Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

בין המרכיבים התאיים של מערכת החיסון האנושית, מקרופאגים הם בעלי חשיבות רבה לתגובה החיסונית המולדת. משימותיהם שונות; הם מעורבים בphagocytosis של פתוגנים וחומר נימקי, הם משחקים תפקיד חשוב בהומאוסטזיס רקמה ולייצר ולהפריש כמות גדולה של ציטוקינים להסדיר ולתאם את התגובה החיסונית ^1. לכן מקרופאגים, היו מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים רבים ותנאי pathophysiological. בשל הגיוון של משימותיהם, מקרופאגים הם סוג תא מאוד הטרוגנית ורב פנים. זו מושגת על ידי קיטובים שונים; בהתאם למקרופאגים גירויים חיצוניים יכול להתפתח לפנוטיפים שונים ^2. השתנות 'מקרופאגים והשפעה על התגובה החיסונית לגרום להם נושא מחקר מעניין מאוד. על מנת להבהיר את חילוף החומרים שלהם מורכבים ופונקציות רגולציה, מקרופאג המתאים במודלים חוץ גופית הוא required שבצורה נכונה משקף את ההטרוגניות מקרופאג והשתנות.

Transfection של תאים עם וקטורי פלסמיד דנ"א או RNAs התערבות קטן (siRNAs) כדי לשנות את ביטוי הגנים סלולארי הפך לכלי בשימוש וחזק באופן נרחב בביולוגיה של תא לחקירת שתי ויסות הגנים ותפקוד גן. כיום יש מבחר גדול של כלים שונים זמינים עבור transfection של תאים האיקריוטים. כלים אלה כוללים יישום של וקטורים ויראליים, שיטות מכאניות (כגון רובי גן), גישות כימיות (אשר מסתמכות על פולימרים או שומנים שיכולים ליצור קומפלקסים עם חומצות גרעין), וelectroporation של תאים ^3. כל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות שלהם והבחירה המתאימה ביותר ממגוון רחב זה לסוג תא מסוים ויישום יכולה להיות תהליך גוזל קשה וזמן.

המקרופאגים הם קשים לtransfect transfe כמו כמעט כל מבוסס היטבגישות ction להפחית באופן דרסטי את הכדאיות 'מקרופאגים או להפריע להתנהגות שלהם, כלומר אבחנה ובקיטוב מסוים. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול יעיל, שאינו נגיפי לtransfect מקרופאגים THP-1 האנושיים באמצעות טכנולוגית Nucleofector מבוססת electroporation, המייצגת את גישת electroporation מותאמת הדורשת כמויות מופחתות של DNA. Nucleofection מתאים היטב לתאים רגישים כגון מונוציטים ומקרופאגים. פרוטוקול זה הוא עיבוד של גרסאות שפורסמו בעבר ^4,5.

בקיצור, phorbol 13 יצטט 12 myristate (PMA) משמש כדי להבדיל מונוציטים THP-1 בבני אדם ל48 שעות לתוך מקרופאגים מוקדמים לפני transfection עם siRNA או פלסמיד דנ"א. לtransfection מקרופאגים predifferentiated מנותקים אנזימים ידי Accutase אני טיפול. Transfection מתבצע באמצעות מכשיר 2b Nucleofector electroporation של התאים. לאחר transfection, שונהentiation הוא המשיך ל24 עד 48 שעות נוספות כנדרש. לבסוף, מקרופאגים transfected הבוגרים מודגרת עם סוגים שונים של תרכובות ללימודים פונקציונליים שונים.

