מאמר שיטה

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

DOI:

10.3791/51963

⸱

5 באוקטובר 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים היא תופעה ביולוגית כי הוא מעורב בשפע של פיסיולוגי, כגון ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, ותהליכי pathophysiological, כמו סרטן. Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן הוא כלי תכליתי כדי לנתח את מאפייני נדידת תאים מסוגים שונים של מסגרת בסביבה דמוית פיזיולוגית 3D.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים מסוגים שונים וממלא תפקיד מכריע במספר תהליכים פיסיולוגיים, הכוללים התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, ואת תגובה חיסונית. עם זאת, נדידת תאים היא גם מנגנון מפתח בסרטן מאפשר לתאי הסרטן אלה להתנתק מהגידול הראשוני להתחיל גרורתי מתפשט. בתוך השנים האחרונות מבחני נדידת תאים שונים פותחו כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של. בגלל התנהגות locomotory של תאים שונים במידה ניכרת בין שני ממדים (2D) וזה הסביבה תלת ממדי (3D) ניתן להניח כי הניתוח של ההגירה של תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D יניב בנדידת תאים משמעותית יותר נתונים. היתרון של assay ההגירה תאר 3D מטריקס קולגן הוא שתאים מוטבעים בתוך רשת 3D פיזיולוגית של סיבי קולגן המייצגים את המרכיב העיקרי של מטריקס. בשלנדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדדת מאפשרת הקביעה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים / לויקוציטים, תאי גזע, ותאים סרטניים. כמו כן, גם צבירי תאים או spheroids יכולים להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לסריג קולגן. אנו מסיקים כי assay הגירת מטריצת קולגן 3D הוא שיטה תכליתית כדי לנתח את ההגירה של תאים בתוך סביבת 3D פיזיולוגית דמוית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו איחוי תאים (לסקירה לראות 1,2) נדידת תאים היא תופעה ביולוגית אחרת, כי הוא מעורב בשפע של תהליכים פיסיולוגיים כוללים התפתחות עוברית, לריפוי פצעים ותגובה חיסונית (לסקירה ראה 3). עם זאת, היכולת להעביר גם תנאי מוקדם לתאים סרטניים לשלוח גרורות (לסקירה ראה 3,4).

נדידת תאים היא מורכבת, עדיין לא הבין באופן מלא תהליך שמנוהל על ידי יחסי הגומלין של מספר מסלולי העברת אותות ביוזמת יגנד השונים (למשל, ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, הורמונים, רכיבי מטריצה ​​תאיים) קולטן (למשל, טירוזין קינאז רצפטור, קולטנים chemokine, integrins) אינטראקציות 5 סופו של דבר גורמים לארגון מחדש של שלד התא במקביל אקטין עם דה והרכבה מחדש של מתחמי הידבקות מוקד וintegrin בתיווך איתות 6.

= "Jove_content" של> כדי לנתח תא הגירה כמה במבחנה ובמבחני נדידת תאי vivo פותחו בעשורים האחרונים, ובכלל זה assay התא / transwell בוידן 7, assay / פצע שריטה ריפוי assay 8-10, תלת ממדים ( 3D) assay מטריצת הקולגן הגירת 11 כמו גם הדמיה / מיקרוסקופיה intravital (לסקירה ראה 12). לכל אחד ממבחני נדידת תאים אלה יתרונות וחסרונות, לדוגמא, עלויות הנוגעות וצורך של ציוד, טיפול או לאמינות של הנתונים שהתקבלו.

שתי קאמרי / assay transwell בוידן וassay השריטה / assay ריפוי הפצע הם, בעלות נמוכה קלה ומבחנים מפותחים למדוד נדידת תאים במבחנה 7-10. בתא בוידן / transwell תאי assay הם זורעים על גבי נקבוביות להכניס מכילים (כ 8 מיקרומטר קוטר) - העליון התא שנקרא 7. אופציונאלי, להוסיף יכול להיות מצופה עם מ תאירכיבי Atrix, למשל, פיברונקטין, קולגן, וכו ', כדי לחקות את הסביבה פיזיולוגית יותר. כמו כן, תאי האנדותל ניתן יהיו לגדל על גבי העלון, ובכך מחקה את מחסום תא האנדותל 13. תאים אלה שעברו את הנקבוביות במרווח זמן שהוגדר לתא התחתון מחסה תקשורת ותוספים, כגון גורמי גדילה וכמוקינים, משמשים כקריאה החוצה לכמת נדידת תאים (או extravasation).

