Assay כל cytotoxicity הדם (אש"ל) הוא assay cytotoxicity שפותח על ידי שילוב טכנולוגיית מיקום תא תפוקה גבוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועיבוד תמונה אוטומטי. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן לנתח תאי הלימפומה שטופלו בנוגדן anti-CD20 בזמן אמת בכל דם אדם כדי לספק ניתוח cytotoxicity סלולארי כמותי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בזמן אמת Cytotoxicity מבחני בדם כל אדם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Assay חי המבוסס על תא כולו דם רעיל (אש"ל), המאפשר גישה למידע זמני של cytotoxicity התא הכוללת הוא פותח עם טכנולוגיית מיקום תא תפוקה גבוהה. אוכלוסיות התאים סרטניים הממוקדות מתוכנות מראש ראשונה לחוסר מעש לתבנית מערך, ושכותרתו עם צבעי ניאון cytosolic ירוקים. לאחר הקמת מערך תאים, תרופות נוגדנים מתווספות בשילוב עם כל דם אנושי. יודיד Propidium (PI) הוא הוסיף אז להעריך מוות של תאים. מערך התאים מנותח עם מערכת הדמיה אוטומטית. בעוד צבע cytosolic תוויות אוכלוסיות תאים סרטניים הממוקדות, PI תוויות אוכלוסיות תאי גידול המתים. כך, שיעור הרג תאים סרטני היעד ניתן לכמת על ידי חישוב המספר של הישרדות בתאים ממוקדים למספר התאים הממוקדים מתים. בשיטה זו, חוקרים יכולים לגשת תלוי זמן ומידע cytotoxicity התא תלוי במינון. למרבה הפלא, אין רדיו מסוכןכימיקלים המשמשים. אש"ל מוצג כאן נבדק עם לימפומה, לוקמיה, ושורות תאי גידולים מוצקות. לכן, אש"ל מאפשר לחוקרים להעריך את יעילות תרופה במצב רלוונטי ביותר ex vivo.
מבוא
התקדמות שחלה באחרונה בתעשיית התרופות הובילה להתעניינות גוברת במימוש ההזדהויות הספציפיות של נוגדני תאים סרטניים וטיפולים בסרטן מותאמים אישית; עם זאת, כמה מכשולים נתקלו בתהליך. רק 5% מסוכנים שיש להם פעילות אנטי-סרטנית בפיתוח פרה-קליני ברישיון לאחר שהציג יעילות מספיקה בשלב הבדיקות השנייה-שלישית 1,2. האסטרטגיות פרה-קליני (הן במבחנה in vivo) הן הכי מוצלחות כדוגמאות רבות הראו כי תרופות אנטי-סרטניות מתנהגות באופן שונה באדם ובחיות מעבדה בעיקר בשל מרכיבי הדם השונים שלהם 3-5.
כדי לתת מענה לצורך של פלטפורמת הקרנת סמים אנטי-סרטנית ולספק ביצוע צ'ק-אין נקודה לפני ניסויים בבעלי חיים יקרים וניסויים קליניים, assay אדם שלם cytotoxicity הדם (אש"ל) מוצע להערכת יעילות תרופה אנטי-סרטנית בסביבה ביולוגית רלוונטית יותר.assay cytotoxicity דם כל יכול לשמש כדי להעריך את התגובה של תאים בודדים לנוגדנים ותרופות פוטנציאליים אחרות בכל דם אנושי.
