Method Article

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, אדס המפוספס

DOI:

10.3791/51961

⸱

November 30th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוחי RNA-Seq הופכים חשובים יותר ויותר לזיהוי היסודות המולקולריים של תכונות הסתגלות באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, מתואר פרוטוקול לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין יתושי Aedes albopictus שאינם דיאפאוזה, מגידול יתושים, ועד לריצוף RNA וניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני RNA-Seq.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאפאוזה פוטופריודית היא הסתגלות חשובה המאפשרת לאנשים לברוח מסביבות עונתיות קשות באמצעות סדרה של שינויים פיזיולוגיים, בעיקר עצירת התפתחות וחילוף חומרים מופחת. פרופיל ביטוי גנים גלובלי באמצעות RNA-Seq יכול לספק תובנות חשובות לגבי מנגנוני השעתוק של דיאפאוזה פוטופריודית. יתוש הטיגריס האסייתי, Aedes albopictus, הוא אורגניזם יוצא מן הכלל לחקר בסיסי השעתוק של דיאפאוזה בשל קלות הגידול שלו, הדיאפאוזה המושרה בקלות והמשאבים הגנומיים הזמינים. כתב יד זה מציג זרימת עבודה ניסויית כללית לזיהוי הבדלים שעתוק הנגרמים על ידי דיאפאוזה ב-A. albopictus. מתועדים טכניקות גידול, תנאים הדרושים לגרימת התפתחות דיאפאוזה ולא דיאפאוזה, שיטות להערכת אחוז דיאפאוזה באוכלוסייה, ומיצוי RNA והערכת תקינות ליתושים. זרימת עבודה לעיבוד נתוני RNA-Seq מרצפי Illumina מגיעה לשיאה ברשימה של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. התוצאות המייצגות מדגימות כי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות ביעילות גנים המווסתים באופן דיפרנציאלי ברמת השעתוק ב-A. albopictus עקב הבדלים פוטופריודיים. עם התאמות צנועות, ניתן להתאים את זרימת העבודה הזו בקלות לחקר בסיסי השעתוק של דיאפאוזה או תכונות חשובות אחרות של תולדות החיים ביתושים אחרים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות מהירה בטכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS) מספקת הזדמנויות מרגשות לחקור את היסודות המולקולריים של מגוון רחב של התאמות אקולוגיות מורכבות גנטית במגוון רחב של אורגניזמים שאינם מודלים 1-3. גישה זו היא חזקה ביותר מכיוון שהיא מבססת בסיס למחקרי אוכלוסייה וגנומיקה פונקציונלית של אורגניזמים עם אקולוגיה או היסטוריה אבולוציונית מעניינת ו/או מתוארת היטב, כמו גם אורגניזמים בעלי דאגה מעשית, כגון מזיקים חקלאיים וגורמי מחלות. לפיכך, טכנולוגיות NGS מובילות להתקדמות מהירה בתחומי האקולוגיה ויש להן פוטנציאל לטפל בבעיות כגון הבנת הבסיסים המכאניסטיים של תגובות ביולוגיות לשינויי אקלים עכשוויים מהירים4, התפשטות מינים פולשים5 ואינטראקציות מארח-פתוגן6,7.

הפוטנציאל יוצא הדופן של טכנולוגיות NGS לטיפול בשאלות בסיסיות ויישומיות באקולוגיה וביולוגיה אבולוציונית נובע בחלקו מהעובדה שניתן ליישם גישות אלה על כל אורגניזם בעלות מתונה האפשרית עבור רוב מעבדות המחקר. יתר על כן, גישות אלו מספקות מידע כלל-גנומי ללא דרישה למשאבים גנטיים אפריוריים כגון שבב מיקרו-מערך או רצף גנום שלם. עם זאת, כדי למקסם את הפרודוקטיביות של ניסויי NGS יש צורך בהתייחסות מדוקדקת לתכנון הניסוי, כולל נושאים כמו תזמון ההתפתחות וספציפיות הרקמה של דגימת RNA. יתר על כן, הכישורים הטכניים הנדרשים לניתוח כמויות הנתונים העצומות המופקות על ידי ניסויים אלה, לעתים קרובות עד כמה מאות מיליוני קריאות רצף DNA, היוו אתגר מיוחד והגבילו את היישום הנרחב של גישות NGS.