גישה זו מאפשרת לtransfection של שורות תאים כגון מונוציטים THP-1 אנושיים ומקרופאגים ויושמה בהצלחה ^ב6-10 העבר. בניגוד לרוב גישות transfection הכימי, הליך nucleofection שונה שלנו באמצעות מקרופאגים מוקדמים מניב יעילה transfection גבוהה בשילוב עם כדאיות תא שאינו פגומות, ללא הצורך להשתמש בוקטורים ויראליים או להוסיף תרכובות מוביל נוספות עם תופעות לוואי ידועים. בנוסף, מקרופאגים לשמור את הפוטנציאל שלהם מלא לבידול, כמו גם קיטוב ובכך מאפשרים חקירות פונקציונליות ללא הפרעה הבאה transfection ^11.

יתר על כן, מדיום תרבות התא מיושם לאחר nucleofection מאוד משפיע מחקרים תפקודיים tran הבאsfection; בפרט, היכולת 'מקרופאגים לקיטוב יכולה להיות מושפעת בהתאם למדיום התרבות מיושם. הנה ארבעה סוגים שונים של תקשורת בתרבות התא (IMDM, X-VIVO 20, בינוני Nucleofector סלולארי LGM3 ועכבר T) נבדקו בתנאי כיבוי באמצעות interleukin (IL) 10. השימוש THP-1 מקרופאגים, שציינו כי היענות תא לIL10 היא החזק ביותר כאשר בינוני Nucleofector הנייד העכבר T משמש בהשוואה לתקשורת והתרבות האחרות שהוזכר לעיל. תוצאות אלו מראות כי אופטימיזציה המתאימה של כל תנאי תרבית התאים חיונית ללימודים פונקציונליים הבאים und transfection המוצלח כמו אלה עשויים לשפר באופן משמעותי את תוצאות ניסוי.

כמקרופאגים מעורבים במחלות אנושיות שונות, הרבה מחקר מתמקד בהבהרת התנהגות מקרופאג כמו גם מנגנוני ויסות משפיעים מקרופאגים או בתורו נשלטו על ידי מקרופאגים. לכן, פרוטוקול זה הוא רלוונטי בתחומי מחקר רבים ושונים.

.1 Predifferentiation של המקרופאגים THP-1

1. לטפח THP-1 תאים בינוניים RPMI-1640 תוספת 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS) ו1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין / L-glutamin (PSG) ב CO ₂ (5% חממה) בשעה 37 C °.
2. לפני transfection, לפצל תאים ולהעבירם למדיום RPMI טרי כמו קודם. לטפח תאים ל24 שעות.
3. זרע 1.0-1.5 x 10 ⁷ תאים לתוך בקבוק תרבית רקמת 75 סמ"ר או 2.5 x 10 ⁷ תאים לתוך בקבוק תרבית רקמה 150-סמ"ר במדיום RPMI-1640 ולהוסיף 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) פירובט נתרן, 1% (v / v) חומצות אמינו חיוני, 10 ng / ml PMA, וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר ל48 שעות.