בassay השריטה / פצע תאי assay ריפוי הם זורעים בצלחות וגדלים לconfluency 10. בתלות של צלחות הגדרה הניסיוניות ניתן מראש מצופה עם רכיבי מטריצה ​​תאיים, כגון פיברונקטין. לאחר יצירת שריטה / פצע על ידי גירוד התאים בודדים monolayer תא מכל צד של השריטה / פצע יכול לנדוד לתוך הפער, ובכך ממלא / ריפוי זה 10. המרחק בין שני הצדדים של השריטה / פצעים נקבעבתלות של זמן ומשמש כקריאה החוצה לפעילות הנדידה של התאים 10. עם זאת, להבחין בין התפשטות תאים (שגם עלולה לגרום למילוי / ריפוי של השריטה / פצע) ונדידת תאים מומלץ לשלב את assay עם מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו ותא בודד מעקב 10.

עם זאת, שניהם קאמרי בוידן / assay transwell וassay / פצע שריטה ריפוי assay, הוא די מושלמים הנוגע לסביבה סלולרית פיזיולוגית דמוית. בתא בוידן / תאי assay transwell צריכים להעביר דרך נקבובית פלסטיק, ואילו בשריטת assay / ריפוי פצע תאי assay הם זורעים על צלחת פלסטיק מצופה מראש דו ממדים. כמו כן, הוא מוכר היטב שהתנהגות הנדידה שונה במידה ניכרת בין סביבה דו ממדית ו3D 3. למשל, הידבקויות תלת ממדי מטריצה ​​של fibroblasts שונים מהידבקויות מוקד ופיברילציה מאופיינות בשנימצעי -dimensional בתוכנם של α5β1 וintegrins αvβ3, paxillin, רכיבי cytoskeletal אחרים, וזרחון טירוזין קינאז של הידבקות מוקד 14. כמו כן, תאים המוטבעים בתוך סביבת 3D מוצגים גם התנהגות נדידה שינה 15. כך לנתח נדידת תאים בצורה מדויקת יותר assay הגירה מומלץ מאפשר למדוד את ההגירה של תאים בודדים בתוך סביבה פיזיולוגית או דמוית פיזיולוגית 3D.

ההדמיה / מיקרוסקופיה Intravital היא הזהב סטנדרטי למדידת נדידת תאים בהקשר פיסיולוגי 3D. זה רק שאינו שייך לאינטראקציות מטריצת תאים תאיים, אלא גם ליחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים, כגון תאים סרטניים ותאי האנדותל במהלך extravasation 16 או סחר הלימפוציטים בתוך הבלוטה לימפה 17, אשר, למועד, הוא אפשרי בשל טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי משופרות, כגון 2-פוטוןמיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר, השימוש בצבעים חיוניים ניאון וזני עכבר מהונדסים מבטא נגזרי חלבוני ניאון 12,16,17. בנוסף, הדמיה / מיקרוסקופיה intravital יכולה להיות משולבת עם תא ידני ואוטומטי מעקב 18. עם זאת, בשל הצורך של מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal 2 פוטונים, כמו גם בעלי החיים (ומודלים של בעלי חיים מהונדסים מתאימים) הדמיה / מיקרוסקופיה intravital היא טכניקה ולא עלות אינטנסיבית.