מחקרי RNA-Seq אחרונים על בסיסי השעתוק של דיאפאוזה ביתוש הפולשני והחשוב מבחינה רפואית Aedes albopictus מספקים דוגמה שימושית לכמה מהפרוטוקולים הניסויים שניתן להשתמש בהם כדי ליישם בהצלחה את טכנולוגיית NGS לחקר הבסיס המולקולרי של הסתגלות אקולוגית מורכבת באורגניזם שאינו מודל 8-10. A. albopictus הוא מין פולש מאוד שמקורו באסיה אך פלש לאחרונה לצפון אמריקה, דרום אמריקה, אירופה ואפריקה11,12. כמו חרקים ממוזגים רבים, אוכלוסיות ממוזגות של A. albopictus שורדות את החורף על ידי כניסה לסוג של תרדמה המכונה דיאפאוזה פוטופריודית. ב-A. albopictus, חשיפה של נקבות גולמים ובוגרות לאורכי יום קצרים (סתוויים) מובילה לייצור ביצי דיאפאוזה שבהן הושלמה ההתפתחות העוברית, אך זחל הפארטה בתוך כוריון הביצה נכנס למעצר-התפתחותי שהופך את הביצה לעקשנית לגירוי בקיעה15-17. ביצי דיאפאוזה עמידות יותר בפני ייבוש5,18 ומכילות יותר שומנים בסך הכל19 מאשר ביצים שאינן דיאפאוזה. דיאפאוזה פוטופריודית ב-A. albopictus היא אפוא פלסטיות פנוטיפית אדפטיבית הנשלטת על ידי האם החיונית לשרוד את התנאים הקשים של החורף בסביבות ממוזגות. למרות המשמעות האקולוגית המובנת היטב של דיאפאוזה פוטופריודית במגוון רחב של חרקים20,21, הבסיס המולקולרי של הסתגלות מכרעת זו אינו מאופיין היטב באף חרק22. באורגניזמים כמו A. albopictus שעוברים דיאפאוזה עוברית בשלב הזחל של הפראטה, נותר אתגר משכנע במיוחד להבין כיצד האות הפוטופריודי שמתקבל על ידי האם מועבר לצאצאים ונמשך לאורך מהלך ההתפתחות העוברית כדי לגרום למעצר בשלב הזחל של הפראטה.

פרוטוקול זה מתאר גידול יתושים, תכנון ניסיוני וניתוחים ביואינפורמטיים עבור ניסויי NGS (ריצוף טרנסקריפטום) שבוצעו כדי להבהיר רכיבי שעתוק של דיאפאוזה פוטופריודית ב-A. albopictus. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים נוספים של דיאפאוזה ב-A. albopictus, ניתן להתאים אותו לחקירת דיאפאוזה במינים קרובים אחרים כגון יתושי אדין אחרים שעוברים דיאפאוזה ביצה23, והוא גם רלוונטי באופן כללי יותר לשימוש בגישות NGS כדי לחקור את בסיסי השעתוק של כל הסתגלות מורכבת בכל חרק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הזחל גידול של שני א קבוצות albopictus לבגרות

