הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

רביה של

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51953

⸱

25 בספטמבר 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפיץ תאי vitripennis Homalodisca וHoCV-1 במבחנה. בינוני הוסר מHoCV-1 תרבויות חיוביות וRNA שחולץ כל שעה 24 ל168 שעה. שרידות תא הייתה לכמת ידי מכתים trypan הכחול. חלקיקי נגיף שלמים חולצו לאחר פגיעה. RNA שחולץ היה לכמת ידי qRT-PCR.

תקציר

הצלף מזוגגת מכונף (Homalodisca vitripennis) הוא חרקים vagile וpolyphagous מאוד למצוא בכל רחבי מערב ארצות הברית. חרקים אלה הם הווקטורים העיקריים של (fastidiosa X.) fastidiosa Xylella, חיידק מוגבל עצה שהוא הסוכן סיבתי למחלתו של פירס (PD) של גפן. מחלתו של פירס היא מבחינה כלכלית מזיקה; וכך, ה ' vitripennis הפך יעד לאסטרטגיות ניהול הפתוגן. Dicistrovirus זוהה כוירוס-01 coagulata Homalodisca (HoCV-01) נמצא קשור לסיכון מוגבר לתמותה בח אוכלוסיות vitripennis. בגלל נדרש תא מארח עבור שכפול HoCV-01, תרבית תאים מספקת סביבה אחידה לשכפול ממוקד שהוא מבחינה לוגיסטית וכלכלי רב ערך לייצור biopesticide. במחקר זה, מערכת להפצה בקנה מידה גדולה של ה ' תאי vitripennis באמצעות תרבית רקמה פותחו, עמ 'roviding מנגנון שכפול נגיפי. HoCV-01 היה שחולץ מן החרקים בכל גוף ומשמש ללחסן ה התרבותית תאי vitripennis ברמות שונות. מדיום התרבות הוסר כל שעה 24 ל168 שעה, RNA חילוץ וניתח עם qRT-PCR. תאים הוכתמו trypan הכחול ונספרו לכמת שרידות תא באמצעות מיקרוסקופ אור. חלקיקי נגיף שלמים הוצאו עד 96 שעות לאחר הדבקה, שהייתה נקודת הזמן שנקבעה להיות לפני קריסה מוחלטת תרבית תאים התרחשה. תאים גם היו נתונים לצביעת ניאון ונצפו באמצעות מיקרוסקופ confocal לחקור פעילות נגיפית בשלמות התקשרות וגרעיני F-אקטין. המסקנה של מחקר זה היא כי ה ' תאי vitripennis מסוגלים להיות מתורבת ומשמש לייצור המוני של HoCV-01 ברמה מתאימה שיאפשר ייצור של biopesticide.

מבוא

הצלף מזוגגת המכונף (Homalodisca vitripennis Germar 1821) זוהה כווקטור העיקרי של fastidiosa (fastidiosa X.) Xylella, הסוכן סיבתי של מחלת פירס של גפן (PD) בצפון אמריקה 1. ניהול אוכלוסיית חרקים הפך במהירות למוקד של מחקר כדי להילחם בבעיה הרסנית הזאת לתעשיית גידול הגפנים בקליפורניה וברחבי ארצות הברית הדרום. חיובי תחושה, וירוס RNA חד גדילים השייכת למשפחה Dicistroviridae, Homalodisca-01 וירוס (HoCV-01) זוהה coagulata בה הפראית אוכלוסיות vitripennis והוצג להגדלת תמותה באוכלוסיות אלה 2-4, תוך הפחתת ההתנגדות של החרקים לחומרי הדברה.

פיתוח שיטות ליעילות אחורי נגוע ח vitripennis לבגרות במעבדת הגדרה היה קשה משום ש H. יש לי vitripennis הצרכים בשלב מסוים שונים תזונתיים הדורשים מגוון רחב של צמחי מארח 5-8. מתקנים ספציפיים נדרשים לה 'חי אחורי vitripennis בארצות הברית; לכן, תרבית תאים היא חסכונית יותר וחלופה, כמו גם חיונית יותר ויותר לHoCV-01 זיהוי ושכפול 2,9. בעוד שיטות בסיסיות להקמת תרביות תאים של ה vitripennis מתוארים, שיטות אלה עדיין לא נוצלו לייצור מסחרי של סוכני הדברה ביולוגיים, כגון וירוסים 2.

המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא לייצר ריכוז גבוה של HoCV-01 מתאים לניצול כסוכן הדברה ביולוגי. שכפול נגיפי דורש תא חי, וזאת הסיבה שהצלחת טיפוח וייעול ה ' תרבויות vitripennis היא חיוניות להתקדמות של הפקת רמות רווחיות של וירוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תרבות .1 סלולארי

הערה: שורות תאי vitripennis Homalodisca שהוקמו על ידי המעבדה ד"ר ויין האנטר במשרד חקלאות מנהל המחקר החקלאי השירות (. Ft פירס, פלורידה ארה"ב) שמשו ליזום מניית מעבדה מורכבת משלבי תא מעורבים כוללים פיברובלסטים וmonolayers ראשוניים.

  1. בצע את ההליכים הבאים בסביבת מעבדה סטרילית נשמרה בטווח טמפרטורות של C ° 20-24 עם 25 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות.
  2. לטפח ולשמור על תרבויות ב25 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית רקמה באמצעות מדיום H2G + Leafhopper, תקשורת דבורת דבש WH2 הותאם 10 (טבלה 1).
  3. דגירה צלוחיות תרבות ב24 מעלות צלזיוס עם לחות ~ 53%.
  4. שימוש במיקרוסקופ הפוכה בהגדלת סך הכל (TM) של 100X כדי לפקח על צמיחת תרבות, למשל, לבדוק כל צמיחה סלולרית נורמלית, לפקח על כל מזהמים פוטנציאליים, ולבדוק את התקדמות צמיחה ברחוב ללא מוצאמשטח ture.
  5. לבצע שינוי מוחלט בינוני (~ מדיום תרבות 4 מ"ל לכל בקבוק) כל 7 - 10 ימים מבלי להפריע את פני השטח התרבות.
  6. Pass תרבויות כאשר משטח התרבות הוא כ 80% מכוסים על ידי גדילת תאים (מחוברות) באמצעות טריפסין 0.25% המכיל חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לנתק את התאים. להוסיף ~ 2 - 3 מ"ל של טריפסין לכל בקבוק תרבות ולחשוף תרבות (ים) לאנזים לתקופות קצרות של זמן (5 - 10 דקות) כדי להשיג ניתוק תא שלם.
  7. להוסיף כמות שווה של מדיום טרי לבקבוק התרבות (ים) (~ 2 - 3 מ"ל) כדי להפסיק את פעילות אנזים ולהעביר את כל הפתרון לצינור חרוטי לצנטריפוגה.
  8. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות ב350 x גרם.
  9. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התא ולהוסיף ~ 8 מ"ל של מדיום טרי על צינור אחד. בעדינות homogenize תאים באמצעות פיפטה.
  10. תרבויות פיצול ב1: 2 יחס ל25 2 צלוחיות סנטימטר (~ 4 מ"ל של soluti התאעל כל בקבוק) ולהשאיר את תרבויות טריות עברו ללא הפרעה ל48 שעות כדי לאפשר לתאים בתרחיף לצרף היטב למשטח של הבקבוק.
    הערה: טיפוחם של תאים ב48 גם צלחות תרבית רקמה סטרילית עם משטח צמיחה של 1 סנטימטר 2 הוא גם אפשרי והם יכולים להישמר באותו אופן כמו צלוחיות תרבות עם ירידה בנפח של מדיום התרבות ~ 250 μl.

