקרה. לבסוף, המאפיינים של המכשיר הזה ולהפוך אותו המעניין במיוחד עבור מבחני הקרנת סמים ותרופות אישיות.

מבוא

נוכח מבחנים במבחנה מבוסס תאים הם דו ממדים (2D). תצורה זו אינה טבעית עבור בתאי יונקים ולכן הוא לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 1; תאים להראות מגוון של צורות, גדלים פנוטיפים הטרוגנית. הם מציגים מגבלות חמורות נוספות כשהוא מיושם על אפליקציות הקרנה, כגון חלוקת סדר בתוך המטוס פנוטיפים הקיצוני של אברונים הסלולר (סיב מתח, בפרט). הדבר חשוב במיוחד בניסויים קליניים עבור בדיקות סמים, שם תקציבים גבוהים מושקעים מדי שנה. רוב התרופות האלה נכשלים אף כאשר מוחלים על מודלים של בעלי חיים, בשל מצבו תרבות 2D המלאכותי בשלבים מוקדמים של הקרנת סמים. בנוסף, על ידי שימוש בגישה זו, אברונים תאים ספציפיים לא ניתן דמיינו כמו שצריך, כמו טבעת actomyosin cytokinetic במהלך מיטוזה התא, ובאופן כללי מבנים מתפתחים במישור הניצב למישור של התבוננות. כמהמבחני 2D חדשות הוצעו על מנת להתגבר על החסרונות הנ"ל תובנות חשובות על ארגון cytoskeleton נצפו 2,3. עם זאת, מבחנים אלה עדיין קיימים מגבלה רצינית אחת: תאים מראים פנוטיפ מאוד התפשטות בניגוד למה שרואה in vivo, שבו תאים להציג ארכיטקטורת 3D. ממצאים אלה הקשורים שיטת התרבות עשויים לגרום לתכונות הלא פיסיולוגיות כגון סיבי מתח משופרים 1,4,5.

תלת ממד תא מבחני תרבות לספק יתרונות מרובים בהשוואת 2D סביבות 6,7. הם פיסיולוגיים רלוונטיים יותר, ותוצאות הן אפוא משמעות. כדוגמא, תאים המוטבעים הידרוג להראות מבני 3D דמוי אבל המורפולוגיות שלהם שונות מתא אחד 8,9 אחר. עם זאת, מורפולוגיות שלהם שונה מתא אחד למשנהו, אשר מסבך יישומים ההקרנה. אסטרטגיה חלופית היא להטביע יחידתאי חללי microfabricated 10,11. בעמדה תא, צורה, קוטביות וארגון תא פנימי אז יכול להיות מנורמל. מלבד מתן ארכיטקטורה דמוי 3D לתאים, microcavities גם מאפשר ללימודים גבוהים הקרנת תוכן 10,12-14; תאים בודדים ניתן להזמין אל microarrays האברונים הסלולר ההתפתחויות שלהם ניתן לצפות במקביל. סדירות זה מספקת נתונים סטטיסטיים טובים עם מספר נמוך של תאים והחלטות זמניות / מרחבית טובות יותר. תרכובות שימושיות קלות יותר לזיהוי באופן מהימן.

במחקר זה, אנו מציגים את ייצור ויישום של מערכת התרבות תאים בודדים 3D-כמו חדש עבור יישומים עתירי תוכן ההקרנה 10,12,13. המכשיר מורכב מערך של microcavities אלסטומרי (10 5 חללים / 2 ס"מ), שטבע "eggcups '(EC). מידות נפח כולל של EC בעבודה זו מותאמות להיקף הטיפוסי של תאי NIH3T3 והלה פרטבעת חלוקת התא. מורפולוגיה של החללים - גלילי - נבחרה לכוון תא צורה כראוי ההדמיה של תהליכים פעילים. דפוס העתק משמש תבנית מערך של EC גבי polydimethylsiloxane דק (PDMS) שכבת דבק על כוס coverslip 15,16. תאים הם הציגו את EC על ידי צנטריפוגה. אנו מדווחים כאן תצפית ונורמליזציה של אברונים הסלולר (סיבי אקטין מתח, מערכת גולג'י והגרעין) ב -3 D (EC) בהשוואה אותם תאים על 2D (שטוח) משטחים. כמו כן, אנו מדווחים על התצפיות של תהליכים דינמיים פעילים כגון סגירת טבעת actomyosin cytokinetic במהלך התא מיטוזה 17. לבסוף, אנו מציגים תוצאות של מתודולוגיה זו על מערכות אחרות עם קירות נוקשים, כגון שמרים ניצנים, שמרים ביקוע ו- C. עובר elegans אשר מאשרת את תחולתה של המתודולוגיה שלנו מגוון רחב של מערכות מודל.

בשלב הבא אנו מציגים p מפורט וממצהrotocol כדי לפברק ולהחיל את 'eggcups' עבור microfabrication 3D. הגישה שלנו היא פשוטה ואינו זקוק לחדר נקי. אנו צופים כי מתודולוגיה חדשה זו תהיה מעניינת במיוחד עבור מבחני הקרנת סמים ותרופות אישית, החלפה של צלחות פטרי. לבסוף, המכשיר שלנו יהיה שימושי לחקר ההפצות של תגובות תאים לגירויים חיצוניים, למשל סרטן 18 או במחקר בסיסי 19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. microfabrication של 'Eggcups'