  1. הגדר שני ארונות photoperiod עם תאורה הניתנת לתכנות ב 21 מעלות צלזיוס במשך ביטוי דיאפאוזה אופטימלי 16 וכ 80% לחות יחסית.
    1. קבינט תכנית אחת ל16L: אור ד 8: מחזור כהה (שאינה דיאפאוזה גרימת photoperiod LD). הגדר את הארון השני ל8L: אור 16 ד: מחזור כהה (דיאפאוזה התרמה) 13.
    2. "האורות ב'התכנית באותו הזמן בשני הארונות ללסנכרן את זמן היממה בין photoperiods.
  2. לחשב את כמות הביצים הדרושים לביצוע הניסוי. לשאוף 300-500 ביצים בכלוב. לפחות שלוש לשכפל כלובי דיאפאוזה ושלוש לשכפל כלובים הלא דיאפאוזה נדרשים לייצור RNA. זה מסתכם לCA. 1,800-3,000 ביצים לכל ניסוי.
    1. האץ הביצים על ידי השריית ניירות ביצה לתוך בערך 500 מיליליטר של H 2 O. deionized
    2. להוסיף ca. 1 מיליליטר תרחיף מזון מורכב ממזון כלבי קרקע וארטמיה כפי שתואר קודם לכן 24. כיסוי מיכל עם רשת, ולשמור על הרשת במקום עם גומייה.
    3. מניחים בארון photoperiod LD לבערך 24 שעות.
  3. זחלים בקעו העברה עד 10 x 10 x 2 סנטימטר פטרי H מנות מלאות מיליליטר 90 בערך deionized 2 O.
    1. לשמור בערך 30 זחלים לכל צלחת. העבר את הזחלים לנקות מנות כל שעות 48-72, למשל בכל יום שני, רביעי ושישי (MWF) 24.
    2. slurry מזון 1 מיליליטר בערך Feed בהיקף של מזון לכלבי קרקע וארטמיה במים ללא יונים כל MWF כמו בעבר תאר 24.
  4. הגדרה 03:57 כלובים מבוגרים לכל טיפול photoperiod, שבו כל כלוב כולל לשכפל ביולוגי.
    1. משני צדי מתרס של 9.5 דליי L, לגזור חור סנטימטר 10-by-14 אחד, ועוד חור בקוטר 15 סנטימטר. CoVer הראשון עם רשת. חותך כ אחד אורך רגל של גרב אורתופדים, ודבק קצה אחד סביב החלק הפנימי של החור האחר.
    2. חותך את קצה הרגל של הגרב ומסגר קשר - פתוח רק כאשר יש צורך בגישה לחלק הפנימי של הכלוב. למכסה הכלוב, לחתוך את כל הפנים, ומשאירים רק את השפה, ולהחליף את הפלסטיק הפנימי עם רשת 24.
    3. הערה photoperiod, לשכפל מספר, תאריך התחלת כלוב, וכל מידע אחר רלוונטי לניסוי עם סמן קבוע בצד של הכלוב.
  5. שורה התחתונה של הכלובים המבוגרים עם נייר סינון רטוב. לצנן את נייר הסינון עם מספיק H 2 O deionized להגדיל לחות מקומית בכלוב, אך להימנע מים עמד, שיכול לעורר ההטלה על נייר הסינון 24. בדוק את נייר הסינון יומי לייבוש, מחדש רטוב בעת צורך.
  6. כדי לייצר ביצים מספיק לספריית RNA, כוללים לפחות 100 נשים / ca 9.5 Lge, עם לא יותר מ -500 יתושים בכל כלוב.
  7. לאסוף MWF גלמים ומקום בכוס קטנה של H 2 O הנקי בצפיפות של לא יותר מ -50 גלמים לכל 25 מיליליטר H 2 O. העבר את כוס הגלמים לכלוב מבוגר. כלובי מקום בארון photoperiod בהתאמה - א גלמי albopictus הם רגישים 15.
  8. ודא יומי שH 2 O בכוסות נקי וברור, ולהסיר גלמים מתים, כי הצטברות של גלמים מתים יכולה לגרום לתמותה המונית. הסר H 2 O כוסות אחרי כל הגלמים לצוץ.
  9. מניחים צימוקים אורגניים ברשת העליונה של הכלוב כדי לספק סוכר למבוגרים יצאו. צג צימוקים, ולשנות אותם כל 3-5 ימים כדי למנוע הצטברות עובש.

2. תחזוקה של מבוגרים כדי לאפשר ייצור של הזדווגות וביצה

  1. לשמור על כלובים בלחות גבוהה (כ. 80%) על ידי המצפה את תחתית הכלוב עם נייר סינון לח, ומספק גישה לצימוקים שאינם מעופשים, כפי שתואר לעיל (sectiתוספות 1.5 ו -1.9).

