הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51901

⸱

16 בספטמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Structure et Propriétés d'Architectures Moléculaires, Institut Nanosciences et Cryogénie, CEA-Grenoble, 2Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Institut de Biologie Structurale

במאמר זה

סיכום

מתוארת גישה חדשה לבניית לשון אלקטרונית (eT), המפשטת מאוד את התכנון והייצור של חומרי חישה, ומאפשרת ל-eT ליצור פרופילי אבולוציה רציפה ונופים עבור דגימות בנוזל. ה-eT המתקבל יעיל לניתוח חלבונים נפוץ כגון אפליה.

תקציר

בפרוטוקול הנוכחי, פותחה גישה קומבינטורית כדי לפשט את התכנון והייצור של חומרי חישה לבניית לשונות אלקטרוניות (eT) לניתוח חלבונים. על ידי ערבוב מספר קטן של מולקולות פשוטות ונגישות בעלות תכונות פיזיקו-כימיות שונות, המשמשות כאבני בניין (BBs), בפרופורציות משתנות ומבוקרות ומאפשרות לתערובות להרכיב את עצמן על משטח הזהב של פריזמה, נוצר מערך של משטחים קומבינטוריים בעלי תכונות מתאימות לחישת חלבונים. בדרך זו ניתן להשיג מספר רב של קולטנים צולבים במהירות וביעילות. על ידי שילוב מערך כזה של קולטנים קומבינטוריים צולבים (CoCRRs) עם מערכת גילוי אופטית כגון הדמיית תהודה פלזמון על פני השטח (SPRi), ה-eT המתקבל יכול לנטר את אירועי הקישור בזמן אמת וליצור דפוסי זיהוי רציפים כולל פרופיל אבולוציה רציפה דו-ממדי (CEP) ונוף אבולוציה רציפה תלת-ממדית (CEL) עבור דגימות בנוזל. מערכת eT כזו יעילה להבחנה של חלבונים מטוהרים נפוצים.

מבוא

שיטות חישת חלבון מדויקות ומהירים הן חשובות מאוד באבחון רפואי ופרוטאומיקה. מערכים קלאסיים לגילוי חלבון, כגון שבבים, המבוססים על עיקרון ההכרה "המפתח לנעול-and-" ודורשים קולטנים ספציפיים כגון aptamers, נוגדנים, או mimetics.

בשנים האחרונות, חישת ההפרש בהשראת olfaction וgustation האנושיים התפתחה כ1 חלופי. האף / לשון אלקטרונית זה גישה (en / ET) מבוססת על ההפרש המחייב של analytes למערך של קולטנים צלב-reactive (CRRs), שלא צריך להיות מאוד ספציפי או סלקטיבית למולקולות המטרה ובכך לאפשר להתגבר מייגע תהליך של פיתוח קולטנים בררנים במיוחד. זה התגובה המשולבת של כל הקולטנים שיוצר דפוס מובהק עבור כל דגימה, כמו טביעת אצבע, המאפשר זיהוי שלו.

שני אתגרים מרכזיים לפיתוח elecהאף / לשון tronic לחישת חלבון יעילה היא הייצור של רכיבי חישה כי יש את היכולת להבחין בין analytes מבני דומה ומערכת התמרה המתאימה לאירוע המחייב. עד עכשיו, מחקרים דיווחו גישות שונות לפיתוח מערך 2. לדוגמא במחקר אחד מבוסס זיהוי מערך של חלבונים שפותח באמצעות CRRs הוכן מנגזרי טטרה-carboxyphenylporphyrin על ידי צימוד קבוצות carboxyl לחומצות אמינו שונים או dipeptides לספק קולטנים ההפרש בעל ליבה הידרופובי לזיקה לחלבונים ופריפריה טעונה ברורה ל ההפרש הקניית מחייבת. באמצעות מערכת זו, חלבונים שונים ותערובות חלבון זוהו על ידי מדידת מרווה הקרינה של קולטנים על אינטראקציה עם analytes 3,4. במחקר אחר, ספרייה של 29 CRRs מכיל tripeptide וmoieties חומצת boronic המסונתזת בדרך קומבינטורית על hexasubstiפיגום בנזן tuted פותח עבור חישת חלבונים עם גילוי colorimetric מחוון הספיגה 5,6. עם עיצוב כזה, כל קולטן הראה יכולת מחייבת ההפרש עם חלבונים המבוססים על השונות בזרועות פפטיד, וחומצות boronic סייעו בבידול של חלבונים מגליקופרוטאינים. לאחרונה, מערך המורכב של חלקיקי זהב שונים קטיוני פונקציונליות מצומדות עם פולי אניוני ניאון פולימר (p-phenyleneethynylene) (PPE) נוצר כדי לאתר ולזהות חלבונים 7. התחרותי מחייב בין analytes החלבון ורווית מתחמי nanoparticle / זהב PPE מחדש הקרינה, ייצור תבניות הכרה ברורות לחלבונים. במחקר זה, אינטראקציות חלקיק החלבון פונקציונליות היו מכוונת על ידי שינוי מאפייני physicochemical של קבוצות קצה חלקיק. יתר על כן, הם הראו שגישה זו היא יעילה לניתוח חלבונים במדיום עשיר חלבון מורכב וכאלהכסרום אנושי בריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, ובכך מראה את הפוטנציאל של ET בפרופיל דוגמאות אמיתיות לאבחון מצבי מחלה 8.