כדי להתגבר על המגבלות של החדר / assay transwell בוידן וassay ריפוי assay / פצע שריטה ולנתח את ההגירה של סוגי תאים שונים בתוך סביבת 3D assay הגירת מטריצת קולגן 3D פותח 11,19. ובכך, תאים נודדים מוטבעים בתוך רשת קולגן סיבי 3D, אשר מזכיר יותר לin vivo מצב. בצמדים, בשל נדידת תאים אמיתיים מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו נמדד מאפשר determiאומה של מספר פרמטרים הגירה, כמו גם שינוייהם בתגובה לגורמים או מעכבים בעד נודדים. סוגי תאים שונים יכולים להיות מנותחים באמצעות טכניקה זו, ובכלל זה לימפוציטים ולויקוציטים 11,20, גזע hematopoietic / תאי אב 21-24, ותאי גידול 5,25-29. בנוסף לתאים בודדים גם תא אשכולות או spheroids יכול להיות מוטבע בתוך נלווה מטריצת הקולגן עם ניתוח של ההגירה של תאים בודדים מאשכול התא / אליפטית לקולגן סריג 30,31.

פרוטוקול זה מציג סקירה על טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה כדי לנתח את התנהגות נדידת תאים מסוגים שונים של בסביבת 3D - שיטה במבחנה מניב בתוצאות שאינן קרובים למצב in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הכנת לשכות הגירה

  1. הכן ג'לי פרפין / נפט (1: 1) לערבב וחום עד לקבלת התערובת נמס. שימוש במכחולים ולצייר 2-3 שכבות של ריבת פרפין / הנפט (1: 1) מערבב באמצע שקופית הזכוכית בהתאם לדמויות 1B-1D.
    הערה: אנו משתמשים בשקופיות זכוכית נפוצות (76 x 26 x 1.0-1.5 מ"מ (W / D / H))
  2. החל תערובת ג'לי פרפין / נפט נמסה במהירות בשקופית הזכוכית, כדי למנוע התמצקות תוך כדי ציור. להבטיח את שכבת ג'לי פרפין / נפט היא על 2-2.5 סנטימטר באורך ו0.3-0.5 סנטימטר ברוחב. עובי שכבת ג'לי פרפין / הנפט צריך להיות על .1-0.15 סנטימטר.
  3. הוסף coverslip לפרפין הקרושה / תערובת וזלין ולאטום אותו עם שניים עד שלוש שכבות (1E דמויות, 1F) פרפין תערובת ג'לי שעווה / נפט. השתמש 4-8 תאי הגירה לניסוי נדידת תאים נפוצים. תאי הגירת מקום in תנוחה זקופה במעמד.