3. דם-האכלה

  1. הכן לנקבות דם הזנה בין שניים לשישה ימים לאחר eclosion כדי להבטיח שנשים שנחשפו ללפחות שמונה ימים קצרים חד-משמעיים לפני ההטלה מתחילה לכמעט 100 ביצי דיאפאוזה% 14.
  2. הכן את מערכת האכלת Hemotek ממברנה. חבר את יחידות האכלה לאספקת החשמל. כוון את הטמפרטורה של כל יחידה עד 37 מעלות צלזיוס באמצעות בורג ההתאמה. השתמש במדחום ובדיקה אלקטרוניים כדי למדוד את הטמפרטורה של יחידת ההאכלה במהלך כיול.
  3. הכן את מאגר הארוחה. למתוח רבוע של קרום האכלת קולגן על הצמצם של מאגר הארוחה ולאבטח אותו עם O-טבעת. משכו בזהירות את הפינות להסרת קמטים; חתוך את הקרום העודף במספריים.
    הערה: קרום קולגן עשוי שלא לפעול היטב לכל מיני היתושים, וייתכן שיהיה צורך לנסות כמה כדי למצוא את הקרום האופטימלי אם עובד עםמינים אחרים מאשר A. albopictus. Parafilm עובד היטב עם כולכית מצויים.
    1. אם דם מאוחסן קפוא, להפשיר בטמפרטורת חדר למשך שעה לפחות 1 לפני השימוש.
    2. החזק את המאגר, וכך הקרום פונה כלפי מטה, והיציאות שאינן נתמכות, המילוי הם פונים כלפי מעלה. השתמש פיפטה העברה או מזרק כדי למלא את המאגר עם כ 3 מיליליטר של דם מלא מתרנגולות שיש נתרן ציטרט כנוגדת קרישה. לאטום יציאות מילוי עם תקעי פלסטיק.
  4. צרף את המאגר מוכן המזין על ידי הברגתו על ההרבעה על צלחת העברת חום בתחתית המזין. הפוך את המזין ולמקם אותו בחלק העליון של הכלוב, צד קרום למטה, כך שיתושים יכולים להאכיל דרך רשת הכלוב. שמור המזין בכלוב לכ 45 דקות על מנת למקסם את ההאכלה.

4. עידוד הטלה

  1. ארבעה עד חמישה ימי הודעה ארוחת דם, לצייד כל כלוב עם הצבע כהה 50 מיליליטר געד מרופד בנייר מולבן נביטת זרעים (נייר ביצה) או מגבת נייר מולבן ללא מרקם ולמלא באמצע הדרך עם מים ללא יונים 9. אם יותר מ -250 יתושים נמצאים בכלוב, להשתמש בשתי כוסות.
    הערה: לכלובים קטנים או בקבוקונים חד-נשיים, "עירוי חציר" במכולות ההטלה עלול להגביר ההטלה בשל הריח של צמחיית חיידקי 25.

5. לאסוף ולאחסן ביצים

  1. להתחיל אוסף ביצה בתוך 4-5 ימים של האכלת דם בגלל ייצור ביצים בדרך כלל מגיע לשיא כחמישה ימים לאחר האכלת דם, ולאחר מכן שוככת במהלך השבוע הבא.
  2. להשתנות בתדירות אוסף ביצה על צרכי הניסוי. למטרות כלליות, לאסוף ניירות ביצה על לוח זמנים MWF. הסר ניירות ביצה מכל כלוב ולהחליף עם נייר טרי. תניח נייר הוסר לאחרונה בצלחות פטרי וחנות בקבינט photoperiod SD כדי למנוע תופעות של בלבול אחסון ביצה.
  3. לאפשר ניירות ביצה מחדש עיקרי רטוב במשך 2 ימים לאחר ההטלה-כדי לאפשר היווצרות ציפורן serosal, אשר מגדילה את התנגדות התייבשות ביצת 26.
  4. הודעה אוסף כ 48 שעות, ביצים יבשות באוויר פתוח. ייבש את הנייר כך שהוא רפוי ומעט לח למגע, אבל לא כל כך רטוב שהנייר הוא כהה מH 2 O או ממגר בקיעה של ביצים.
    הערה: "x 4" נייר 6.5 עלול לקחת כ 3.5 שעות לייבוש. היה זהיר לא לניירות ביצה מעל יבש, כמו זה יגרום להתייבשות ביצת 27.
  5. ביצים נוספות ריזרב מphotoperiods שני LD וSD להעריך שכיחות דיאפאוזה ולפרש את השפעת photoperiodic (ראה מדידת דיאפאוזה, סעיף 6).
  6. לאחסון לטווח ארוך, לשמור מסמכי ביצה בגיל 21 ° C ולחות כ -80% בצלחות פטרי. שמור צלחות פטרי במכל אחסון טאפרוור עם בקבוק של מים כדי לשמור על לחות מקומית כהתפתחות עוברית לוקחת ארבעה עד חמישה ימים ב 21 מעלות צלזיוס.
ove_title "> 6. מדוד דיאפאוזה תחולה