2 הפקת וירוס שלמה

  1. Homogenize גופות של ה 'החיובית הווירוס שלמות vitripennis בחיץ פוספט, pH ~ 7.2, עם הידראט 0.02% diethyldithiocarbamate נתרן (DETCA) על ידי vortexing ל~ 10 מרווחי שניות עד שאין גושים גדולים יותר של רקמה הנוכחית. לחלץ וירוס באמצעות צנטריפוגה SuperSpeed ​​ב124,500 XG במשך 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס או 22,000 XG ל16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. אם צורות משקע בחלק העליון, להסיר אותו עם מקלון צמר גפן סטרילי 11.
  2. בטל supernatant.
  3. לאסוף את הכדור ולפזר עם חיץ 5 מ"ל של 10 מ"מ פוספט (לא DETCA), pH ~ 7.2, המכיל 0.4% חומצת Na-deoxycholic ו -4% אתר hexadecyl פוליאתילן גליקול (Brij 52).
    1. לערבב את הכדור היטב, להסיר את גלולה מהצד של הצינור ולרסק עד בפתרון במידת צורך.
    2. הוסף עוד חיץ פוספט 10 מ"מ ב~ קפיצות של 5 מ"ל כדי לעזור גלולה להיכנס לפתרון במידת הצורך, ולשלב לתוך 2 צינורות 11.
  4. צנטריפוגה פתרון XG 300 15 דקות 11.
  5. הסר את supernatant ולהעביר את הפתרון דרך פילטר 0.45 מיקרומטר, ולאסוף את התסנין בצינור איסוף גדול 11.
  6. העברת תסנין לקרום דיאליזה עם משקל מולקולרי מנותק (MWCO) של 3.5 KD, המשתמש בכמויות קטנות של 10 מ"מ חיץ פוספט (pH 7) המכיל לא DETCA במידת צורך 11.
  7. מניחים את קרום הדיאליזה בכוס גדולה מלאה עם DDH 2 O על 4 מעלות צלזיוס. לשנות את DDH 2 O כל f שעהאו 5 - 6 שעות, עד לקבלת משקע לבנה בקרום 11.
  8. לאסוף את הווירוס המטוהר מתוך הקרום ולהכפיף 100% פתרון הווירוס לסדרת דילול של פי 10 על ידי הוספת 10 μl של פתרון ל90 μl של DDH 2 O. בהמשך לכך להוסיף 10 μl של הדילול למשנהו 90 μl של DDH 2 O עד שמגיע לדילול של 1: 100,000.
  9. פתרון וירוס חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

.3 שכפול נגיפי

  1. תאי זרע בצלחות תרבות 48 היטב ולגדול כל השורות עד שצמיחת תאים היא 80% ומחוברות (כ 72 hr ההודעה pass-אם תאים גדלים בקצב ממוצע).
  2. לחסן כל שורה של תאים בנגיף המדולל סדרתי פעם צמיחת תאים מגיעה confluency, כלומר, שורה אחת של דילול 1:10, שורה אחת של דילול 1: 100, וכו ', פרט לשורה העליונה. השתמש בשורה העליונה כביקורת ולהוסיף 10 μl של DDH 2 O לכל אחד גם שליטה על עוצמת קול.
    1. כדי להקים ריכוז תא בסיסי מתחיל להשוואה עם ספירת תאים ניסיונית, לנתק ולספור את הבאר הראשונה של כל שורה לפני החיסון הראשוני של בארות כל בתרבויות עם וירוס.
  3. צג צלחות תרבות כל 24 שעות לאחר חיסון נגיפי לכל שינוי צבע במדיום המצביע על שינוי pH ולכל שינויים במורפולוגיה של תאים.
  4. עמודה אחת תמונה של צלחת בדיקה בכל נקודת זמן, באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ב100X TM.
  5. הסר את כל הבינוני מהעמודה שצלמה בכל נקודת זמן 24 שעות ולאחסן לטווח קצר זה ב -20 מעלות צלזיוס להפקת RNA וכימות נגיפי או לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.
  6. לנתק את התאים מהבארות לאחר הסרת הבינוני כפי שתואר לעיל בצעדים 1.6-1.9, רק באמצעות ~ 250 μl של 0.25% EDTA טריפסין ובינוניים טריים כדי להפסיק את פעילות אנזים ו~ 250 μl של מדיום טרי מחדש להשעות Pelle התאt.
  7. הוסף 10 μl של כתם הכחול trypan 0.4% לכל צינור המכיל תאים לבצע ספירת תאים לאחר תא ניתוק לכל תקופה 24 שעות בשבוע אחד. לאפשר כתם לשבת עבור 10 דקות לפני ביצוע ספירת תאים.
    1. לבצע ספירת תאים בתוך שעה 1 של חשיפה ללהכתים או תאי קיימא יתחיל ספיגי כתם כמו גם תאים שאינם ברי קיימא.
  8. לאט לאט להוסיף 10 μl של פתרון התא המוכתם לכל צד של hemocytometer סטנדרטי באמצעות micropipette. אפשר הפתרון שיש לנקוט על ידי פעולת נימים כדי למנוע בועות אוויר.
  9. לספור את מספר תאי קיימא (לא צבעוניים) בשני הצדדים של hemocytometer (המקביל של 4 סעיפים של 16 הריבועים בhemocytometer). לבצע ספירת תאים לכל טוב של העמודה שהוסרה.
  10. ממוצע ספירת תאים מכל עמודה והשתמש בנוסחא הבאה כדי לקבל את המספר הכולל ספירת תאים: (מספר ממוצע של תאים / 4) גורם לדילול x = מספר תאי x 10 4 מ"ל. זוהי צפיפות תאים או מספר תאי קיימא בתרבות.