2 הכנת Mix תא ההשעיה קולגן

  1. קציר (לדוגמא, עם 0.25% טריפסין / EDTA) ולספור תאים של עניין. Resuspend תאי תקשורת מלאה המכילה עוברי עגל בסרום (FCS), אנטיביוטיקה ומומלצת תוספים. הכן 4-8 1.5 מ"ל צינורות תגובה ו20 השעיה תא μl המכילה 4-6 x 10 4 תאים (המספר הכולל של תאים תלוי בסוג התא להיות מנותח) ולמלא עד 50 μl עם תקשורת מלאה.
    הערה: תרכובות נוספות (לדוגמא, גורמי גדילה, כמוקינים, מעכבים, וכו ') מתווספות להשעית התא. השתמש בפתרוני המלאי מתאימים כך שהנפח הסופי של השעיה תא אינו עולה על 50 μl.
  2. הכן סכום כולל של 452 השעיה קולגן הסופית μl לארבעה ניסויי נדידת תאים. הוסף 50 μl 10x MEM (pH 5.1-5.5) ו27 μl של .7.5% פתרון סודיום ביקרבונט (pH 9.0-9.5) לצינור תגובה 1.5 מ"ל ומערבבים היטב. שים לב לתורו בצבע פתרון מצהוב כתומה לסגול העז (pH 9.0-9.5). הוסף השעיה קולגן 375 μl נוזל ל10x ממ / פתרון סודיום ביקרבונט ומערבבים היטב. PH של ההשעיה קולגן הסופית צריך להיות על 7.5 (מסומן בצבע סגול בהיר).
    הערה: בדוק את pH של תמיסת סודיום ביקרבונט 7.5%. אם pH הוא כ 7.5 מקום פתרון סודיום ביקרבונט עם מכסה פתוח בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) להיות רווי עם CO 2 ולהגדיל את רמת החומציות (כ 9.0-9.5). PH של תערובת תא ההשעיה קולגן הוא חיוני ליציבות של רשת קולגן. אם זה נמוך מדי סריג קולגן יקרוס במהלך ניסוי נדידת תאים.
    הערה: לקבלת פרוטוקול זה, להשתמש בקולגן הנוזלי (pH 1.9-2.2) מאחורי שור (2.9-3.3 מ"ג / מ"ל ​​קולגן, 95% קולגן סוג I, 5% IV סוג קולגן). דוגמאות לפרוטוקולי הכנת סריג קולגן נוסף באמצעותסוג אני קולגן ממקורות אחרים, כגון חזירי או עכברוש, ניתנים ב32,33. אין לשנות את הכרכים של הפתרונות המשמשים כזה ישנה את ריכוז קולגן האולטימטיבי של 1.67 מ"ג / מ"ל ​​של הסריג. יש ריכוז קולגן גבוה יותר או נמוך יותר השפעה על הצפיפות של סיבי קולגן והמרחק ביניהם הממוצע במקביל לתאי התנהגות 34 נודד.
  3. הוספה של ההשעיה קולגן הסופית להשעיה תא 50 μl 100 μl ולערבב thoroughly.The השעיה סופית קולגן (1.67 מ"ג / מ"ל ​​קולגן) היא מעט צמיגה. כדי להעביר את הסכום הנכון (100 μl), פיפטה פתרון קולגן הסופי פעם אחת למעלה ולמטה לפני העברתה להשעית התא.
    הערה: ברגע שתערובת תא ההשעיה קולגן בשילוב עם פתרון 10x ממ / סודיום ביקרבונט וערך pH השתנה ל7.5 סיבי קולגן מייד להתחיל לפלמר.
  4. העבר את תערובת תא הסופית ההשעיה קולגן מהצינורות תגובת דואר לתאי ההגירה. לטפוח בעדינות את תא ההגירה לחלק באופן שווה את תערובת תא ההשעיה קולגן בחלק התחתון של חדר ההגירה (איור 1H). מניחים את תאי ההגירה בתנוחה זקופה במעמד ודגירה על 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר פילמור של סיבי קולגן.
  5. שים לב שסריג קולגן polymerized הוא מעט עכור, אבל עדיין להיות בצבע סגול בהיר. למלא את תאי הגירה עם מדיום מלא או בינוני מלא עם תוספים של עניין ולאטום את חדר ההגירה עם תערובת ג'לי פרפין / נפט (איורים 1 ט, י 1).

.3 הקלטה וניתוח של נדידת תאים

סעיף זה מתאר את ההקלטה של ​​נדידת תאים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות וידאו וניתוח של נדידת תאים על ידי מעקב סלולארי מדריך ל.