2 הכנת nucleofection

1. הנח Accutase אני וכל מדיה לתוך אמבט מים על 37 מעלות צלזיוס.
2. מדיום התרבות לשאוב מבקבוק ולהחליף עם 6 מ"ל (בקבוק 75 סמ"ר) או 12 מ"ל (בקבוק 150 סמ"ר) שלAccutase אני ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ניתוק מלא של תאים. שים לב תא מורפולוגיה לאחר Accutase אני טיפול כדי להבטיח שיש לי תאים מראה עגול. אם חלק מהתאים מופיעים עדיין להיות מחוברים, לשטוף בזהירות את הבקבוק עם micropipette או לטפוח בעדינות את זה כדי להשלים את הניתוק. אין להשתמש במגרדי תאים, כמו זה שיש לו השפעה שלילית על חיוניות תא. העבר את ההשעיה תא צינור 15 מ"ל.
3. במהלך Accutase אני טיפול, להכין את המדיה הבאה:
   1. להכין מדיום transfection: מדיום תרבות תא תוסף עם 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) (V / V) בסרום אנושי של חומצות אמינו חיוניות, 1% (v / v) פירובט נתרן, ו -5% (לsiRNA) או 20% (v / v) בסרום אנושי (לפלסמיד דנ"א); להכין נפח סופי של שני 3 מ"ל / מדגם לצלחת אחת 6 היטב או 4 מ"ל / מדגם לשתי 12 גם צלחות.
   2. להכין מדיום טיפוח: מדיום תרבות תוספת עם 1% (v / v) PSG, 1% (v / v), 1% (v / v) פירובט של חומצות אמינו חיוניות נתרן, ו -5% (v / v) huסרום אדם (לsiRNA) או 20% (v / v) בסרום אנושי (לפלסמיד), 2.5 ng / ml PMA, ו50 מיקרומטר β-mercaptoethanol; להכין נפח סופי של שני 3 מ"ל / מדגם לצלחת אחת 6 היטב או 4 מ"ל / מדגם לשתי 12 גם צלחות.
4. השעיה תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר.
5. תאים לשאוב Accutase אני וגלול ב 1 מ"ל של מדיום RPMI מחומם מראש ל37 ° C; לספור תאים כדי לקבוע מספר תא.
   הערה: כאשר נהלי ספירת תאים אוטומטיים מהירים משמשים, על שלבים 2.4 ו2.5 עשויים להיות מושמטים וניתן לספור תאים מייד לאחר ניתוק ובלבד שחשיפה ממושכת לAccutase אני נמנעת.
6. עבור כל דגימת transfection להכין aliquots בצינורות צנטריפוגה מכילים 2.0-2.5 x 10 ⁶ תאים.

.3 Nucleofection של המקרופאגים THP-1

1. צנטריפוגה כל aliquots 10 דקות ב 250 XG בטמפרטורת חדר.
2. לדלל פלסמיד דנ"א או siRNA בnuclease ללא מים או מאגר מתאים. שמור את הנפח הנדרש של פלסמיד דנ"א או siRNA קטן ככל האפשר.
3. הכן אחד קובט Nucleofector גם עם 1 מיקרוגרם של siRNA או 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א לכל transfection.
4. בצע transfection אחד בכל פעם. supernatant לשאוב מaliquot התא.
5. Resuspend תאי pelleted בפתרון Nucleofector להניב היקף כולל של של DNA / siRNA ופתרון Nucleofector 100 μl. שמור את הזמן של חשיפה לפתרון Nucleofector הטהור למינימום ולהבטיח שזמן חשיפה אינו עולה על 15 דקות.
6. מערבבים תאי resuspended וDNA / siRNA בקובט Nucleofector על ידי הקשה עדינה.
7. תאי Transfect על ידי ביצוע תכנית Y-001 במכשיר 2b Nucleofector.
8. העבר את תאי transfected לתוך בקבוקון תגובה באמצעות טפטפות פסטר מפלסטיק חד פעמי.
9. מייד להוסיף 500 μl של מדיום transfection מוכן.
10. חזור על שלבים 3.4-3.9 עבור כל דגימת transfection.