.4 הפקת וירוס מתרבית תאים

  1. הסר ה טופלה תאי vitripennis מצלוחיות התרבות כפי שתואר לעיל בצעדי 1.6-1.8, רק באמצעות ~ 250 μl של 0.25% EDTA טריפסין ובינוניים טריים כדי להפסיק את פעילות אנזים.
  2. בטל supernatant.
  3. לחלץ וירוס מתאי התרבות הבאה הפרוטוקול שתואר קודם לכן בצעדים 2.3-2.8.

.5 הפקת RNA

  1. לחלץ RNA מדגימות בינוניות שנאספו במהלך כל ניסוי וירוס אחד בשבוע באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium המיועד לדגימות נוזל לפרוטוקול של היצרן.
  2. חנות חילוץ דגימות ב-80 מעלות צלזיוס.

.6 RT-PCR

  1. לקבוע סטנדרטים נגיפיים לRT-PCR על ידי הפעלת PCR המסורתי באמצעותזוג פריימר פריימר HoCV RT-PCR 1 (קדימה 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', להפוך 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') עם וירוס לבודד מח כל הגוף vitripennis.
  2. מוצר PCR בכפוף לג'ל אלקטרופורזה ל60 דקות ב 120 V בagarose ג'ל 2% מכיל 0.1% ברומיד ethidium.
  3. בלו הלהקות מג'ל ולטהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הפרוטוקול של היצרן.
  4. בריכה כל נכרתה ומוצר ג'ל מטוהר ולטהר עוד יותר על ידי משקעים אתנול בסיסיים. Elute מוצר ממטרים בכ 30 μl של טריס EDTA (TE) כדי להגדיל את ריכוז המדגם הכולל.
  5. לכמת את הרמה של cDNA בדגימות נקוו באמצעות ספקטרופוטומטריה באמצעות 260/230 הגדרות אורך גל לגילוי חומצות גרעין.
  6. לבצע סדרת דילול סדרתי פי עשרה מהמדגם המטוהר החל 57 ng / μl ל57 AG / μl (10 -18). לבצע דילול סדרתי דומה לזה שתואר in 2.8 עם התאמות שבוצעו עבור ההבדל בדרישות ריכוז.
  7. לקבוע מגבלות זיהוי של סדרת הדילול על ידי ביצוע qRT-PCR באמצעות ערכת qRT-PCR עם כימות אמין של תמלילים נמוך שפע.
    הערה: ריכוזים נגיפיים נמוכה מ 5 x 10 -3 עותקים אינן יכול לאתר.
  8. לחלץ RNA מדגימות ניסוי כפי שתואר לעיל בשלב 5.1 ולכמת באמצעות ספקטרופוטומטריה.
  9. לנרמל את כל הדגימות שחולצו עד 5 ng / μl באמצעות מים חופשיים nuclease.
  10. בצע qRT-PCR על כל הדגימות, בכפילויות, כ25 תגובות μl באמצעות ערכת qRT-PCR צעד אחד עם היכולת לחוש מספרים נמוכים עותק כדלקמן: 50 ° C להחזיק עבור 10 דקות; אחיזת C 95 מעלות למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; להמס 50-99 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות בכל אחד משלבים.
    1. לעשות את מיקס מאסטר, כך שכל תערובת תגובה מכילה 12.5 μl של maste 1xתמהיל r, 1.0 מיקרוליטר (0.3 מיקרומטר) של פריימר קדימה, 1.0 מיקרוליטר (0.3 מיקרומטר) של פריימר ההפוכה, 0.25 μl של טרנסקריפטאז וכמויות משתנות של תבנית המבוססת על ערכים תקינה.
    2. להביא את סך נפח תגובה ל25 μl עם מים חינם RNase.
    3. כוללים חמישה ריכוזים סטנדרטיים בכל PCR לרוץ עם עותק המספרים הבאים: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, ו5 x 10 -2 עותקים. הגדר את הסף לכל ריצה עד מתחת הקרינה של 10x -2.5 כדי להפחית את הרעש במהלך רכישה מוקדמת בתחילת כל סיבוב.