  1. השתמש בעוברים שמורות נוספים (ראו לעורר הטלה, סעיף 4), כי הם 7-20 ימים ההם לכמת את תגובת דיאפאוזה.
  2. רשום את מספר הביצים הנוכחיות על כל נייר ביצה.
  3. לעורר ביצים לבקוע על ידי השריית לחלוטין ניירות ביצה בודדים בצלחת פטרי עם 90 מיליליטר כ -80 מיליליטר H 2 O. deionized להוסיף כ 0.25 מיליליטר תרחיף מזון.
  4. לאחר 24 שעות עולים בקנה מספר זחלי instar הראשונים בקע. מניחים את צלחת פטרי על משטח שחור לדמיין זחלים ולמקם את מקור אור בצד אחד של צלחת. זחלים יהיו להתרחק ממקור האור, המאפשרים למניין ברור של זחלים בודדים. הסר זחלים בודדים עם טפטפת תוך ספירה כדי למנוע מספרים זחלים בודדים.
  5. ניירות ביצת מקום בצלחת פטרי חדשה ומחודשת יבשים. ביצים בוקעים מחדש לאחר שבוע 1 ~ ושוב עולות בקנה ביצים בקעו באמצעות השיטה הנ"ל.
  6. ניירות ביצת מקום עם u שנותר n בקע ביצים בצלחות פטרי חדשות 90 מיליליטר עם פתרון הלבנה כ 80 מיליליטר 28. ודא שניירות הביצה שקועים לחלוטין בפתרון ההלבנה ולהשאיר תחת לילה מנדף, כדי למנוע את הריח של אקונומיקה.
    הערה: הלבנת פתרון יכולה להיות מאוחסנת במשך שבוע ~ 1 על 4 מעלות צלזיוס, אבל צריך להיות אחר עשתה טרי.
  7. בדוק ביצים באמצעות מיקרוסקופ אור כהלבנה ינקה את סיסית ולאפשר להדמיה של ביצי embryonated,-בקע un. אם הביצית embryonated, הביצה תהיה צבע off-לבן עם עיניים המופיעות כשתי נקודות שחורות קטנות זה מול זה בצד הגב. עולה בקנה אחד מספר, ביצי embryonated un בקע 13.
  8. לקבוע שכיחות דיאפאוזה עם הנוסחה הבאה: דיאפאוזה% = לא. ביצים בקעו בלתי embryonated / (לא. ביצים בקעו + לא. ביצים בקעו-un embryonated) x 100 13.

7. הפקת RNA מהביצים / pharate זחלים

ontent "> הערה: השימוש Trizol בזרימה למינרית.

  1. ביצי יתושים מברשת מכילות עובר פיתוח או זחלי pharate בנקודות שונות בזמן פיתוח מעיתוני ביצה למטחנות זכוכית בעזרת מברשת משיער גמל. טוחנים את הביצים בTrizol (1 מיליליטר ל50-100 מ"ג של רקמה) עד מרסק לחלוטין. השתמש בלפחות 400 ביצים בספרייה להניב RNA מספיק.
    1. לחלופין, הצמד ביצי הקפאה בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 ° C בצינורות microcentrifuge עד חודש לפני הטחינה בTrizol.
  2. לבצע הפקת RNA בTrizol ואחריו המשקעים isopropanol על פי הוראות יצרן.
  3. פנק את הספסל עם פתרון טיהור RNase או סוכנים אחרים כדי להסיר כל nucleases שייר כדי למנוע השפלה RNA.
    1. פנק את RNA חילוץ עם DNase. על פי הוראות יצרן, דגירה דגימות RNA עם DNase במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש & # 1181; DNase l עד 10 מיקרוגרם של RNA בתגובת 50 μl. להגדיל את כמות DNase אם יש יותר מ -10 מיקרוגרם של RNA בתגובה אחת.
    2. להשבית DNase על ידי הוספה מגיב איון DNase המושעה 5 μl. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר, ערבוב שלוש פעמים במהלך תקופת דגירה (vortexing העדין).
    3. צנטריפוגה XG ב 10,000 עבור 1.5 דקות. מעביר את supernatant המכיל דגימות RNA שטופלו לצינורות טריים לשלבים הבאים.
  4. להעריך את איכות הכוללת דגימות RNA על ידי fluorometry. שלח את הדגימות למתקן מיוחד עם מכשיר נכון למשימה זו. המתקן יבצע ג'ל אלקטרופורזה על השבב כדי לקבוע את הגדלים של מיני RNA במדגם, דמיינו ידי צבע פלואורסצנטי החדיר בשבב. התוצאות תוחזר כelectropherogram.
    1. לקבוע את היושרה של דגימות RNA הכוללת על ידי הנוכחות או עדר של מוצרים פגומים, כפי שמעיד o הנוכחותפסגות f בין פסגות RNA ריבוזומלי 18S ו5S על electropherogram וכתוצאה מכך (איור 1).