  1. המצאה של המאסטר: Array microcavities
    1. מחממים פרוסות סיליקון '3' עד 200 מעלות צלזיוס להתאדות כל נוכחות של לחות.
    2. ספין-מעיל שכבה דקה של photoresist SU-8. כוון את עוצמת הקול של מהירות שרף ספינינג בהתאם לסוג עובי photoresist הרצוי. עובי זה יכתיב את העומק של 'eggcups' (EC). עבור שכבה 30 מיקרומטר עבה SU-8 2025, ספין-מעיל 2,800 סל"ד.
    3. טרום לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (שלב 1 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. התאם את הזמן בהתאם לסוג photoresist ו לעובי הרצוי. בדוק את הנתונים של היצרן לפרטים נוספים.
    4. טרום לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (שלב 2 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. התאם את הזמן בהתאם לסוג photoresist ו לעובי הרצוי. בדוק את הנתונים של היצרן לפרטים נוספים.
    5. טענת אתרקיק על aligner מסכה לחשיפת UV. מניח את מסכת photolithography עליו. המסכה מציגה דפוס של תכונות עגולות (דיסקים) של 20 מיקרומטר קוטר. הבטח מגע מושלם בין אחד לשני.
      הערה: יצרנים שונים מציעים מסכות photolithography. הרזולוציה המרחבית תקבע את העלות הסופית. מסכות Acetate לספק רזולוציה מקובלת (≈10 מיקרומטר) ובעלות נמוכה. מסכות כרום לספק רזולוציה טובה יותר אך הן יקרות יותר. להתאים את בקטרים ​​של דיסקים (מתוך מסכת photolithography) להיקף של תאים. מידות של דיסקים על המסכה תקבענה את בקוטר של חללים בתוך המכשיר. בקטרים ​​קטנים יובילו מילוי נמוך; מדי בקוטר גדול לא להגביל את התאים. עבור תאי הלה NIH3T3, בקטרים ​​של 20 מיקרומטר עד 25 מיקרומטר הם הציעו.
    6. בדוק את הכוח של אקספוזיציה לפני מנורת UV לייעל את זמן החשיפה בהתאם. מקרינים (אורך גל = 365 ננומטר) עבור 41.5 שניות (או את זמן החשיפה מותאם) ב250 mJ / 2 ס"מ.
      הערה: SU-8 2025 photoresist שלילי, כלומר אזורים חשופים UV יבריאו. במקרה זה, התכונות העגולות היו שחורות שקופות שאר. עבודת photoresist חיובי בצורה ההפוכה: אזורים שאינם חשופים נרפאים. בחר את photoresist בהתאם, בהתאם לעיצוב ואת-המסכה התמונה.
      הערה: להגן על העיניים מפני אור UV עם משקפי בטיחות מתאימים.
    7. הסר בעדינות את המסכה מעל שכבת photoresist.
    8. הודעה לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה (שלב 1 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. הודעה לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (שלב 2 מתוך 2) עבור 30 מיקרומטר שכבה עבה SU-8 2025. התאם את הזמן בהתאם לסוג photoresist ו לעובי הרצוי. בדוק את הנתונים של היצרן לפרטים נוספים. לאחר אפיית פוסט, לקרר את פרוסות לטמפרטורת החדר על הספסל במשך כ 1 דקות.
    9. מניחים את פרוסות על coater ספין ושחרר כמה מ"מ של היזם SU-8 כדי לכסותבאזור רקיק כולו. ולפתח 2 דקות ולאחר מכן ספין מעיל ב 1000 סל"ד למשך 30 שניות. חזור על התהליך שלוש פעמים.
    10. לשטוף עם 2-פרופנול כדי להבטיח הסרה מלאה של SU-8 מפותח. מראה של אזורים הלבנים הוא אינדיקצית פיתוח שלם. אם כן, לחזור על השלב בפיתוח פעם נוספת.
    11. קשה לאפות את פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס כדי להבטיח יציבות של microstructures מפוברק. שלב זה הוא אופציונלי.
    12. אחסן את פרוסות 3 '' עם microstructures בתוך צלחת 94 מ"מ x 15 מ"מ קלקר פטרי.
      הערה: אין צורך לחיפוי, ב silanization בפרט, לקראת השלבים הבאים.
  2. המצאה של Replica polydimethylsiloxane (PDMS): מערך עמודים
    1. לערבב ביסודיות ב 1:10 יחס (w / w) the-מקשר הצלב ואת מראש פולימר עבור סכום כולל של 30 גרם בתוך שפופרת 50 מ"ל.
      הערה: שימוש 1:10 (V / V) יחס עובדת גם.
    2. צנטריפוגה הצינור 1,800 XG במשך 5 דקות כדילהסיר בועות אוויר.
    3. זרוק בעדינות את PDMS על גבי microstructures.
      הערה: אם בועות אוויר להופיע במהלך שלב זה, דגה המדגם באמצעות משאבת ואקום במשך 15-20 דקות.
    4. הנח את הדוגמה בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
      הערה: בפעם הריפוי משתנית בין המשתמשים, יחד עם מקשר הצלב: שיעור מראש פולימר. הפעם יכתיבו את הנוקשות של PDMS. מומלץ לרפא יותר מ -2 שעות ו לדבוק זמן ריפוי קבוע.
    5. השתמש אזמל לחתוך את האזור בעדינות עניין (חותמת) של כ -1 ס"מ 2 הכולל כ -10 5 microcavities או 'eggcups'.
      הערה: חותכים הראשון PDMS ולאחר מכן, לקלף אותו בעדינות. בדוק את איכות העתק PDMS עם מיקרוסקופ אופטי.
  3. המצאה של 'eggcups' על ידי דפוס העתק. בחלק הבא, שתי אסטרטגיות חלופיות עבור הייצור של 'eggcups' מתוארות. שני הפרוטוקולים הם מסיימיםLar ולספק תוצאות זהות:
    1. אסטרטגיה 1
      1. הפעל את חותמת PDMS מפוברק על ידי טיפול פלזמה חמצן למשך 30 שניות. אחסנו באופן זמני את הבולים מופעלים לתוך צלחת פטרי סגורה כדי למנוע בתצהיר של אבק.