.7 Confocal מיקרוסקופית

  1. לגדל תאי vitripennis Homalodisca בשנתי עשר coverslips זכוכית היטב צלחת המכילה מדידת 18 מ"מ קוטר בכל טוב.
  2. לחסן עמודה אחת על הצלחת כל שעה 24 לתקופה של ארבעה ימים, פעם אחת monolayer מושגת. ודא שכל גolumn מכיל פקד גם, דילול נמוך נגיפי (1:10) היטב ודילול גבוה נגיפי (1: 100,000) גם. השתמש בפתרוני וירוס המתקבלים מצעד 2.8.
  3. הסר את כל אמצעי התקשורת ביום החמישי ולשטוף תאים פעמיים עם 1x PBS (pH 7.4).
  4. תקן את התאים עם paraformaldehyde 4% קרים על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. הוסף 500 μl של 1x פוספט שנאגרו מלוח (PBS) לתאים ולשטוף אותם ל10 דקות ב RT על כיסא נדנדה במהירות נמוכה. שוטף את התאים שלוש פעמים.
  6. הוסף 500 μl של .0.1% טריטון X-100 לתאים לpermeabilize. בואו לשבת במשך 10 דקות ב RT.
  7. לשטוף את תאים שוב כפי שתוארו קודם לכן בשלב 7.5.
  8. הוסף 500 μl של פתרון 5% שור אלבומין בסרום (BSA) לחסום תאים ב RT. בואו לשבת במשך שעה 2 ולאחר מכן להסיר.
  9. לדלל phalloidin מניית Rhodamine האדום מצומדות (RCP) 1: 250 ב1x PBS המכיל BSA 5% ולהוסיף 250 μl של הדילול היטב כל אחד לכתם לF-אקטין.
  10. צלחת כיסוי בf האלומיניוםשמן כדי למנוע מהצבע הלבנה ותאי דגירה על 4 מעלות CO / N.
  11. הסר את RCP לאחר 12 שעות של דגירה ולהחליף אותו עם 250 μl של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (250 מיקרוגרם / מ"ל) בדילול מלא ב1x PBS המכיל BSA 5%, להכתים את הגרעינים של התאים .
  12. דגירה התאים המכילים DAPI ב RT עבור שעה 1.
  13. שטוף תאים שלוש פעמים עם 1x PBS כפי שתואר לעיל בשלב 7.5.
  14. הוצא בעדינות את coverslips מהבארות והר לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות תקשורת הרכבה עם מגיב אנטי לדעוך.
  15. אפשר השקופיות לייבוש בlightproof תיבות שנצפו עד מתחת למיקרוסקופ confocal. צפה בשקופיות מוכנות בהקדם האפשרי כמו צבעים יכולים לדעוך במהירות.
  16. תאי תמונה מוכתמת באמצעות מערכת confocal המצויד במיקרוסקופ המכיל עדשת 63X תכנית-apochromate (שמן).
    1. הגדר את אורכי גל הלייזר ל543 עירור ננומטר ± 10 ו575 פליטת ננומטר ± 10 לphalloidin-conjucated האדום Rhoadmine, ופליטת ננומטר 369 ± 10 עירור ננומטר ו450 ± 30 לDAPI.
    2. השתמש ברווח זהה והגדרות מחוץ לסט לגלאי להשיג את כל התמונות.
    3. תמונות תהליך באמצעות תוכנה מתאימה לעיבוד תמונה ומיון ולייבא תמונות הרצויות לתוכנת ניהול תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מצורף תא והצמיחה נתפסו בתוך 48 שעות של מעבר בשני צלוחיות התרבות הקטנות וגדולות, מתרבויות עיקריות ומעברים המשיכו. גידול פיברובלסטים ופיתוח נצפו גם בתוך מסגרת זמן זו. כאשר צלוחיות זורעים עתה הופרעו לפני 48 שעה, חלה ירידה ניכרת בקובץ מצורף תא, שמוביל לתרבויות איטיות הולך וגדל ולפעמים אין קובץ מצורף או צמיחה בכל. תאים היו כ 80 מחוברות% בתוך שבוע לפטירה אחד ויצרו monolayer ב10-14 ימים (איור 1). תרבויות עיקריות שעובדו בייזום של מחקר זה, ששרדו 30+ מעברי תא ללא כל הידרדרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חששות עולים בנוגע לזרם של מינים חקלאיים פולשני שיובילו לגידול בביקוש למתודולוגיות חדשות להגנה מפני מזיקים ופתוגנים המתעוררים. מוקד מניעת מחלות וניהול כרוך בניהול של וקטורי הפתוגן והיה היעד העיקרי של מחקר