ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

Summary

אנו מציגים שיטה ליישום שדה חשמלי פיזיולוגי על תאי ערמונית נודדים ואימורטליים בתא גלוונוטקסיס מותאם אישית. באמצעות שיטה זו, אנו מדגימים כי 2 קווים של תאי ערמונית לא גידוליים מדגימים דרגות שונות של כיווניות נדידה בשדה.

Abstract

השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כגון בימוי נדידת תאים בפיתוח עובר, תולדה עצבית וריפוי פצע אפיתל. הפעלת שדה חשמלי של זרם ישיר לתאים בתרבית במבחנה גורמת הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שונה עם פולי מחוייט (ויניל כלוריד) (PVC) תאים, משטח זכוכית, אלקטרודות פלטינה והשימוש בבמה ממונעת שבו התאים הם צילמו. תאי PVC ואלקטרודות פלטינה להציג cytotoxicity נמוך והם סבירים ומחדש שמישים. משטח הזכוכית והבמה מיקרוסקופ הממונעת לשפר את האיכות של תמונות ומאפשרים שינויים אפשריים למשטח הזכוכית וטיפולים לתאים. אנחנו צילמנו את galvanotaxis של שני קווים שאינם סרטניים-הונצח SV40 ערמונית תא, pRNS-1-1 וPNT2. שתי שורות תאים אלה מראות מהירויות הגירה דומות ושניהם נודדים לעברהקתודה, אבל הם עושים להראות במידה שונה של יווניות בgalvanotaxis. התוצאות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך שpRNS-1-1 ושורות תאי PNT2 עשוי להיות מאפיינים מהותיים שונים המסדירים תגובות הנדידה כיוונית שלהם.

Introduction

שדות חשמליים אנדוגני מתגלים ברקמות שונות, כגון עור ^{1, 32, 33} ומוח ^2. השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כוללים פיתוח בימוי עובר ^{3, 4,} המנחה את תולדה של תהליכים עצביים ^{5, 6} וקידום סגירת אפיתל קרני ופצע ^{1, 7.} במבחנה, יישום של שדה חשמלי נוכחי ישיר לתאים בתרבית מחקה את השדה החשמלי הפיזיולוגי וגורם הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. Galvanotaxis נחקר בfibroblasts ^8, קרטינוציטים דגים ^9, אפיתל אדם וקרטינוציטים קרנית ^10-12, לימפוציטים מסוג ^13, neuroblasts ^2, ובתאים עצביים ^14. כאשר נחשפו לשדה המופעל, רוב התאים למדו להעביר directionally כלפי cathodal (-) הקוטב. ובכל זאת, כמה תאי סרטן, כוללים מאוד גרורתיתאי סרטן השד אנושיים ושורת תאי סרטן הערמונית האנושית PC-3M, לעבור לanodal (+) קוטב ^{15, 16.} מספר מנגנונים מוצעים לתווך galvanotaxis או להסביר את היכולת של התאים לחוש את השדה החשמלי, כולל הפעלה של EGF קולטני ^12, ערוץ נתרן אפיתל ^17, PI3K וPTEN ^18, ושחרורו של סידן יונים ^{15, 19.} המנגנון הוא עדיין לא הבין באופן מלא וזה אפשרי, כי מסלולי איתות מרובים מעורבים בgalvanotaxis.

שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שימושית כדי לאפיין את ההגירה כיוונית של חסיד, תאי ניעתי, או כדי לפקח על הגירת תאים בודדת ^{10, 12, 17} או הגירה של גיליון של תאים ומחוברות ^{18, 20.} טכניקה זו שונה מ פנג והיפה ^21, וNishimura et al. ¹⁰ עם, תאי PVC ברורים מחוייט, עם coversl הנשלףשב"ס מאפשר לאחזור תא קל לאחר galvanotaxis לניתוח משני, כגון הדמיה חיסונית הקרינה. משטח הזכוכית של תאי galvanotaxis הוא אופטי תואם, המאפשר לצלם בהגדלה גבוהה ועם תאי fluorescently שכותרתו. זה גם מאפשר עיצוב ניסיוני עם שינוי של משטח הזכוכית, כגון שינוי ציפוי פני השטח או חיובים. מפרידי עשויים מס '1 coverglass משמשים בתאי כדי למזער את הזרימה הנוכחית על התאים; לכן חימום ג'אול, שהוא פרופורציונאלי לריבוע של הזרימה הנוכחית, לא לחמם יותר מדי את התאים במהלך הניסוי. הגשרים אגר החיבור למנוע מגע ישיר של אלקטרודות עם התאים ולמנוע שינוי של pH הבינוני או ריכוז יון בgalvanotaxis.