        הערה: כוונן את זמן האקספוזיציה אם וגזים אחרים עבור הפלזמה משמשים.
      2. מניחים את PDMS מופעל להחתים למעלה הפוך (בצד עם מבנים) בצלחת פטרי ליד כובע צינור 15 מ"ל. מלא את הכובע עם 200 μl של Trimethylchlorosilane (TMCS). סגור את צלחת פטרי ולתת silanize חותמת במשך 7 דקות.
        הערה: חלק העיוות זמנית על החותמת ו / או שינוי צבע (לבן) אפשר לראות. הבול יתאושש לצורתו המקורית בזמן קצר ואת המבנים לא יושפעו.
        הערה: TMCS מייצרת רעילות שאיפת עורי חריפות, והוא מאוד דליק (עם פלאשבק הצתה מסוגל להתרחש על פני מרחקים ניכרים). כתוצאה מכך, יש להשתמש בו בתוך ארון קטר מן המקורים של ההצתה.
      3. מניחים את החותמת PDMS על coater ספין עם מבנים הפוך למעלה. שים טיפה קטנה של כמה מיקרוליטר (סביב 20 μl) של PDMS נוזלי (01:10 w / w מקשר צלב: פולימר-מראש) על גבי מבנים. ספין מעיל ב 1500 סל"ד למשך 30 שניות להפקיד שכבה דקה של PDMS על גבי מבנים.
        הערה: אם את החותמת אינה תואמת את המקום צ'אק ספין coater את החותמת על גבי מכסה צלחת פטרי עם חור קטן במרכזו.
      4. מניחים את החותמת בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לרפא את שכבת PDMS שהופקדו מצופה ספין.
      5. הפעל את שכבת PDMS הדקה ידי צבת חותמת PDMS עד הפוך, יחד עם coverslip זכוכית # 0 של 25 מ"מ קוטר, באמצעות שואב פלזמת חמצן למשך 30 שניות. המשך במהירות לשלב הבא.
        הערה: coverslips עם עוביים אחרים, צורות, וניתן להשתמש בו ממדים גם כן. עם זאת, כמה מבנים הסלולר יכול להיות קשה לדמיין בהתאם לעובי coverslip שנבחרו ואובייקטיביהגדלה ו / או NA ו / או ומרחק עבודה. בדוק את גיליון נתונים אובייקטיביים.
      6. מניח במגע החותם (הצד עם השכבה הדקה צופה-ספין) עם coverslip הזכוכית. לחצו בעדינות בכל רחבי השטח של הבול עם פינצטה כדי להפוך את 'מליטה'. לבסוף, לשמור על לחץ קבוע על גבי החותמת עבור כ -10 שניות.
      7. לאחר 30 דקות בעדינות 'לקלף' חותמת מתוך coverslip כדי "לשחרר" את "eggcups '(ראה איור 1). לשטוף ביסודיות עם אתנול יבש. אם 'eggcups' PDMS לא ימולאו גם על coverslip זכוכית (כלומר הם לנתק במהלך השלב 'בקילוף'), שקול לשנות את הגדרות של שואב פלזמה מחדש בשלב 1.3.1.5.
        הערה: שלב זה הוא עדין. שים לב על מנת למנוע שבירה של coverslip ו / או ניתוק של שכבת PDMS הדקה.
      8. מדביקים חתיכה קטנה (ידית) של PDMS נרפא של 1 מ"מ x 1מ"מ x 3 מ"מ נפח בקצה coverslip עם טיפה קטנה של PDMS נוזל ולרפא את PDMS כמו קודם. זה יקל על המניפולציה של המדגם לאחר מכן (ראה איור 1). שלב זה הוא אופציונלי.
    2. אסטרטגיה 2
      1. Hydrophilize הבולים PDMS מפוברק על ידי טיפול פלזמה חמצן למשך 30 שניות. אחסנו באופן זמני את הבולים מופעלים בצלחת פטרי סגורה כדי למנוע בתצהיר של אבק.
        הערה: כוונן את זמן האקספוזיציה אם וגזים אחרים עבור הפלזמה משמשים.
      2. Hydrophilize הטיפול פלזמה חמצן # 0 coverslips זכוכית בקוטר 25 מ"מ ב 15 וואט במשך 30 שניות. המשך במהירות לשלב הבא.
        הערה: coverslips עם עוביים אחרים, צורות, וניתן להשתמש בו ממדים גם כן. עם זאת, מבנים הסלולר יהיו קשים לדמיין בהתאם לעובי coverslip הנבחר מאפיינים אובייקטיביים (ראה הערה לעיל).
      3. ספין-מעיל טיפה קטנה של PDMS (01:10 w / w מקשר צלב: קדם-PolYmer) של כמה מיקרוליטר על coverslips זכוכית. ספין מעיל ב 1500 סל"ד למשך 30 שניות עבור עובי סופי של כ -50 מיקרומטר.
      4. מדביקים חתיכה קטנה (ידית) של PDMS נרפא של 1 מ"מ x 1 מ"מ x 3 מ"מ נפח בקצה coverslip עם טיפה קטנה של PDMS נוזל ולרפא את PDMS כמו קודם. זה יקל על המניפולציה של המדגם לאחר מכן (ראה איור 1). שלב זה הוא אופציונלי.
      5. אחסן באופן זמני את coverslips PDMS מצופה על גבי נקי לנגב בתוך צלחת פטרי כדי להגן מפני בתצהיר אבק.
      6. שים טיפת מגיב silanizing זו על גבי זו חותמת ולתת להתאדות זה במשך 1-2 דקות. לאחר מכן, לייבש אותם תחת זרם של N 2.
        הערה: בשלב זה, עיוות זמנית של הבול ניתן לצפות במהלך אידוי. הבול יתאושש לצורתו המקורית לאחר ייבוש עם N 2 ללא כל עיוות קבועה של microstructures.
      7. זרוק מאוד בעדינות את החותמת silanized על גביPDMS-ספין מצופה coverslip זכוכית מאוחסנת בצלחת פטרי. ודא כי שני הצדדים במקביל לחלוטין במהלך הקשר. הימנע לחיצה או הזזת חותמת לאחר הצבתו על coverslip PDMS מצופה.
      8. מניחים את צלחת פטרי עם דגימות בריק במשך 1-2 שעות כדי להסיר בועות אוויר.
        הערה: ודא כי דגימות הן אופקיות לחלוטין, כדי למנוע תזוזה חותמת. הימנעו גם רעידות שנגרמו פוטנציאלי על ידי משאבת ואקום.
      9. מניח את הדגימות בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
      10. בעדינות, לקלף את החותמת לחשוף 'eggcups'. לשטוף ביסודיות עם אתנול יבש.
        הערה: עיסוק בשלב זה נחוץ. שים לב למניעת שבירה של coverslip ו / או ניתוק של שכבת PDMS הדקה.