  1. לעבור על המיקרוסקופ וחימום הבמה מיקרוסקופter. כוון את הטמפרטורה ל37 C °. השתמש אובייקטיבי 10X. הנח תא הגירה תחת מיקרוסקופ ולהתמקד 50 כ תאים או יותר בשדה הראייה.
  2. הגירה רשומה תא במצב הזמן לשגות באמצעות תוכנת מעקב וידאו מרובה מצלמה. לשמור סרטי נדידת תאים בפורמט מתאים, למשל, "* אבי" או ".mov *". קישור קבצי סרט נדידת תאים למאגר מידע המכיל מידע תומך, כגון סוג תא ותנאי ניסוי.
    הערה: אנו מקליטים לימפוציטים וHSPCs עד שעה 2 באמצעות גורם הזמן לשגות של 1:80, מה שאומר ש0.75 שניות בזמן לשגות שווה ל1 דקות בזמן אמת. תאי גידול הם תאים שנעו לאט ולכן נרשמו לפחות 16 שעות באמצעות גורם הזמן לשגות של 1: 1,800 (0.5 שניות בזמן לשגות שווה ל15 דקות בזמן אמת).
  3. לנתח סרטי נדידת תאים באמצעות יישום מתאים מעקב תא תוכנה, כמו תוספי תוכנת ImageJ(סקירה כללית ניתן ב18). לניתוח בלתי מוטה זה הוא בעל חשיבות מכרעת כי תאים ייבחרו באופן אקראי ללא הידיעה אם תאים פעילים נודדים או לא.
    הערה: אנו משתמשים ביישום תוכנה מפיתוח עצמי כדי לעקוב באופן ידני את הנתיבים של לפחות 30 תאים לכל ניסוי על ידי ביצוע התאים נעו בצורה מדויקת עם סמן העכבר (שממוקם לגרעין). תוך מעקב, xy-הקואורדינטות של התאים עליהם המעקב באופן אוטומטי שנקבעו בהתאם למצב בזמן לשגות בשימוש. לימפוציטים מסוג xy-קואורדינטות / HSPCs נקבעות כל שניה 0.75 (שווה בזמן אמת 1 דקות), ואילו לתאי גידול xy-הקואורדינטות נקבעות כל שניה 0.5 (שווה לזמן אמת 15 דקות).
  4. לקבוע כולל של 60 xy-קואורדינטות לכל תא לניסוי נדידת תאים טיפוסי. זה שווה לשעה 1 בזמן אמת לימפוציטים / HSPCs ו15 שעה בזמן אמת לתאים סרטניים. "," מצביע על כך שתא לא זז בין two נקודות זמן, ואילו "ערך מספרי" מציין את המרחק ב" פיקסלים "תא עבר בין 2 נקודות זמן (איור 2 א).
    הערה: מעקב תא ידני דורש ניסיון. במיוחד תאים מהירים נודדים קשים לעקוב וכל תערוכת סוג תא התנהגות נדידה שונה שעשויים להיות מופעלת על ידי גורמים בתוספת. במקרה של חלוקת תא תוך מעקב, באופן אקראי לבחור תא בת אחת להמשך מעקב. תאים שנודדים אל מחוץ לשדה הראייה או למות תוך מעקב אינו מוזנח, אך נחשבים לניתוח.