למרות שמאוד מבטיח, יש לי מערכות אלה כמה מגבלות מובנות. הם דורשים עיצוב וסינתזת 5-29 CRRs עם מבנים מורכבים למדי. בנוסף, בניגוד למערכת חוש הריח שמתאפסת לאחר כל מדידה, חישת חלבון דורשת הכנת מערך לדגימה. לבסוף, אירועים המחייבים ניטור בזמן אמת קשים מאוד.

בהקשר זה, גישה קומבינטורית הוצעה על ידי שימוש במספר קטן של מולקולות פשוטות ונגישים בקלות עם מאפייני physicochemical שונים (הידרופילי, הידרופובי, מטען חשמלי חיובי, מטען שלילי, ניטראלי, וכו '.) כאבני בניין (BBS) 9. על ידי ערבוב הביבי במשתנה ופרופורציות מבוקרות ומאפשר תערובות לעצמיות להרכיב על משטח הזהב שלפריזמה, מערך של משטחים קומבינטורית הכוללים תכונות מתאימות לכריכה חלבון נוצר. יש לציין, monolayers העצמי התאספו במערכת זו מאפשר כוונון קל של מגוון רחב של מאפייני פני השטח באופן סוטה ביותר, המאפשר לקולטנים שונים קומבינטורית צלב-reactive (CoCRRs) להיות מיוצר במהירות וביעילות. חישת חלבון בוצעה באמצעות מערכת זיהוי אופטית, משטח הדמיה בתהודה plasmon (spri). בקצרה, אור מקוטב מונוכרומטי רחב קרן מLED מאיר את כל אזור מערך CoCRR על פני השטח של פריזמה. מצלמת וידאו CCD ברזולוציה גבוהה מספקת תמונות הבדל בזמן אמת בכל הנקודות של מערך CoCRR. היא לוכדת את כל השינויים המקומיים על פני השטח של מערך CoCRR מתן מידע מפורט על אירועים מחייבים ותהליכים הקינטית 10. בינתיים, בעזרת תוכנת הדמיה, תמונות SPR המתאימות לכתמים תומרנה אוטומטית לווריאציות של versu רפלקטיביותזה זמן, שהניבו סדרה של עקומות מחייבות הקינטית נקראות sensorgrams. לפיכך, spri מאפשר התבוננות תווית חופשית, סינכרוני, מקבילה, בזמן אמת של אירועים מחייבים. בנוסף, מערך CoCRR המתקבל הוא regenerable וניתן לשימוש חוזר לניתוח חלבונים.

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של הלשון האלקטרונית באמצעות מולקולות קטנות רק שני כאבני בניין וממחיש את בקשתה לניתוח של חלבונים נפוצים המבוססים על דפוסי הכרה מתמשכים שהושגו עם spri.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

.1 הכנת פתרונות שונים ודוגמאות חלבון

  1. הכן של פתרון פוספט חיץ (PBS-G) המכיל 50 מ"מ לאא 2 PO 4, 50 mM NaCl 100 מ"ל, וגליצרול% 10 בpH 6.8.
  2. הכן 250 מ"ל של תמיסת חיץ HEPES מכיל 10 HEPES מ"מ, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20 בpH 7.4.
  3. הכן פתרון מניות של אבן בניין 1 (BB1) לחסום לקטוז ובניית 2 (BB2) הגופריתית לקטוז (איור 1) ב0.2 מ"מ בPBS-G.
  4. הכן 1 מ"ל של פתרונות חלבון בHEPES: לקטינים hypogaea rachis (AHL) בשעה 500 ננומטר, מיוגלובין ב1 מיקרומטר, ויזוזים ב500 ננומטר.
  5. הכן 20 מ"ל של 1% SDS במי ultrapure.