רצף 8. RNA

  1. שלח כוללת דגימות RNA עם איכות גבוהה מספיק (איור 1 א) וכמות (> 3 מיקרוגרם בדרך כלל לספרייה) למרכז מסחרי לבניית רצף של מועשר ספריות לזווג-סוף mRNA ורצף ה- mRNA, הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים.
  2. אם נתיב אחד או יותר משמש לקביעת רצף ניסוי בודד, לפצל ספריות בודדות לשני נתיבים לרצף כדי להסביר וריאציה טכנית בין נתיבים ברצף.

ניקוי קרא 9. lllumina

הערה: איור 2 מסכם את חלק ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה. לקבלת רשימה מלאה של כל התוכניות ומשאבים המשמשים בחלק ביואינפורמטיקה של פרוטוקול זה, עיין בטבלת 1. בבנוסף, קובץ נוסף 1 מכיל דוגמאות שורת הפקודה עבור כל אחד משלבי פרוטוקול ביואינפורמטיקה הבאים.

  1. השתמש ssaha2 29 (טבלת 1) לזהות התאמות של זהות 95% ומעלה למסד נתוני צמח השדה UniVec Core, א '(טבלה 1) רצף albopictus rRNA (# L22060.1 GenBank), ומתאמי רצף (דוגמאות שורת הפקודה מפורטת שנקבעו בקובץ נוסף 1). הסר זוגות קריאה עם גפרורים באמצעות Perl או כלי scripting דומה, למשל על ידי התאמת התסריט סיפק פרל (קובץ נוסף 2).
  2. נקי שנותר קורא עם חבילת SolexaQA 30 (טבלת 1; קובץ נוסף 1): לקצץ אזורים עם מקבילה ציון Phred של פחות מ -20 תוך שימוש בהגדרות ברירת המחדל של DynamicTrim.pl.
    1. הסר קורא נ"ב קצר יותר מ -25 עם LengthSort.pl בשני קדימה ולאחור קוראים בו זמנית. להעריך את האיכות של הקבצים ניקו fastq עם FastQC (טבלת 1 ) - בפרט, לוודא שאיכות רצף לכל בסיס וציוני איכות לכל רצף הם מעל 20.

10. דיגיטלי נורמליזציה

  1. לבצע סיבוב של נורמליזציה דיגיטלית אחד בניקה קורא באמצעות כלי החמר 31 (טבלת 1; קובץ נוסף 1), במיוחד normalize-by-median.py (באמצעות גודל k-mer 20, כיסוי חתך של 20, וx = 1e10).
  2. לחלופין, אם מכונה עם גבוה RAM זמין (מאות GB), להשתמש בסקריפט של טריניטי normalize_by_kmer_coverage.pl (טבלת 1).

11. De עצרת transcriptome Novo

  1. לקבל גישה לאשכול מחשב או מחשב עם עד 256 GB של RAM ו -24 מעבדים, תלוי בגודל של ההרכבה.
  2. השתמש בטריניטי 32 (טבלה 1; קובץ נוסף 1) להרכיב את הקריאה דיגיטלית המנורמלת להגדיר לcontigs. כדי להפחיתשימוש בזיכרון, השתמש --min_kmer_cov 2.