ניתוח .4 נתונים

  1. ניתוח נתוני מעקב תא באמצעות יישום מתאים תוכנה, למשל, תוכנת גיליונות אלקטרוניים.
    1. ניתוח נתוני מעקב תא על ידי העתקת תא מעקב נתונים גולמיים (איור 2 א), לתבנית של גיליון אלקטרוני בעיצוב עצמי. להכפיל סכום של "הערכים המספריים", המייצג אתהמרחק הכולל של תאים שנדדו עם גורם תיקון להמיר "פיקסל" לתוך "מיקרומטר".
    2. לקבוע שני פרמטרים נדידת תאים: פעילות locomotory (שהוא שווה ערך לשיעור הגירה) ושעה של תנועה אקטיבית (2C דמויות, 2D).
    3. זהה את התאים שהגרו פחותים מאשר 25 מיקרומטר (רמת סף כדי לצמצם את מספרם של תאים חיוביים שגויים) כתאים שאינם זז. החלף את "ערכים מספריים" של תאים אלה עם ",".
      הערה: הפרמטר (או שיעור הגירה) "פעילות locomotory" מייצגת את אחוז התאים של אוכלוסיית תאי מעקב שנעו בין שתי נקודות זמן (איור 2 ד). "ערך מספרי" מוגדר כתא מרגש, ואילו "," מוגדר כתא שאינו זז. הפרמטר "הזמן של תנועה פעילה" (זמן פעיל) מייצג את אחוז הזמן הכולל תא הגר מחדשויסות למסגרת של תקופת התצפית (איור 2 ג) הזמן. "ערך מספרי" מצביע על כך שתא עבר, ואילו "," מצביע על כך שתא לא זז. פרמטר זה נמצא בשימוש נוסף כדי לקבוע את מספר התאים שלא עברו.
  2. לחשב מובהקות סטטיסטיות ונתונים נדידת תאי תצוגה.
    1. לחשב מובהקות סטטיסטיות של פעילות locomotory הממוצעת של התאים (שיעור ההגירה) באמצעות מבחן Mann-Whitney U. שקול p-value <0.05 משמעותיים כ.
    2. להציג את פעילות locomotory הממוצעת של תאים כxy-תרשים, תרשים BoxPlot, או כתרשים תרשים בר. להציג נתונים יחידים המבוסס על תאים, כגון זמן של תנועה או מהירות פעילה, כתרשים תרשים בר או כמו היסטוגרמה.
      הערה: אם יישום תוכנת גיליון אלקטרוני שנבחר אינו מכיל כלי תרשים או תרשים היסטוגרמה BoxPlot חיפוש מקוון יש לבצע למחפש tu המתאיםtorials.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay הגירת מטריצת 3D-קולגן המשמש בשילוב עם הזמן לשגות וידאו מיקרוסקופיה ומעקב תא בעזרת מחשב מאפשר לקביעת פרמטרים שונים נדידת תאים כוללים גם פרמטר המבוסס על האוכלוסייה (למשל, אומר שפעילות locomotory) ופרמטרים המבוסס על תא בודדים (לדוגמא, זמן של פעיל תנועה, מהירות, מרחק היגר). דוגמא לסטים שהושגו מעקב תא נתונים, עיבוד נתונים והצגת הנתונים מובאות באיור 2. תא מעקב קובץ נתונים דומה שולחן (איור 2 א). כל עמודה מייצגת תא מעקב אחד, לפיה ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להעביר היא סימן היכר של תאים סרטניים 4. ללא היכולת להתנתק מהגידול הראשוני ולנדוד דרך תאי גידול רקמות חיבור שמסביב לא תוכל זרע נגעים משניים, המהווים את הגורם העיקרי למותם של כמעט כל חולי הסרטן. בגלל הקשר הזה מחקרים רבים מתמקדים בנדידת תאי הסרטן. המטרה של מחקרים אלה היא זיהוי של מולקולות רומן יעד ומסלולי יעד ביעילות לחסום נדידת תאים סרטניים, ובכך לפגוע או להאט את ההיווצרות גרורה. דוגמא למאמץ כזה יכול להיות β-חוסמי, אשר הוכחו לעכב גרורתי התפשטות תאי סרטן השד במב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן פריץ-בנדר, מינכן, גרמניה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Leica DM IL מיקרוסקופ הפוךLeica, Wetzlar, גרמניה
מחמם שלב מיקרוסקופDistelkamp Electronic, קייזרסלאוטרן, גרמניה
JVC C1431 מצלמת וידאוJVC, באד וילבל, גרמניה
שרת וידאו ציר 241Qתקשורת ציר GmbH, Ismaning, גרמניה
מחשב Mac G5 אפלמקינטוש
iMacApple Macintosh
FileMaker ProFileMaker GmbH, Unterschleiß heim, גרמניה
תוכנת מעקב וידאו מרובת מצלמות (מרגל אבטחה)Bensoftware, לונדון, בריטניה
Runtime Revolution Media 2.9.0RunRev Ltd., אדינבורו, בריטניה
ParaffinApplichem GmbH, דרמשטדט, גרמניהA4264
ג'לי נפטבית מרקחת
Purecol (קולגן נוזלי)Nutacon BV, Leimuiden, הולנדמכיל 2.9 - 3.3 מ"ג/מ"ל קולגן בקר (95% קולגן מסוג I, 5% קולגן מסוג IV)
10x MEMSigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניהM0275
תמיסת נתרן ביקרבונט 7.5%Sigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניהS8761
EGFSigma Aldrich, Taufkirchen, גרמניהE9644
U73122Merck Millipore, דרמשטדט, גרמניה662035להתמוסס תחילה ב-CHCl3; להרכיב מחדש ב-DMSO ממש לפני השימוש
מקומי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711(2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time LapseEGF

מאמרים קשורים