שתי שורות תאי ערמונית אנושית שאינם סרטניות נבדקו לתגובת galvanotaxis במחקר זה. PRNS-1-1 ²² וPNT2 ²³ שניהם SV40-הונצחו, שורות תאי גורם תלוי צמיחה המבטאות את סמני אפיתל cytokeratin 5, 8, 18 ו -19 עם ביטוי נמוך או לא של אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA). שני שורות התאים לשמור על מורפולוגיה המצולעים של תאי האפיתל נורמלים, אבל הנורמליות של כרומוזום נצפתה בkaryotyping ^{22, 24.} למרות שpRNS-1-1 וPNT2 לשתף התנהגויות דומות ברוב הניסויים, הם עושים להראות הבדלים במבנה של מבנה acinar וב galvanotaxis. על מטריצת 3-D, Matrigel, pRNS-1-1 תאים ליצור מבני acinar חלולים עם לומן הדומה לרקמת בלוטת הערמונית הרגילה ^25. עם זאת, תאי PNT2 יוצרים spheroids המוצק ללא לומן או אפיתל המקוטב ^26. תאי pRNS-1-1 גם להפגין תגובת galvanotactic גבוהה מPNT2 במחקר הנוכחי. המתאם בין ההיווצרות של מבנה acinar וgalvanotaxis בpRNS-1-1 מצביע על כך שאותות galvanotactic עשויים לשחק תפקיד בארגון יחסי הציבורתנועות ostate בלוטת רקמה בתגובה לשדות חשמליים אנדוגני, ומספקת מאפיינים נוספים להפלות בין 2 שורות תאים אלה.

Protocol

1. תאי culturing ערמונית

1. תרבות pRNS-1-1 וערמונית PNT2 תאים על 100 מנות תרבות מ"מ במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקת antimycotic על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2. רענן מדיום התרבות בכל יום עד שהתאים מגיעים 80% confluency לניסויי galvanotaxis.

2. צ'יימברס Galvanotaxis הרכבה

1. הרכבת תאים תחתון
   1. נגב קאמרי galvanotaxis פלסטיק עם 2-propanol. החל אוטם סיליקון הכיתה הימי סביב הפתחים עגולים בצד התחתון של קאמרי עם מזרק ולצרף coverglass גדול (איור 1). השתמש בצד האחורי של המוליך כותנה לדחוף את coverglass ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן. הפתחים עגולים יאפשר בינוני והזרם חשמלי לזרום על התאים הממוקמים בין שני המאגרים בינוניים הפנימיים.
   2. חותך coverglass קטן כדי להפוך את 6 מ"מ x 25 מפרידי מ"מ עם סמן נקודת יהלומים.
   3. הפוך את התא. החל 2 פסים של דבק סיליקון עם מזרק ו / או מרית מתכת, כדי ליצור משטח ערוץ x 25 מ"מ 10 מ"מ לקובץ מצורף תא בין 2 הפתחים עגולים על הזכוכית התחתונה. דבק 2 חתיכות של spacer זכוכית בין 2 הפתחים עגולים. השתמש בצד האחורי של החלת מהכותנה לדחוף את מפרידי ולנגב את הדבק העודף עם צמר גפן ו / או קיסמים.
   4. ייבש את התא למשך 24 שעות עד שדבק סיליקון הוא נרפא. משרים את התא בלילה מים מזוקק כדי להסיר את שאריות חומצה אצטית מהדבק. ייבש את התא לשימוש מיידי, או לאחסן את התא לשימוש מאוחר יותר במכל נקי.
      