ילדה = "jove_title"> 4. פוסט nucleofection טיפול

1. הכן צלחות או 6 גם או 12 גם לתאי transfected. פיפטה 2.5 מ"ל של מדיום transfection לבאר כל צלחת 6 היטב (1 היטב / transfection) או 1.75 מ"ל של מדיום transfection לבאר כל צלחת 12 גם (2 בארות / transfection).
2. מערבבים השעיות תא ביסודיות עם micropipette.
3. להעביר את תאי transfected לתוך הבארות מוכנות (או גם אחד בצלחת 6 היטב או שתיים בצלחת גם 12).
4. דגירה צלחות במשך 4 שעות בחממה humidified (5% CO _2, 37 מעלות צלזיוס).
5. בדוק שחיבור של תאים מיקרוסקופיים.
   הערה: רוב התאים צריכים להיות חסיד שוב. מדי פעם, הארכת תקופת הדגירה על ידי שעה 1 מגדילה את מספר התאים חסיד במקרה של חיבור מחדש מספיק.
6. זהירות לשאוב בינוני transfection עם micropipette ולהחליף עם כמות שווה של מדיום גידול. לשאוב היטב רק אחד בכל פעם.
<li> דגירה תאים לתקופת זמן דרושה לאפקט מקסימאלי של פלסמיד או siRNA (24-72 hr). אם תקופות דגירה יעלו 48 שעות, להחליף בינוני לאחר 48 שעות.
7. לטיפול נוסף עם effectors (למשל., ציטוקינים, אגוניסטים, יריבים ומעכבים) להשתמש בינוני בסרום חופשי ללא PMA וβ-mercaptoethanol. זמן סוף תקופת הדגירה של מפעיל עם הזמן של אפקט המקסימאלי של פלסמיד או siRNA ולתכנן את השינוי של מדיום ותוספת של מפעיל בהתאם. אל לשמור על תאים בתנאים חופשיים בסרום למשך זמן ארוך יותר מאשר 24 שעות.

השימוש בפרוטוקול זה לtransfection של THP-1 מקרופאגים עם siRNA אנחנו בדרך כלל להשיג שיעורי transfection של מעל 90% ללא הפחתה משמעותית של חיוניות תא. איור 1 מציג נתונים נציג המאפיינים את המדינה של התאים 24 שעות לאחר transfection עם fluorescently שכותרתו siRNA לעומת untransfected שליטה, שלא טופלו בחומרים כימיים nucleofection ודופק או siRNA אבל קיבל את כל השינויים של תקשורת בתרבות כדוגמאות transfected. באיור 1 א המורפולוגיה התאית מוצגת על פי מדידת cytometric זרימה. תמונות מיקרוסקופיות מוצגות באיור 1 ב 1C דמויות ו1D מייצגים את השיעורים נמוכים לאפופטוזיס (שליטה: 1.5%; nucleofection: 5.4%). ונימק (שליטה: 2.0%; nucleofection: .3.2%) המצביעים על חיוניות תא מושפעת. נמק ואפופטוזיס הם מעט גבוהים יותר למדגם transfected כמקרופאגים THP-1 transfected יותרקשה לנתק מאשר תאי untransfected, כך ההסתברות לניזק לתאים במהלך עליות ניתוק. לבסוף יעילות transfection מוצגת באיור 1E. ככל שאוכלוסיית transfected כל מוסטת נגד השליטה, זה מצביע על כך שכל התאים transfected אשר אושר על ידי תמונות הקרינה מיקרוסקופיות (איור 2). שני לזרום נתונים cytometric כמו גם תמונות מיקרוסקופיות הקרינה מצביעים על כך שכל תאי transfected באופן עקבי עם חלוקה הומוגנית של siRNA בין תאים, כמו גם בתוך תאים. זאת בניגוד לרבים ריאגנטים transfection כימיים, ל2A מספרי השוואה ו2B להציג את הנתונים בהתאמה התזרים cytometric ותמונות מיקרוסקופיות הקרינה לסוכן transfection הכימי תוך שימוש בגישה מבוססת שומנים. נתונים אלה מראים כי שתי אוכלוסיות נפרדות של תאי transfected ניתן לאתרם. האוכלוסייה הראשונה היא דומה לתאי transfected folloהאגף nucleofection. הם מאופיינים בקרינה כוללת נמוכה והפצה הומוגני של siRNA בתוך התאים. האוכלוסייה השנייה מתאפיינת בקרינה אינטנסיבית יותר שמקורו מagglomerates תאיים בהיר מאוד של siRNA. המורפולוגיה התאית נשארה ללא פגע לשני גישות transfection כפי שמוצג על ידי התערבות ההפרש לעומת זאת באיור 2 ג. Transfections באמצעות תשואת פלסמיד דנ"א ביעילות תוצאות דומות, לדוגמאות עיין Robenek et al. (2009) 9 או שיה et al. (2006) 7.