12. עצרת הערכה

  1. הפעל assemblathon_stats.pl מפרויקט Assemblathon2 33 על תפוקת contig טריניטי. סקריפט זה מבצע חישובים בסיסיים רלוונטיים לאיכות הרכבה הערכה, כגון מספר הפיגומים, N50, הרכב הרכבה, ועוד (טבלה 1; קובץ נוסף 1).

13. ביאור של transcriptome מורכבת

  1. בצע Blastx (טבלת 1) של ההרכבה נגד קבוצת חלבון התייחסות; ליתושים, melanogaster דרוזופילה, אנופלס gambiae, כולכית מצוי, וAedes aegypti הפניות מתאימות. באופן ספציפי, לאתחל את קובץ חלבון התייחסות fasta לפיצוץ, ואחריו blastx (קובץ נוסף 1).

14. מפה קוראת לעצרת שימוש RSEM 34 (טבלה 1)

  1. צור קובץ 'תמליל לגן-המפה', שבוהעמודה ראשונה מכילה את תעודות זהות של גן ההתייחסות, והעמודה השנייה את תעודות הזהות של contig. בעורך גיליון אלקטרוני, להחליף את העמודים הראשונים והשני מתפוקת Blastx, ולכתוב טורים אלה לקובץ txt. השתמש בתכנית LINEBREAK להמיר מעברי שורה בקובץ txt וכתוצאה מכך לפורמט יוניקס.
  2. צור מערך התייחסות מקובץ FASTA transcriptome באמצעות סקריפט rsem-להכין-ההתייחסות, המסופק באריזת RSEM (קובץ נוסף 1).
  3. חשב את ערכי הביטוי בנפרד עבור כל ספרייה באמצעות פקודת rsem לחשב הביטוי, המסופקת באריזת RSEM (קובץ נוסף 1). כקורא, להשתמש בקבצים לזווג fastq כתוצאה מצעד ניקוי לקריאה (שלב 9.2).
    1. אם RNA מלשכפל ביולוגי פוצל לשני נתיבים לרצף, כולל שני קבצי fastq בחישוב הביטוי כדי ליצור קובץ יחיד.
  4. להמיר את תוצאות הביטוי מכל ספרייה למטריצת מעובד בקלות על ידי p האחרrograms באמצעות rsem-ליצור-data-מטריצת התסריט סיפקה, המסופקת באריזת RSEM (קובץ נוסף 1).

15. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי

  1. התקן R וEdger (טבלה 1).
  2. השתמש read.delim כדי לטעון את תוצאות RSEM מצעד 14.3 (קובץ נוסף 1). במידת צורך, לעגל. הספירה למספר שלם הקרוב ביותר
    הערה: מדריך Edger ממליץ להגביל את בסיס הנתונים לגנים עם מספיק ביטוי גבוה כדי לזהות משמעות.
  3. כדי לעצב את הנתונים לEdger, ליצור אובייקט DGEList מהקובץ שנטען נתונים (קובץ נוסף 1). לאחר מכן, לנרמל את הנתונים באמצעות הנורמליזציה TMM (קובץ נוסף 1). להעריך את התפוצות הנפוצות וtagwise של הנתונים (קובץ נוסף 1).
  4. זיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי עם Benjamini-הוכברג תיקן p-value <0.05 (קובץ נוסף 1). עלילה ההפצה של יומן-פי-שינוי לעומת שפע (קובץ נוסף 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorometry של שתי דגימות RNA נציג הראה שתי להקות בכ -2,000 NT (איור 1 א ', ב'). RNA ריבוזומלי -28 חרק מורכב משתי רשתות polynucleotide מוחזקות ביחד על ידי קשרי מימן, שהם שיבשו בקלות על ידי חימום או סוכנים המשבשים קשרי מימן 35 קצרים. שני מרכיבים המתקבלים הם בערך באותו גודל כמו RNA ריבוזומלי 18S. מדגם RNA השני הראה רמות גבוהות של השפלה (איור 1).