2. היכרות עם תאים לתוך 'Eggcups'

כדי להציג בתאי יונקים בתוך 'eggcups', ne השטח PDMSעורכים כדי להיות פונקציונליים עם חלבונים דבקים של תאי מטריקס. דוגמה זו משתמשת פיברונקטין אך חלבונים אחרים בעלי עניין, כגון קולגן, יוכל לשמש.

  1. Hydrophilize את 'eggcups' את שואב פלזמה חמצן למשך 30 שניות.
    הערה: לייעל את הפרמטרים במידת הצורך.
  2. הכן פתרון ב PBS 1x של 20 מיקרוגרם מ"ל -1 פיברונקטין ממקורות שור.
  3. לעקר את 'eggcups' עם UV למשך 5 דקות. להפקיד טיפה קטנה (בסביבות 20-50 μl) של פתרון פיברונקטין כדי לכסות את האזור "eggcups 'השלם דגירה במשך שעה 1 ב RT. הגנה על המדגם מפני התייבשות.
  4. לשטוף בעדינות את 'eggcups' עם PBS 1x. חזור 3 פעמים.
    הערה: המדגם הוא מוכן לשימוש באופן מיידי או מאוחסנים 4 ° C בחושך במשך כמה שבועות.
  5. הצג חתיכת פלסטיק מחוייט גלילית של 63 מ"מ גובה, 26 מ"מ של רדיוס חיצוני ו -7 מ"מ ממדי רדיוס פנימיים לתוך צינור 50 מיליליטר (ראהאיור 2) 20
    זהירות: השתמש UV עיקור פריטים או לעקר אותם לשימוש קודם.
    הערה: קטע זה יכול להיות מפוברק בקלות במעבדה. או בכל חנות מכונית זמינה.
  6. שים 13 מ"ל של מדיום תרבית תאים בתוך הצינור (ראה טבלה 1). המדיום צריך למלא לפחות 2 סנטימטרים מעל הפיסה הגלילית כדי להבטיח טבילה מלאה של המדגם.
    הערה: לפרטים של סוגי תאים מסוימים, ומערכות מודל אחרות כגון שמרים או C. elegans עובר, והמדיום המקביל בשימוש, ראו סעיף 5 ולוח 1. הפרוטוקול המתואר הוטב הלה, תאי NIH3T3, שורות תאים אחרות (ראה טבלה 1).
  7. הציגו מאוד בעדינות את 'eggcups' בתוך הצינור ובמקביל בצד העליון של חתיכת פלסטיק. להשתמש בפינצטה חדה להחזיק המדגם באמצעות ידית PDMS. לחץ בעדינות את coverslip עד שהוא שקרים על גבי הצד העליון של חתיכת פלסטיק, until הוא שקוע לחלוטין (ראה איור 2).
    הערה: מומלץ להשתמש בפינצטה חדה וישרה. עם פינצטה מעוקל, המניפולציה של המדגם קשה ועלולה לגרום שבירה.
  8. התרבות תאים עד מפגש 80-100% בצלחת פטרי P60 ולאסוף אותם על ידי trypsinization.
    הערה: תאים יכולים להיות wild-type, transfected או מטופלים עם כל תרופה של עניין.
    הערה: למנוע היווצרות של אגרגטים התא אשר ימנע תאים בודדים להיכנס 'eggcups'. כדי לייעל את זה צעד, פיפטה למעלה ולמטה ביסודיות לאחר trypsinization.
  9. מחדש להשעות תאים לתוך מדיום תרבות 5 מיליליטר. פיפטה 200 μl של תאים על גבי 'eggcups'.
    הערה: זרוק תאים כמו מרוכז ככל האפשר על גבי 'eggcups' אבל הימנעות ממגע פיזי. פעולה זו תמנע שבירה ו / או נזק של המדגם.
  10. צנטריפוגות ב 1,800 XG למשך 2 דקות.
    הערה: לאחר צנטריפוגה הראשון, צ'ק-אין מיקרופוןroscope אחוז המילוי של 'eggcups'.
  11. פיפטה שוב 200 μl של תאים על גבי 'eggcups' צנטריפוגות ב 1,800 XG למשך 2 דקות. חזור עבור סכום כולל של שלוש פעמים על מנת לייעל את אחוז המילוי.
    הערה: לאחר צנטריפוגה האחרון, לבדוק עם מיקרוסקופ מילוי אחוז 'eggcups'. במידת הצורך, חזור על השלבים מילוי + צנטריפוגה עד שמגיעים אחוז המילוי הרצוי.
  12. הסר את המדגם מהצינור באמצעות פינצטה חדה מחזיק בידית PDMS. הקפד להיזהר לא 'מטריד' תאים אשר מתקיימים 'eggcups' (ראה איור 2).
  13. מניחים את המדגם בצלחת פטרי עם המדיום. יש לשטוף כדי להסיר את עודף התאים שאינם ב 'eggcups' על ידי pipetting למעלה ולמטה שלוש פעמים בעדינות ליד כל צד (סה"כ 4 צדדים) של מערך מייקרו.
    הערה: Pipetting חזק מדי עלול לשחררכמה תאים מתוך 'eggcups'.
  14. החלף בינוני עם בינוני טרי כדי להסיר תאים nonattached.
    הערה: בשלב זה תרופה של עניין ניתן להוסיף.
  15. תקן תאים או להכין אותם צעד imaging.See זמן לשגות 4.1.