הבחירה של מדיום תרבית תאים לאחר transfection היא רלוונטית רב; לכן תקשורת תרבית תאים שונה נבדקו בהשוואה. המדיה שנבחרה כולם מתאימות לגידול של THP-1 תאים ונבחרו על פי המלצות של Lonza כאמצעי תקשורת רלוונטי עבור פוסט nucleofection טיפוח. איור 3 מייצגים את mediat siRNAעורך מציאה יעילות באמצעות siRNA המכוון נגד IL10RB (שרשרת β 10 קולט interleukin) mRNA. לכל אמצעי התקשורת שנבדקה הביטוי של IL10RB הופחת באופן משמעותי לכ -10 20% מרמת השליטה (איור 3). עם זאת תאי transfected להשתנות בהתאם למדיום התרבות בפוטנציאל שלהם לקיטוב. THP-1 מקרופאגים transfected עם siRNA או siRNA שליטה הנוקב או IL10RB הספציפי עובדו באמצעי תקשורת שונה לאחר transfection וטופלו בIL10. בהמשך לכך רמות הביטוי של גן SOCS3 המושרה IL10 (המדכא של ציטוקינים איתות 3) ברמת mRNA נמדדו על ידי RT-qPCR. הבדלים בין תקשורת והתרבות להתרחש בכל הנוגע להיקף הגיוס של ביטוי SOCS3 mRNA (איור 4), זירוזים לכל אחד מאמצעי התקשורת שנבדקה תא העכבר T Nucleofector בינוני, LGM3, X-VIVO 20 וIMDM היו 19.5 [17.7-21.5 ], 11.5 [8.5-15.7], 8.0 [4.6-14.2] ו7.2 [5.6-9.5] לקפל, בהתאמה.יישום refore של מדיום Nucleofector הנייד העכבר T הוא חיוני. בנוסף, הבדלים בהשפעה של מציאה של IL10RB על ביטוי SOCS3 לאחר טיפול IL10 היו נצפים, רמות ביטוי של SOCS3 mRNA הופחתו ל9.5 [8.8-10.3] בינוני Nucleofector לקפל בסלולרי העכבר T, 2.1 [1.1-4.1] לקפל בLGM3, 4.8 [3.2-7.2] לקפל בX-VIVO 20 ו3.3 [2.7-3.9] IMDM לקפל ב. ערכים אלה מתאימות להפחתה של ביטוי SOCS3 באמצעי התקשורת שונה ל49%, 18%, 60%, ו45%, בהתאמה. הפחתה של IL-induced 10 ביטוי SOCS3 לאחר transfection של IL10RB siRNA מאשרת את downregulation המוצלח של IL10RB ידי transfection.