זה. כלכלה לשחק תפקיד חיוני בהחלטה לייצר סוג זה של biopesticide לנהל וקטורי הפתוגן בחקלאות, מכיוון שהיישום המעשי צריך להיות כמויות גדולות על פני שטחים גדולים אך במחיר נמוך 12. הפרקטיקה של ניצול תרבית תאים למחקר ופיתוח הפכה נפוצה יותר ויותר ובתור שכזה, השפעותיו של מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לתוכנית המחקר והחינוך של מחלת טקסס פירס ול-USDA-APHIS על תמיכתם במימון פרויקט זה. ברצוננו גם להודות להמה קותארי מהמרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בטיילר על סיועה במיקרוסקופיה קונפוקלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלוחיות תרבית תאי קורנינגSigma AldrichCLS430168שטח פנים 25 ס"מ2, צוואר משומר, כובע (אטם תקע)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71Olympusמיקרוסקופ הפוך ומצלמה
תמיסת Trypsin-EDTASigma AldrichT40490.25%, מסונן סטרילי, BioReagent, מתאים לתרבית תאים, 2.5 גרם טריפסין חזיר ו-0.2 גרם EDTA ושור; 4Na לליטר Hanks′ תמיסת מלח מאוזנת עם פנול אדום
גריינר CELLSTAR צלחות תרבית מרובות בארותסיגמא אולדריץ'M893748 בארות (TC מטופל במכסה)
DETCASigma Aldrich228680נתרן דיאתילדיתיוקרבמט טריהידראט
מערכת מסנן ואקום על בקבוק קורנינגסיגמא אולדריץ'CLS431206קרום אצטט תאית, גודל נקבוביות 0.45 μ M, שטח הממברנה 54.5 ס"מ2, קיבולת סינון 500 מ"ל
Brij 52Sigma Aldrich388831פוליאתילן גליקול אתר hexadecyl
תמיסת חיץ פוספטSigma AldrichP5244התקבל כ-100 מ"מ מדולל ל-10 מ"מ עם מים סטריליים
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304עבור אלקטרופורזה
אתידיום ברומידסיגמא אולדריץ'E7637BioReagent, לביולוגיה מולקולרית, אבקה
QIAquickQiagen28704
ערכת QuantiTect qRT-PCRQiagen204243
4% פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ'P6148דרגת ריאגנט, PBS גבישי
סיגמא אולדריץ'P5368פוספט אלבומין סרום
בקר Triton X-100Sigma AldrichX100
(BSA)Sigma AldrichA2153
Rhodamine Phalloidin מצומד אדוםLife TechnologiesR415Rhodamine phalloidin הוא בדיקה F-actin בעלת זיקה גבוהה המצומדת לצבע הפלואורסצנטי האדום-כתום, tetramethylrhodamine
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36934
LSM510 Meta Confocal SystemCarl Zeiss
LSM Zen 2007 SoftwareCarl Zeiss
Grace' s חרקים בינוניים (בתוספת תשלום, 1x)סיגמא אולדריץ'G8142H2G+ עלים רכיב בינוני
L-היסטידין מונוהידראטסיגמא אולדריץ'H8125H2G+ עלים רכיב בינוני
בינוני 199 (10x)סיגמא אולדריץ'M4530H2G+ עלים רכיב בינוני
בינוני 1066 (1x)סיגמא אולדריץ'C0422H2G+ עלים רכיב בינוני
האנק' מלחים מאוזנים (1x)סיגמא אולדריץ'51322CH2G+ עלים רכיב בינוני
L-גלוטמין (100x)סיגמא אולדריץ'G3126H2G+ עלים רכיב בינוני
MEM, תערובת חומצות אמינו (50x)סיגמא אולדריץ'56419CH2G+ עלים רכיב בינוני
1 M תמיסת MgClסיגמא אולדריץ'M8266H2G+ עלים רכיב בינוני
עט סטרפטוקוקוס (עם/ גלוטמין)סיגמא אולדריץ'G6784H2G+ עלים רכיב בינוני
ניסטטיןסיגמא אולדריץ'N6261H2G+ עלים רכיב בינוני
GentamycinSigma Aldrich46305H2G+ עלים רכיב בינוני
דקסטרוזסיגמא אולדריץ'D9434H2G+ עלים רכיב בינוני
סרום בקר עובריסיגמא אולדריץ'F2442H2G+ רכיב בינוני עלים

מקורות

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNAqRT PCRTrypan Blue
רביה של
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.