תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי
במאמר זה
סיכום
תקציר
BDNF ממלא תפקיד חשוב בכמה היבטים של הישרדות, בידול, ותפקוד עצביים. גירעונות מבניים ותפקודיים באקסונים נתפסים יותר ויותר כתכונה מוקדמת של מחלות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת הנטינגטון (HD). עדיין לא ברור הוא המנגנון (ים) שבו פציעת axonal מושרה. אנחנו דיווחו על ההתפתחות של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. BDNF שכותרתו נקודה קוונטית (QD-BDNF) הופק על ידי והטה נקודה קוונטית 655 לmBtBDNF. מכשיר microfluidic שימש לבודד את האקסונים מגופי תא נוירון. תוספת של QD-BDNF לתא axonal אפשרה הדמיה חיה של תחבורת BDNF באקסונים. אנחנו הוכיחו כי QD-BDNF עבר בעצם באופן בלעדי retrogradely, עם מעט מאוד הפסקות, במהירות הנעה של כ 1.06 מיקרומטר / sec. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור אותיchanisms של פונקציה שיבשו axonal בספירה או HD, כמו גם הפרעות ניווניות אחרות.
מבוא
נוירונים מקוטבים מאוד תאי תהליכים שארוכים, ולעתים קרובות הרחיב מאוד הם יסוד להקמה ולשמירה על המבנה והתפקוד של מעגלים עצביים. האקסון ממלא תפקיד חיוני בביצוע מטענים אל ומסינפסות. חלבונים ואברונים מסונתזים בסומה התא צריכים להיות מועברים דרך האקסונים להגיע מסוף presynaptic לתמוך תפקוד עצבי. במקביל, אותות המתקבלים באקסונים דיסטלי צריכים להיות transduced והועברו לסומה. תהליכים אלה הם חיוניים להישרדות עצבית, בידול, ותחזוקה. שבהובלת axonal בכמה נוירונים חייבת להתנהל דרך מרחקים יותר מ -1,000 פעמים הקוטר של גוף התא, את האפשרות שנחזתה בקלות שגם גירעונות קטנים יכולים במידה ניכרת להשפיע תפקוד עצבי ומעגל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הליכים כירורגיים ובעלי החיים מתבצעים אך ורק על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. כל הניסויים בתחום השימוש בבעלי החיים אושרו על ידי UCSD המוסדי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.
.1 פלסמיד שיבוט, ביטוי וטיהור של BDNF biotinylated-Mono (mBtBDNF)
הערה: לבנות מראש proBDNFavi והבירה cDNA לתוך וקטור pcDNA3.1 וcoexpress בתאי HEK293FT 10. לטהר mBtBDNF באמצעות חרוזים Ni-נ.ת. ע על פי שיטה שפורסמה בעבר לייצר גורם בוגר ופעיל ביולוגי גדילה העצבית monobiotinylated (mBtNGF) 10.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ייצור וטיהור של BDNF מונו biotinylated פעיל ביולוגית
וקטור הביטוי של BDNF התמזגו עם רצף AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) נוצר על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 10. המסה המולקולרית של חלבון היתוך באורך המלא הייתה צפויה להיות ~ 32V kDa (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html) Monobiotinylated הבוגר BDNF עם מסה מולקולרית חזויה של 18 kDa (אי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה, אנו מדווחים על הפיתוח של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. על ידי להטות את החלבון לstreptavidin נקודה קוונטית, ובאמצעות תא microfluidic, השיטה מאפשרת לאדם לזהות תחבורת axonal של BDNF בנוירונים עיקרי עם רגישות מולקולה בודדת, בזמן אמת ועם רזולוציות מרחב ובזמן. הכלים המשמשים במסמך זה מספקים אמצעי שבאמצעותו כדי ללמוד את המכונות מולקולריות אשר מתווכות תחבורת axonal של BDNF / endosomes TrkB א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריזו.
תודות
ברצוננו להודות ליואה (פאולין) הו, רחל Sinit לקבלת הסיוע הטכני שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק NIH (EY016525 PN2) ועל ידי מימון מחקר תסמונת דאון וטיפול הקרן ולארי L. Hillblom הקרן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פלטינה pfx DNA פולימראז | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | תסיסה | FD0054 | |
| תאי HEK293FT | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-גלוקוז גבוה מדיה | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | סיגמא | B4639 | |
| TurboFect | תסיסה | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA שרפים | Qiagen | 30250 | |
| מעכבי פרוטאז קוקטייל | Sigma | ערכת צביעה מכסף S8820 | |
| G-Biosciences | 786-30 | ||
| מיקרופלואידיים רקומביננטיים אנושיים BDNF | Genentech | ||
| Xona | SND450 | ||
| 24 x 40 מ"מ מס' 1 כיסויי זכוכית | VWR | 48393-060 | |
| פולי-L-ליזין | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | גיבקו | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | ||
| Q10121MP נוגדן תג אנטי Avi GenScript | A00674 | ||
| חרוזי סטרפטווידין-אגרוז | טכנולוגיית חיים | SA100-04 | |
| חומצה טריכלורואצטית | סיגמא | T6399 | |
| HRP-סטרפטווידין | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB | מתנה נדיבה מד"ר מ. צ'או מ-NYU | ||
| נוגדן נגד TrkB | BD | Science 610101 |
מקורות
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular O....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