אש"ל הוא פותח על ידי שילוב טכנולוגיית מיקום תא תפוקה גבוהה עם תפוקה גבוהה וגבוה-תוכן הדמיה 6. על ידי ניצול מערכת הדמיה אוטומטית, מספר שני תאי החיים ומתים ניתן לקבוע ברמה גבוהה של דיוק. בשל העובדה שתאי המטרה הם משותקים באותו מישור המוקד, אש"ל הוא מסוגל לספק ניתוח רעיל כמותי בזמן אמת, ללא ההסרה של תאי דם אדומים. יתר על כן, מערכת ההדמיה האוטומטית מספקת מספר יתרונות כגון שרק תאי היעד שהגיעו לקריטריונים שצוינו (לדוגמא., תאים שכותרתו fluorescently, ומורפולוגיה של תאים) הם מגודרים ומעובד. כמו כן, היא מאפשרת הייצור של 144 צלחות ביום. כתוצאה מכך, יכולת הדמיה זו ותפוקה מאפשרת ריצה של ההיי-גontent וניסויים תפוקה גבוהה בו זמנית. על ידי שילוב של אש"ל ומערכת ההדמיה האוטומטית, ניתוח cytotoxicity תא כמותית גבוהה תפוקה ניתן להשיג בסביבה רלוונטית יותר ביולוגית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תא יעד הכנה
- לשמור (תאים למשל. ראג'י לימפומה) תאי מטרה בתקשורת צמיחה (תרבות בינונית 1640 RPMI, עם 10% בסרום חום מומת שור העובר (FBS), 4nM L- גלוטמין, ו -500 IU / פניצילין מיליליטר / סטרפטומיצין) ב 37 o C ב5% CO 2 באינקובטור.
- צנטריפוגה המדגם לגלולת תאי היעד בשפופרת 15 מיליליטר. זמן צנטריפוגה משתנה עם תאים מסוגים שונים; צנטריפוגות 3 דקות ב 468 XG לתאי ראג'י.
- לשאוב ראשון כל בועות נוצרו על פני השטח של supernatant, ולהסיר את כל supernatant.
- להוסיף 10 מיליליטר של PBS על הצינור. Re- להשעות תאים על ידי pipetting את הפתרון ומטה מספר פעמים כדי לשבור את גוש התא.
- צנטריפוגה מדגם 3 דקות ב 468 x גרם.
- לשאוב כל בועות נוצרו על פני השטח של supernatant, ולהסיר את כל supernatant.
2. הכנת Microarrays הסלולרי
- Oמצורף תא btain 96 ערכות צלחת גם או מערך תאים 8 שקופיות קאמריות גם אחד (ראה טבלה של חומרים / חומרים כימיים).
- החל 1.2 μl של Activator למגיב DNA מהערכה. מכסה את הבקבוקון, להפוך אותו, ובעדינות לנער כדי לערבב את הפתרון.
- אפשר הפתרון להגיב במשך 20 דקות ב RT.
- ליישם את הפתרון המעורב לגלולת תאי היעד (בצינור 15 מיליליטר).
- להוסיף צבעי cytosolic הקרינה ירוקים בריכוז סופי של 500 ננומטר.
- דגירה תאי היעד עם הפתרון המעורב והצבע למשך 30 דקות ב RT על שייקר מסלולית.
- לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מיליליטר PBS, וresuspend תאי תקשורת 10 מיליליטר צמיחה.
- החל מהפתרון 100 μl מצעד 2.7 היטב כל אחד. לספור את מספר התאים על ידי שימוש בhemacytometer. הפוך מספרים סלולריים בטוחים בטווח שבין 5 × 4-1 אוקטובר × 10 6 תאים לכל טוב.
- לאחר 10-15 דקות של דגירה על RT, לשטוף בעדינות את הדגימות פעמיים עם 200-300 תקשורת צמיחת μl להסיר כל תאים מאוגד.
הערה: על 5-10 תקשורת צמיחת μl נשארה בכל אחד גם לאחר כביסה.
3. דם מלא Cytotoxicity מבחני
- להוסיף 180 μl של כל דם אנושי לכל דגימה היטב.
- השג פתרון נוגדן Anti-CD20 בשעה 5 מ"ג / מיליליטר, ולבצע דילול סדרתי לעשות 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר של תמיסת נוגדן Anti-CD20 בצינורות 1.5 מיליליטר. הוסף 20 μl של כל ריכוז של נוגדני Anti-CD20 מדגם זה גם מה שהופך את triplicates.