3. תצפית של דינמיקת הסלולר פעילה 'Eggcups': סגירת טבעת Cytokinetic

הערה: בדוגמה זו נעשה שימוש בתאי הלה אשר טרנספקציה עם MYH10-GFP ו Lifeact-mCherry עבור שרירן אקטין, בהתאמה, מולקולות פעילות המפתח הכרוכות בסגירת טבעת cytokinetic במהלך מיטוזה התא. המכשיר מוכן עם microcavities של 25 מיקרומטר קוטר. לצורך ההשגחה שלהם, מיקרוסקופ epifluorescence הפוך שמש, מצויד מטרת שמן 60X (1.40 NA, דסק"ש, תכנית Apo) ו- GFP (שרירן) ו TxRed (תקטין) מסננים. לחלופין מיקרוסקופ confocal זקוף שמש, מצויד מטרת מי L 25x או 63X HCX IR APO (0.95 NA). עבור EXA זהmple, מומלץ מאוד לסנכרן תאים באמצעות בלוק thymidine כפול, לחסום mitotic או שיטה שייק פעמי mitotic 21-24.
הערה: העובי של PDMS המשמש 'eggcups' מאפשרת את השימוש של מגוון רחב של מטרות הם מיקרוסקופים הפוכים וזקוף מיקומו.

  1. מקום 'eggcups' לתוך מחזיק מיקרוסקופ ולמלא אותו עם 1 מ"ל של 10% FCS בינוני תצפית L-15. כדי למנוע אידוי, להציב מכסה זכוכית על גבי המחזיק או למרוח שכבה דקה של שמן מינרלים על גבי המטרה השמנה medium.Select 60X.
    הערה: בינוני L-15 הוא נאות עבור 2 אטמוספרות הלא-CO. שים לב גם כי כמה תרכובות של DMEM הן פלורסנט אוטומטי. בעת שימוש במדיום זה, מומלץ photobleach תרכובות פלורסנט תוך הארתו עם מנורה בעוצמה גבוהה במשך 1-2 שעות.
    הערה: הימנע משימוש מכסי פלסטיק כשעובד עם הדמית דסק"ש.
  2. מניח את הבעל עם 'eggcups' ו obserבינוני vation במיקרוסקופ. פוקוס באמצעות brightfield אור בזהירות עד 'eggcups', ותאים הם באותו המישור של התבוננות.
  3. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בחר במסנן TxRed ו- GFP עבור אקטין שרירן; להתאים את זמן אקספוזיציה לכל ערוץ. רכישה בשיעור טיפוסי הוא 5 שניות שני הערוצים.
    שימו לב: בפעם האקספוזיציה עשויה להיות מותאמת, ובהתאם להגדרות בשימוש, צבע או אברונים תאיים אחרים של עניין.
  4. בחר את האזור של עניין ולחפש טבעת cytokinetic או באמצעות ערוץ ה- GFP או TxRed. פוקוס מדויק.
    הערה: הטבעת היא חדה יותר שרירן קל יותר לזיהוי.
  5. הפעל את הרכישה האוטומטית בשני הערוצים עד הטבעת סגורה לחלוטין.
    שימו לב: חלק photobleaching אפשר לראות. כוונו את הפרמטרים מיקרוסקופ כדי לצמצמו.

4. תצפית של אברונים סלולארי קבוע לתוך 'Eggcups'

שלב זה יכול להתבצע לפני או אחרי שלב # 3. תאים ניתן לתקן מיד לאחר השלב צנטריפוגה ומוכתמת עבור אברון עניין או לאחר התבוננות במיקרוסקופ. דוגמה זו מראה את הכתמה של מערכת גולג'י, סיבים בגרעין אקטין על פיברובלסטים NIH3T3 ב 'eggcups'.