טיפול Photoperiodic של קב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטות לגלות גנים הביעו באופן דיפרנציאלי בשל photoperiodically דיאפאוזה המושרית בא albopictus. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא משלב באופן ייחודי לגידול יתושים וטכניקות ביואינפורמטיקה לעשות את כל ההיבטים הניסיוניים של תכנית פיזיולוגיה מולקולרית נגישה למשתמשים מתחילים - ובעיקר עבור אלה המתמקדים בתגובת דיאפאוזה photoperiodic. שיטות קיימות, למיטב ידיעתנו, לא מספקות כמה שיותר פרטים בפרוטוקול הגידול - שלעתים קרובות יש צורך לזהות טעויות גידול - ולא לעשות שהם מספקי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות 5R21AI081041-02 ואוניברסיטת ג'ורג'טאון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אינקובטור - דגם 818Thermo-Scientific3751120 V
חדר סביבה מבוקרתThermax ScientificN/Aחדר סביבה מבוקרת שנבנה לפי מפרטים מותאמים אישית על ידי Thermax Scientific Products. אלטרנטיבה גדולה יותר לחממה. http://thermmax.com/
נורת פלורסנט מגניבהפיליפס3921834 W
צלחת פטרי 100 מ"מ x 20 מ"מפישר08-772-E
נייר סינון 20.5 ס"מפישר09-803-6J
9.5 ליטר דליפלסטיקןBway מוצרים
http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117 כלי עזר בד-כילה נגד יתושים לבןג'ואן10173292
http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html גרביים אורטופדיותAlbahealth23650-040מוצר מס' 081420
צימוקיםאורגניים UPC של ניומן: 884284040255
כוסות ביוץ (חום)פישר סיינטיפיק03-007-52המוצר הוא למעשה בקבוק ענבר של 125 מ"ל שראינו את החלק העליון שלו.
מגבות נייר ממוחזרותדור שביעי30BPT120
חברים מודולריים סט טאפרוור מרובע טאפרוורhttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
מטחנת זכוכיתקורנינג משולבת7727-2מטחנות הרקמות הללו של טנברוק שוברות את הביצים ומשחררות RNA לתוך המגיב TRI.
TRI ReagentSigma AldrichT9424יש למרוח 1 מ"ל מגיב TRI לכל 50-100 מ"ג רקמה. זהירות — מגיב זה רעיל.
TURBO DNAנטול Ambion/Life TechnologiesAM1907ערכה זו מייצרת תפוקה גדולה יותר מטיפול DNase מסורתי ואחריו ניקוי פנול/כלורופורם, והיא פשוטה יותר לשימוש.
RNaseZapAmbion/Life TechnologiesAM9782יש למרוח בנדיבות על משטחי הספסל וכל ציוד שעלול להיות במגע עם דגימות ה-RNA. התמיסה מעט בסיסית/קורוזיבית, עלולה לגרום לגירוי ומזיקה בבליעה.
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AAהנח עד 12 דגימות RNA על שבב אחד.
מזין ממברנותהמוטק Hemotek 5W1מערכת זו מספקת 5 תחנות הזנה הניתנות לשימוש בו זמנית. כולל יחידת כוח PS5 וכבל חשמל; 5 מזיני FUI + מאגרי ארוחות וטבעות O; פקקי פלסטיק, קרום הזנת קולגן חמוטק; כלי להגדרת טמפרטורה; וכלי חילוץ תקעים. כתובת הדואר של החברה היא: המוטק בע"מ; יחידה 5 יוניון קורט; דרך אלן רמסבוטום; הארווד הגדול; לנקשייר, בריטניה; BB6 7FD; טלפון: +44 1254 889 307.
מדחום דיגיטלי ובדיקהHemotek מדחום MT3KFUMicroT3 ובדיקת KFU. זה משמש לקביעת הטמפרטורה של כל יחידת הזנה FUI.
עוף דם מלא, לא סטרילי עם נתרן ציטראטPel-Freez Biologicals33130-1500 מ"ל הדם הוקפאו ואוחסנו ב-20 מ"ל ב-80 & #176; C עד שנה. יש להפשיר דם בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת לפני השימוש.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photoperiodic DiapauseRNA Seq AnalysisAedes AlbopictusDiapause InductionGene Expression ProfilingTranscriptome AssemblyDifferential Expression AnalysisRNA ExtractionIllumina SequencingBioinformatics Workflow

Related Articles