אפיון איור 1 של THP-1 מקרופאגים transfected. המצב האופייני לתאים אינו מושפע כפי שנחשף על ידי מיקרוסקופי אור וזרימת cytometric ניתוחים של שיתוף untransfectedתאי ntrol לעומת THP-1 מקרופאגים transfected על פי הפרוטוקול שהוצג. THP-1 מקרופאגים הובדלו עם 10 ng / ml PMA ל48 שעות וtransfected עם (488 אלקסה) שליטה שכותרתו fluorescently נוקבת siRNA. 24 שעות לאחר transfection או תמונות של תאי חיים נלקחו (B), או התאים היו מנותקות על ידי Accutase אני טיפול ונותחו על ידי cytometry זרימה (). צביעת אפופטוזיס ונימק בוצעה באמצעות Annexin V-Phycoerythrin (PE) (ג) ו -7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). יעילות transfection (E) נקבעה על ידי cytometry זרימה באמצעות תווית הקרינה המצורפת לsiRNA. אות הקרינה של תאי transfected (השחורה) מוצגת כנגד אות השליטה (האפור). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תאי איור 2 השוואה של החלוקה תאית של siRNA לאחר nucleofection לעומת lipofection. THP-1 הובדלו ל48 שעות על פי פרוטוקול זה ולאחר מכן transfected או על ידי או על ידי nucleofection lipofection. תוצאות lipofection הציגו התקבלו באמצעות ערכת Xtremegene siRNA על פי המלצות היצרן עם יחס תשלום של מגיב לsiRNA של 4: 1. 24 שעות לאחר תאי transfection היו או מנותקים עם Accutase אני לניתוח התזרים cytometric או הערכה מיקרוסקופית בתאים חיים. (א) יעילות Transfection והפצה של siRNA לכל תא באוכלוסייה נקבעו על ידי cytometry זרימה באמצעות תווית הקרינה המצורפת לsiRNA, בקרות transfected ללא siRNA מוצגות באפור, דגימות transfected עם siRNA מוצגות בשחור. מיקרוסקופיה (B) פלואורסצנטיתמונות מראים הפצה תאית של fluorescently שכותרתו siRNA (אלקסה פלואוריד 488); סרגל קנה המידה מייצג 40 מיקרומטר. תמונת התערבות הפרש לעומת זאת מתאימה לתמונת הקרינה (C); סרגל קנה המידה מייצג 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

.3 איור siRNA בתיווך מציאה של IL10RB במקרופאגים THP-1 transfected. THP-1 מקרופאגים היו transfected על פי הפרוטוקול שתואר. לאחר transfection התאים עובדו בארבע מדיה שונה תרבות, כלומר תא העכבר T בינוני Nucleofector (), IMDM (B), LGM3 (C), וX-VIVO 20 (ד '), בתוספת כפי שתוארו בסעיף הפרוטוקול. Cאמות היו transfected גם עם שליטה נוקבת siRNA (Ctrl) או IL10RB הספציפי siRNA (IL10RB). כבקרות נוספות דוגמאות הבאות נכללו: שליטת Pulse, כלומר. תאים שעברו transfection בהעדר siRNA (Pulse), ושליטה בינונית, כלומר. תאים שקיבלו רק את השינויים של תקשורת בתרבות אבל נשארו אחרת לא טופלו. 24 שעות לאחר transfection התאים הודגרו במדיום סרום ללא עם או בלי 50 ng / ml IL10 עבור שעות 24 נוספות. ביטוי IL10RB נמדד על ידי RT-qPCR; תרשימים מראים הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע; * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001 לעומת Ctrl. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4 תקנת IL10 תלויה של SOCS3 לאחר מציאה של IL10RB במקרופאגים THP-1 transfected. THP-1 מקרופאגים היו transfected על פי הפרוטוקול המתואר. לאחר transfection התאים עובדו בארבעה בינוני תרבות תקשורת סלולארי העכבר T שונה Nucleofector (), IMDM (B), LGM3 (C) וX-VIVO 20 (ד) בתוספת כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. תאים היו transfected גם עם שליטה נוקבת siRNA (Ctrl) או IL10RB הספציפי siRNA (IL10RB). כבקרות נוספות דוגמאות הבאות נכללו: שליטה דופק, תאים כלומר שעברו transfection בהעדר siNRA (Pulse), ושליטה בינונית, כלומר. תאים שקיבלו רק את השינויים של תקשורת בתרבות אבל נשארו אחרת לא טופלו. 24 שעות לאחר transfection התאים הודגרו במדיום סרום ללא עם או בלי 50 ng / ml IL10 עבור שעות 24 נוספות. expre SOCS3ssion נמדד על ידי RT-qPCR; תרשימים מראים הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע; *, # P <0.05; **, ## עמ '<0.01; ***, ### עמ '<0.001 לעומת Ctrl ולעומת Ctrl + IL-10, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עלויות פרסום למאמר וידאו זה אינן ממומנים על ידי Lonza גרופ בע"מ