  1. קיבוע של תאים 'Eggcups'
    1. כן 3 paraformaldehyde% (PFA) וחם על 37 מעלות צלזיוס. הסר את המדגם "eggcups 'מהצינור 50 מ"ל (או בעל מיקרוסקופ) ולמקם אותו בתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף מיד עם PBS 1x.
      הערה: פרוטוקולים לעריכת paraformaldehyde 3% זמינים באופן נרחב במקומות אחרים.
      זהירות: יש להשתמש בכפפות ניטריל ומשקפי מגן במהלך תקופת ההכנה של PFA.
    2. הסר לחלוטין את PBS ושחרר 1 מ"ל של 3% PFA דגירה במשך 17 דקות. הסר את PFA ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS 1X. Permeabilize תאים באמצעות 1 מ"ל של 0.5% טריטעל 3 דקות ולשטוף פעמים עם PBS 1x למשך 5 דקות.
  2. צביעת תאים ב 'Eggcups'
    1. דגירה תאים עבור מכתים מערכת גולג'י עם אנטי Giantin ארנב polyclonal נוגדן ראשוני ב דילול 1: 500 ב PBS. מניחים ירידה 100 μl של פתרון נוגדן על גבי גיליון סרט פלסטי דגירה התאים בתוך 'eggcups' במהופך במשך 45 דקות.
      הערה: הגנה על המדגם עם כיסוי כדי למנוע התייבשות.
    2. שחרר בעיון את 'Eggcups' ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBS 1x.
    3. הכן קוקטייל PBS עם השעיר Cy3 נוגדנים משני ארנבת אנטי (1: 1,000) ועם Phalloidin אלקסה פלואוריד 488 (1: 200) מכתים סיבי אקטין מתח.
    4. דגירה תאים עם ירידה 100 μl של פתרון נוגדן על גבי גיליון סרט פלסטי דגירה תאים בתוך דקות "eggcups 'במהופך במשך 45.
    5. שחרור בעיון את 'eggcקופץ 'ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBS 1x.
    6. דגירה תאים עבור מכתים הגרעין הצבת ירידה 100 μl של 1 מיקרוגרם מ"ל -1 DAPI ב PBS על גבי גיליון סרט פלסטי דגירה תאים בתוך דקות "eggcups 'במהופך במשך 45. שלב זה יכול להתבצע עם צעד 4.2.3.
    7. שחרר בעיון את 'eggcups' ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי P35. יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBS 1x.
    8. תאי הר באמצעות גליצרול 15 μl: PBS (1: 1 v / v) בשקופית זכוכית מיקרוסקופ רגילה ולאטום המדגם עם לק כדי למנוע התייבשות.
      הערה: בהתאם לעובי 'eggcups' לתלייה עלולה להיות קשה. מומלץ לאחסן אז המדגם לתוך צלחת P35 פטרי PBS, מוגן מפני התייבשות.
  3. תצפית מיקרוסקופ
    הערה: בדוגמא זו מיקרוסקופ confocal זקופה משמשת, מצויד גלאי PMT היברידיים. 25x או 63 X HCX IR APO L מים אובייקטיבי (0.95 NA) נבחרה לספק שדה רחב של המדגם להראות את הישימות של המכשיר עבור יישומים ההקרנה גבוהה תוכן.
    1. בחר את מטרת המים 25x או 63X.
      הערה: מטרות שונות ניתן להשתמש בהתאם ליישום האות. אבל שימוש של מטרות צמצם מספריות גבוהות מומלץ.
    2. מניח את המדגם הקבוע עם 'eggcups' ולהתמקד באמצעות אור brightfield בזהירות (לעומת שלב או DIC) עד 'eggcups' והתאים הם במישור של התבוננות.
    3. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בחר במסנן GFP, Cy3 ו DAPI עבור אקטין, גולגי תצפית גרעין, בהתאמה; להתאים את זמן חשיפה עבור כל הערוצים.
      שימו לב: בפעם האקספוזיציה עשויה להיות מותאמת בהתאם ההתקנה.
    4. בחר ולמקד את האזור של עניין; להתחיל לכידת תמונה (ראה איור 3).
tle "> 5. הסתגלות עבור התצפית של תאי שמרים ו- C. elegans עוברי