- להוסיף יודיד Propidium בריכוז סופי של 500 ננומטר היטב כל אחד.
- דגירה את הצלחת וכתוצאה מכך ב 37 ° C עם 5% CO 2 במשך 16 שעות.
- תמונת התאים בשקופיות או 96 צלחות גם עם מערכת הדמיה אוטומטית עם הגדלה 8X.
- השתמש בתכנית ספירת תאים של מערכת ההדמיה האוטומטית לכמת את התוצאות.
הערה: התוכנה של מערכת ההדמיה האוטומטית מספקת פשוטהצעד אחר צעד פעולות לספירת תאים. ניתן למצוא בפרוטוקול של שימוש בתוכנה זו באתר האינטרנט של הספק. - בחר [תוצאות סקירה] מהדף הראשי של התוכנה.
- בחר [הקובץ שנשמר לדוגמות].
- השער הראשון FITC אומר עוצמה> 50, אז שער TxRed אומרת עוצמה> 20.
- בחר [סקירת פלייט].
- בחר [שולחנות יצוא].
הערה: נוסחת הרג תא אחוז של התכנית מוצגת להלן:
הרג% תא המטרה = (# של תאים המוכתמים שניהם ירוקים ואדום / # של תאים מוכתמים ירוק) * 100%
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנטי-CD20 נוגדנים ותאים לימפומה (תאי ראג'י וMC / CAR) נבחר כמודל למערכת כדי להדגים את כל assay cytotoxicity הדם (אש"ל) 7,8. היו תאי ראג'י מספר עותק גבוה של CD20 על פני התא, ואילו תאי MC / CAR מספר נמוך עותק של CD20 על הממברנה שלהם. תאים ממוקדים הוכתמו ראשון ירוקים עם צבעי cytosolic הקרינה ירוקים ומסודרים על צלחת 96-היטב. 10,000 - 50,000 תאי הלימפומה היעד היו משותקים בכל טוב. 180 μl של כל דם אנושי טרי נמשך נוספה לתוך זה גם. הנוגדן אנטי CD20 נוספו לאחר מכן לבאר כל צלחת גם...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אש"ל הוא קריטי בכלי סינון אנטי-סרטני במבחנה עם רזולוציה תא בודדת 12-16, מנוצלת באופן אידיאלי לאחר הקרנות יעד מסורתיות כגון ה- CDC ומבחני ADCC 9-11, ולפני ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. נכון לעכשיו, מבחני סינון המטרה העיקרית כגון CDC או מבחני ADCC כולם מבוצעים בתקשורת פשוטה או מערכת חיץ. עם זאת, לתרופות שמראות יעילות במערכת החיץ הפשוטה אלה לא תמיד יעילות במערכת הדם כל המורכבת יותר. לכן, אש"ל יכול לגשר על הפער בין הקרנות יעד מסורתיו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש סופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים לתכנית IMAT מכון הלאומי לסרטן מNIH למימון עבודה זו [R33 CA174616-01A1].
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חיבור תא 96 ערכות צלחות באר | Adheren | AP9601 | |
| מתלה מערך תאים בודדים 8 שקופיות תא באר | דבק | SS0801 | |
| דבק מערך תאים יחיד 8 שקופיות תא באר | דבק | SS0802 | |
| קו תאי לימפומה CD20 + | ATCC | CCL-86 | תאי ראג'י |
| קו תאי לימפומה CD20-ATCC | CRL-8083 | MC / CAR | |
| RPMI 1640 עם L-גלוטמין | Life Technologies | 11875-119 | |
| סרום בקר | עוברי תרמו | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| צבע ציטוזולי | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| דם מלא אנושי | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| מערכת הדמיה אוטומטית | מכשירים מולקולריים | צור קשר ספק | Cell Reporter |
| תוכנית ספירת תאים | מכשירים מולקולריים | צור קשר עם הספק | Cell Reporter |
מקורות
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85(2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