2 הכנת מערך CoCRR

  1. נקה את משטח הזהב של hr פריזמה 48 לפני שימוש עם שואב פלזמה למשך 3 דקות בתנאים אלה: חמצן 75%, 25% ארגון, 0.6 mbar, כוח 40 W.
  2. הכן solutio הטהור ומעורב אחד עשרהns של BB1 וBB2 עם [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחסים בין 0 ל 100% במרווחים של 10% בריכוז BB כולל של 0.1 מ"מ בPBS-G.
  3. הפקדה 8 טיפות NL של פתרונות טהורים ומעורבים אלה על פני השטח המנסרה באמצעות ללא מגע צופה בארבעה העתקים עבור כל יחס עם 44 נקודות בסך הכל (איור 2).
    הערה: 10 גליצרול% הוסיף בPBS-G הוא מאוד חשובה כדי להפחית את האידוי ממס והשינוי של ריכוז BB לאחר בתצהיר.
  4. הנח את הפריזמה בתוך צלחת פטרי המכילה 1 מ"ל של מים ultrapure ולהשאיר אותה O / N ב RT להרכבה עצמית של BB1 וBB2 על משטח הזהב. במסמך זה, הנחה היא כי הרכב פני השטח הממוצע בסאמס המעורב משקף את הרכב הפתרון המעורב בתצהיר (איור 3) 11.
  5. שטוף ביסודיות את הפריזמה עם מים ultrapure ולאחר מכן לייבש אותו תחת זרם של ארגון.

.3 חלבון חישה על ידי spri

  1. הגדר את incubator שבו מנגנון spri ממוקם ב25 ° C כדי למנוע שינויי מקדם שבירה הנגרמים על ידי שינויי טמפרטורה במהלך חישת חלבון.
  2. הכנס פריזמה שטיפה-פונקציונליות שאינו בקיטון אתר Polyether 10 μl (פיק) לזרום תא מחובר למשאבה בשליטת מחשב מזרק, מסלק גזים ושסתום הזרקה בלחץ בינוני 6 יציאות (איור 4). מלא את מערכת הזרימה עם מסונן טרי וdegassed פועל HEPES חיץ.
  3. הסר את הפריזמה השטיפה והכנס את הפריזמה המכילה את מערך CoCRR בתא הזרימה. הפעלת HEPES ב100 μl / קצב זרימה דק '. בעזרתו של מצלמת CCD להסיר בועות אוויר על פני השטח פריזמה על ידי העברת מאגר פועל במהירות.
  4. הגדר את אזור מחקר לכל מקום על ידי ציור עיגול עם הקוטר זהה לתחום עניין של מבוסס על תמונה בניגוד היטב של המערך ועם העזרה של תוכנה משולבת במערכת spri.
  5. עקוב אחר עקומות plasmon, המייצגות משקפיםעקומות ivity בפונקציה של זווית האירוע, לכל המקומות.
  6. בחר את הזווית (מיקום שבו יירשמו עקומות קינטית) עובד במדרון הגבוה ביותר של עיקולי רפלקטיביות. סובב את מראה הסריקה כדי לתקן את זווית עבודה שנבחרה למדידות קינטית.
  7. תמשיך לפעול HEPES באמצעות מערכת הזרימה עד אות רפלקטיביות עבור כל הנקודות היא יציבה וקבועה.
  8. הזרק 1 מ"ל פתרון AHL עם מזרק לתוך לולאת המדגם (500 μl) עם שסתום ההזרקה ב" עומס "עמדה. ואז לשים את שסתום ההזרקה למצב את "זריקה". קצב הזרימה המשמש לכל הזרקת החלבון היה 100 μl / דקה.
  9. התחל מדידות קינטית על ידי ניטור שינויי רפלקטיביות נגד הזמן בו זמנית בכל המקומות.
  10. בסופו של הזרקת חלבון, לשטוף את המערך עם הפעלת מאגר ל8 דקות. לבסוף, להזריק 1 מ"ל 1% SDS להתחדש זה.
  11. חזור על אותו התהליך p האחרroteins.