  1. תאי שמרים ביקוע הנצה
    הערה: בדוגמה זו נעשה שימוש ביקוע תאי שמרים אשר מתויגים עם RLC1-mCherry ו- CHD-GFP עבור שרירן אקטין, בהתאמה. התאים שמרימים הניצנים אינם שכותרתו fluorescently כאן. להסתכלות שמרים ביקוע מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב הפוך היה בשימוש. מטרת שמן 100X HCX PL APO CS (1.4 NA) שמשה עבור כל הרכישות. לחלופין, תאים נצפו גם באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך מצויד מטרה אוויר 20X לעומת שלב LCPlanFl (0.4 NA). בדוגמא זו, הפרוטוקול הוא זהה לשני סוגי התאים.
    1. מכינים את השטח "eggcups 'כמתואר לעיל. לביקוע ותאי שמרים ניצני, להכין חללים של 5 מיקרומטר קוטר (ראה טבלה 1). במקרה זה, פני השטח לא צריך להיות פונקציונלי עם חלבוני הידבקות.
      הערה: ca המילויn להיות מותאם באמצעות 'eggcups' חרוטים. צורה זו לוכדת ושומרת תאי הימנעות השחרור במהלך שלב השטיפה לאחר צנטריפוגה. מילוי אחוז הוא אופטימלי בסביבות 80%. 'Eggcups' חרוטים אלה יכול להיות מפוברקת באמצעות עמוק תגובתי יון תחריט 13.
    2. תאי שמרי תרבות בתקשורת התרבות הראויה (ראו טבלה 1) עד שמגיע צפיפות אופטית (OD) בטווח של 0.2 ו -0.8. Sonicate התרבות של תאי שמרים כדי להסיר אגרגטים.
    3. הכנס תאי שמרים 'eggcups' על ידי צנטריפוגה. עבור צנטריפוגה, 4 מ"ל של תאים בתרבית OD המתאים מתווסף על צינור עם 'eggcups'. לאחר צנטריפוגה הראשונה, נער בעדינות את הצינור מחדש להשעות תאים שאינם ב 'eggcups', בעוד התאים 'eggcups' לא מופרעים. בלי לפתוח את הצינור, צנטריפוגות שוב וחזור על שלב זה פעמיים. זה מבטיח את בתצהירשל תאים מתרבים לתוך microcavities ריק ויגביר את אחוז המילוי.
      הערה: כשעובד עם שמרים, מומלץ מראש לחום בצנטריפוגה לטמפרטורת העבודה במהלך ניסויים
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן והמשיך עד 12 שעות מאוחר יותר. במקרה זה, לאחסן את המדגם על טמפרטורת העבודה ולכסות אותו על מנת למנוע אידוי.
    4. מניחים 'eggcups' בבעל מיקרוסקופ ולמלא למחזיק בינוני מעוקר מסנן הדמיה. עכשיו לשטוף את התאים עם אותה התקשורת עד בתאי השמרים צפים מוסרים ביעילות. תשמור על עצמך לא להפריע תאים 'eggcups' במהלך תהליך השטיפה.
    5. בחר את מטרת שמן 100X ולהתמקד בזהירות. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בשמרים ביקוע, בחר GFP מסננים TxRed עבור אקטין שרירן ולהתאים את זמן חשיפה עבור שני הערוצים. רכישה בשיעור טיפוסי הוא 3 שניות.
      הערה: בהתאםfluorophore, הסוג של תיוג ואת ההגדרה, זמן חשיפה משתנה עבור מערכות אחרות.
  2. C. elegans עוברי
    הערה: בדוגמה זו נעשה שימוש ג elegans עובר 25-30 מיקרומטר רחב 50-55 מיקרומטר ארוך. עוברים היו בתרבית כמצוין 25. פרוטוקול ויזואלית פשוט של איך לתפעל ג elegans ניתן למצוא 26. התצפית בוצעה באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך מצויד מטרת אוויר 40X 0.55 NA.
    1. מכינים את השטח "eggcups 'כמתואר לעיל ו -25 מיקרומטר קוטר (ראו טבלה 1). במקרה זה, פני השטח לא צריך להיות פונקציונלי עם חלבוני הידבקות.
    2. תרבות ג עוברת elegans בתקשורת התרבות הראויה (ראה טבלה 1).
    3. כנס עובר 'eggcups' על ידי צנטריפוגה כמתואר לעיל (ראה סעיף 2.6 כדי 2.12) באמצעות מי ultrapure כמדיום תרבות.
      הערה: עובר היו 'מתנהג' בדרך כלל במי ultrapure עבור תקופת הניסוי. לחלופין להשתמש חיץ M9 פיסיולוגי לניסויים ארוך טווח.
    4. יש לשטוף את המדגם כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.14). מניחים את 'eggcups' לתוך מחזיק מיקרוסקופ. בחר את מטרת אוויר 40X ולהתמקד בזהירות. פתח את התוכנה ולהתאים את הפרמטרים. בחר רכישה בשיעור של 3 שניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ה 'eggcups' (EC) היא מתודולוגיה הקרנה תכולה גבוהה רומן אשר מאפשרת ההדמיה של אורינטצית תאים העוברים בסביבת 3D. בנוסף, חלק תהליכים תאיים, אשר קשה להבחין ב 2D רגיל (שטוח) תרבויות, יכול להיות שנצפו על ידי השיטה החדשה. איור 1 א מציג סיכום של נוהל microfabrication EC (ראה גם סעיף 1 בפרוטוקול המתואר לעיל ). השיטה היא פשוטה, מהירה, יעילה, ללא כל דרישה של ציוד מיוחד. איור 1b ו 1c מראה תמונה בקנה מידה גדול תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דפוס העתק שמש כדי לפברק את 'eggcups'. תהליך הייצור לא צריך חדר נקי; זה קל ופשוט, אם כי חלק באימון ייתכן שיידרש. בפרט, משחרר את חותמת PDMS הוא השלב הקריטי ביותר כדי לייצר שטח גדול של 'eggcups' באיכות גבוהה. מסיבה זו, טיפול מיוחד יש לנקוט צעד זה. אם שלב זה הוא נכשל שוב ושוב, שקול לייעל את פרמטרי הפלזמה נקיים לפני silanization והפלזמה מחייב. silanization מספיק יוביל דבק חזק של הבול לסרט PDMS. אם זה הוא ציין, זמן הדגירה עם מגיב silanizing יכול להיות מוגבר. שים לב טכניק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לנו מה למסור.

תודות

אנו מכירים L. Brino (מתקן הקרנת תכולה גבוהה IGBMC, Illkirch, צרפת) למתן אותנו עם נוגדן אנטי Giantin, M. Labouesse מעבדה. עבור ג elegans (IGBMC) ו- B. Séraphin מעבדה. עבור נבגי שמרים (IGBMC), א פאלוך וא היימן עבור תאים פלורסנט הלה (MPI-CBG, דרזדן), ג 'מוסלי (הספר לרפואה Dartmouth) ו JQ וו (אוהיו סטייט) עבור תאי שמרים ביקוע; א Hoel ופ Evenou לעזרה ניסיוני, ג ריק (IBMC, שטרסבורג, צרפת) לעזרה טכנית, ו JC ז'אנו (Femto-st, צרפת) לעזרה microfabrication. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן CNRS, מאוניברסיטת שטרסבורג, Conectus, La Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר Medicale ואת CI-FRC של שטרסבורג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ddH20 (אולטרה-טהור)Millipore-השתמש תמיד במים מתוקים.
פרפילם (סרט פלסטיק)BemisPM-999הדבק פרפילם לספסל המעבדה באמצעות כמה טיפות מים והבטיח שטוחות משטח מושלמת.
מסכת צילוםSelba-http://www.selba.ch
סיליקוןSiltronix-http://www.siltronix.com/
SU-8 PhotoresistMicroChem 2000 serieshttp://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
נדרשת עבודה בקולט אדים; בדוק את גיליון הנתונים של היצרן למידע נוסף.
מפתח SU-8MicroChem-http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
נדרשת עבודה בקולט אדים; עיין בגיליון הנתונים של היצרן למידע
2-פרופנולSigma-Aldrich19030http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA
זמין ממספר חברות.
Sigmacote (מגיב סיליקון)Sigma-AldrichSL2-25MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& region=FR 
> מזיק, נדרשת עבודה בקולט אדים; בדוק את גיליון הנתונים של היצרן למידע נוסף. 
כלורוטרימתילסילן (TMCS)סיגמא-אולדריץ'386529-100 מ"לhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR  
TMCS מייצר שאיפה חריפה ורעילות עורית, והוא דליק מאוד (עם פלאשבק הצתה המסוגל להתרחש למרחקים ניכרים), ולכן יש להשתמש בו בארון אדים הרחק ממקורות הצתה
כפפות ניטרילKleenguard57372http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
זמין ממספר חברות.
כיסויי זכוכית #0זכוכית KnittelKN00010022593http://www.knittelglass.com/index_e.htm
שביר מאוד. בצעו מניפולציות בעדינות.
פינצטה ישרה חדהSPI0WSSS-XD
שפופרת http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 50 מ"לBD Falcon352070
http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp זמין ממספר חברות.
PDMSDow CorningSylgard 184 kithttp://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN 
החבילה מכילה גם בסיס PDMS וגם חומר ריפוי. אלסטומרים דומים זמינים ממספר חברות.
זכוכית מיקרוסקופ שקופיתDutscher100001http://www.dutscher.com/frontoffice/search
זמין ממספר חברות.
DMEM מדיום גלוקוז גבוהפישר סיינטיפיק41965-039http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& חנות=מדעי & ניווט=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
סרום עגל בקרSigma-AldrichC8056-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA
0.25% Trypsin-EDTAFisher Scientific25200-072http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& חנות=מדעי & ניווט=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS 1xFisher Scientific14200-067http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& חנות=מדעי & ניווט=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS הוא פי 10 ויש לדלל אותו ל-1x באמצעות ddH2O
בינוני L-15 FisherScientific21083-027http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& חנות=מדעי & ניווט=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
בינוני לאטמוספרות ללא בקרת CO2 Fibronectin
 סיגמא-אולדריץ'F1141-5MGa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& term=F1141-5MG& lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& term=F1141-5MG& lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
פניצילין & StreptomycinFisher Scientific15140-122http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& חנות=מדעי & ניווט=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM
צלחת פטרי P35גריינר627102http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
צלחת פטרי P60גריינר628163http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
צלחת פטרי P94גריינר633179http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %Sigma-AldrichP6148-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& region=FR 
מזיק במיוחד לעיניים, נדרשת עבודה במכסה אדים; עיין בגיליון הנתונים של היצרן למידע נוסף.
טריטון 0.5סיגמא-אולדריץ'93443-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& מונח = 93443-100 מ"ל & lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& מונח = 93443-100 מ"ל & lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
פלודין-ירוק פלואורסצנטי Alexa Fluor 488InVitrogenA12379http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=חיפוש-a12379  להמיס
אבקה ב-1.5 מ"ל מתנול
Alexa Fluor 647InVitrogenA212451:200 דילול ב-PBS 1x ארנב
פוליקלונלי אנטי-ג'יאנטיןAbcamab245861:500 דילול ב-PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
rabbit אנטי-אניליןבאדיבות M. Glotzer, פורסם ב-Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin הוא חלבון פיגום המקשר בין RhoA, אקטין ומיוזין במהלך ציטוקינזיס. ביולוגיה נוכחית 18, 30– 6 (2008).דילול 1:500 במעבדת
התמרהAnti-phosphotyrosine610000http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 עזים נגד ארנב Jackson Immunoresearch111-166-047http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 דילול ב-PBS 1x
DAPISigma-AldrichD8417 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& region=FR 
1 מ"ג/מ"ל למשך דקה
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G2025http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& term=G2025& lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
שמן מינרליSigma-AldrichM8410-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& term=M8410-500ML& lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& term=M8410-500ML& lang=en& region=CA& מיקוד=מוצר& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
תאי HeLa-תאי יונקים זמינים מחברות רבות. ראה גם <חזק>טבלה 1
תאי NIH3T3 תאיATCC-יונקיםזמינים מחברות רבות. ראו גם <חזק>טבלה 1
שמרי ביקוע --לפרטים על זנים, צור קשר עם המחבר המתאים.  ראה גם טבלה 1
C. elegans תולעים--לפרטים, צור קשר עם המחבר המתאים.  ראה גם <חזק>טבלה 1
כן (אגר) + 5 תוספים כלוליםMP Biomedicals4101-732http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=חיפוש 
להכנה: עקוב  ההוראות המופיעות על האריזה
כן (מדיה) + 5 תוספיםכלולים MP Biomedicals4101-522http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=חיפוש 
להכנה: עקוב אחר ההוראות המופיעות על האריזה
EMM (Media)MP Biomedicals4110-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=חיפוש 
להכנה: עקוב  ההוראות המופיעות על הקופסה
מסנן EMM מעוקר (מדיה) - רק להדמיהMP Biomedicals4110-012להכנה: עקוב אחר ההוראות המופיעות על הקופסה. מסנן לעקר את המדיה באמצעות 0.22 µ מסנן m במקום חיטוי. זה נותן שקיפות למדיה ומפחית את האוטופלואורסצנטיות.
תוספי מזון (עבור EMM)MP Biomedicals4104-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=חיפוש
 ( הוסף 225 מ"ג/ליטר למדיית ה-EMM לפני חיטוי או סינון)
מסננים סטריליים מונעי Stericup ו-Steritop VaccumMillipore-http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2
נוסף<<<% < של PBS 1xאחת<

מקורות

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548(2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019(2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תרבית תאים בתלת-ממדמערך מיקרו-חלליותיציקה משכפלהכוסות ביצה מ-PDMSמיקום תאיםויזואליזציה של אברוניםסגירת טבעת הציטוקינזהשמרים נחלקיםרפואה מותאמת אישית
הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.