.4 עיבוד נתונים וניתוח

  1. בעקבות כניסתו של פתרון חלבון לתוך תא הזרימה, מולקולרי מחייב מתרחש וגורם לתזוזה של עקומות plasmon ווריאציה של רפלקטיביות. תוכנת רכישת התמונה ממירה את ערכי עוצמת אור הנמדדים לאפור רמות גוניות, נותנת תמונות SPR איור 5A, ויוצרת וריאציה של רפלקטיביות לעומת זמן, נותן sensorgrams (איור 5).
  2. השתמש בתוכנת מחשוב מתמטיקה לתכנן רפלקטיביות (% R) בסוף כל הזרקת חלבון לעומת [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס כדי ליצור פרופיל 2D רציף אבולוציה (CEP) עבור כל דגימה (איור 5C).
  3. הוסף את [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס בsensorgrams (איור 5) כדי ליצור נוף 3D רציף אבולוציה (CEL) עבור כל חלבון (איור 5D).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לחקור את היכולת של הלשון האלקטרונית לניתוח חלבונים נפוץ, שלושה חלבונים היו בשימוש: AHL, מיוגלובין ויזוזים. לכל חלבון, פרופיל שונה 2D רציף אבולוציה, CEP, נוצר על ידי ET, כפי שמוצג באיור 6.

בנוסף, הודות לspri, שהוא מסוגל לעקוב אחר קינטיקה הספיחה וdesorption בזמן אמת, לכל חלבון זמן דפוס הכרה מתמשכת תלוי, נקרא נוף 3D רציף אבולוציה (CEL), נוצר. באיור 7, cels האופייני של שלושת חלבונים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים הקריטיים ביותר לבנייה של ET זה מוקדשים כדי להבטיח שחזור טוב של המערכת. לדוגמא, לנקות את משטח הזהב של פריזמה עם הליך סטנדרטי לפני השימוש, הוספת 10% מגליצרול באחד עשרה פתרונות טהורים ומעורבים של BB1 וBB2 לחסל אידוי ממס במהלך BBs עצמי הרכבה על משטח הזהב של פריזמה, הפקדת משכפל מרובה עבור כל [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס, וכו '. באשר לחישת חלבון על ידי spri, הבחירה של זווית העבודה היא קריטית. בדרך כלל, זה קבוע במדרון הגבוה ביותר של עיקולי רפלקטיביות. בנוסף, זה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

המחברים מבקשים להודות למענק הדוקטורט של LANEF בגרנובל על תמיכתה של לורי-אמנדין גרסון. עבודה זו נתמכה כספית על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-grant 06-NANO-045).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשירי SPRi Horiba Scientific-GenOpticsSPRi ממוקם בחממה מווסתת טמפרטורה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
אינקובטורממרט
 מכשירים מדעיים CavroCavro XLP 6000
Micro Elite Degasser AlltechAT590507
שסתום הזרקת לחץ בינוני עם 6 יציאותUpchurch Scientificנפח לולאת ההזרקה בשימוש הוא 500 µl.
מנקה פלזמה Femto (גרסה 7)של Dienerעם 2 ערוצים.
ספוטרSiliflowזהו ספוטר פיזואלקטרי ללא מגע.
SPRi-BiochipHoriba Scientific-GenOptics36000067המנסרה עשויה מפריזמת זכוכית בעלת מקדם שבירה גבוה המצופה בסרט זהב דק (45 ננומטר) ופותחה במיוחד למטרות הדמיה.
לקטין אריתרינה קריסטגאלי Sigma-AldrichL5390
Arachis hypogaea לקטין  סיגמא-אולדריץ'L0881
מיוגלוביןסיגמא-אולדריץ'M1882
ליזוזיםסיגמא-אולדריץ'L6876
CXCL12 ואלפא;סופק על ידי ד"ר Hugues Lortat-Jacob; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
CXCL12γ  סופק על ידי ד"ר Hugues Lortat-Jacob; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
לקטוזשסופק על ידי פרופ' דיוויד בונף;; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
לקטוזסופק על ידי פרופ' דיוויד בונףé; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
גליצרולSigma-AldrichG5150
SDSSigma-AldrichL4509
Tween 20Sigma-Aldrich274348
HEPESSigma-AldrichH3375
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichS0751
נתרן כלוריSigma-AldrichS3014
מכשיר משאבת מזרק מערכת הסרת גז אלקטרונית מקוונת גופרתי

מקורות

  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
  3. Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
  4. Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
  5. Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
  6. Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
  7. You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
  8. De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
  9. Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
  10. Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
  11. Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גישה קומבינטוריתדימוי תהודה של פלסמוני שטחפרופיל אבולוציה רציפהנוף אבולוציה רציפהקולטנים בעלי תגובה צולבתמונושכבות בהרכבה עצמיתתערובות של אבני בנייהעקומות קישור קינטיות
לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.