      איור 1: עצרת של תא galvanotaxis התחתון. ) Coverglass גדול מחובר לחלק התחתון של חדר נקי. B) Tוו חתיכות של מפרידי זכוכית מודבקות בין 2 הפתחים עגולים כדי ליצור x 25 מ"מ ערוץ 10 מ"מ לתאים לצרף.
2. זריעת תאים בתאי galvanotaxis
   1. הכן את מספרם של התאים דורשים galvanotaxis הדרושים לניסוי. שורת תאים כל טיפול או דורשת קאמרית galvanotaxis יחיד. נגב את תאי galvanotaxis עם 2-propanol. לשטוף את התאים עם PBS 3 פעמים סטריליים ולבדוק את זרימת הנוזל בין 2 הפתחים עגולים בתאי.
   2. הקף את התאים בצלחות תרבית תאים סטריליים ולאפשר להם לאזן על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לנתק את תאי ערמונית ממנת התרבות שלהם באמצעות 5 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין-EDTA עם FBS 5 מיליליטר של 10% בPBS.
   3. להעביר את תאי 15 מיליליטר צינורות וצנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 200 XG, 37 ° C. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים ב 1 מיליליטר של מדיום התרבות.
   4. קח 20 μl של פתרון תא לטעון לחדר ספירה ולחשב את מספר התא. התאם את ריכוז התא עד 8 ​​x 10 ⁴ תאים / מיליליטר עם מדיום התרבות.
   5. קח את תאי galvanotaxis מתוך 37 ° C החממה. זרעי 350 μl של ההשעיה התא אל תא אחד.
   6. דגירה התאים בתאי הלילה בצלחת התרבות עם Kimwipe הרטוב או בתא לחות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.

איור 2:. מתזמן את התאים לתא התא התחתון הוא מיובש וניקה תאי ערמונית) הם trypsinized, נספרו ומועברים לתא וטופחו לילה B) coverglass עליון מחובר ללאטום את החדר לפני צילומים...

3. ssembling תאים העליונים
   1. להרכיב את התא העליון לפני צילומים. מיקרוסקופ יכול להכיל רק הדמיה קאמרית galvanotaxis אחת בכל פעם. להתחמם 10 מיליליטר של מדיום התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כל תא galvanotaxis. העבר את תא galvanotaxis מהחממות לצלחת התחממות 37 ° C.
   2. יש לשטוף את התאים עם מדיום התרבות להסיר את התאים הפנויים. השאר 400 μl של מדיום בתא. השתמש במזרק ללמרוח משחה ואקום גבוהה על גבי שני מפרידי הזכוכית.
   3. הוסף coverglass קטן לאטום את החדר. לחץ בעדינות במורד coverglass עם הצד האחורי של המוליך כותנה. נגב את המדיום העודף עם צמר גפן.
   4. ייבש את משטח הזכוכית ולמרוח משחה ואקום גבוהה כדי לאטום את הפער בין coverglass והקאמרי. השתמש במרית מתכת כדי להפיץ את השומן. הוסף 4 מיליליטר של מדיום התרבות למאגרים הפנימיים ולבדוק את זרימת הנוזל בין המאגרים.
4. הפוך אגרגשרים
   1. חותך זוג צינורות PVC הארוך 2 אינץ '(503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 כותל), להפוך ולהכניס אותם לתוך כוס מיליליטר 100.
   2. למדוד 200 מ"ג Bacto-אגר ולהוסיף אותו בבקבוק 50 מיליליטר עם מדיום תרבות 10 מיליליטר כדי להפוך 2% ג'ל אגר. מיקרוגל למשך 30 שניות. טען את הג'ל אגר לצינורות פלסטיק עם pipet העברה. השאר את אגר גשרים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות כדי לחזק את אגר.
   3. הוסף בינוני תרבות 2 מיליליטר למאגרים החיצוניים של תא galvanotaxis. הכנס את אגר גשרים למאגרים בינוניים הפנימיים וחיצוניים לנהל הנוכחי.

איור 3:. צילומי התאים בתא תרשים כדי להדגים את ההרכבה הסופית של חדר galvanotaxis. התא אטום לחלוטין עם גריז ואקום גבוה. בינוני מתווסף to למלא את המאגרים, ושני גשרים אגר מוכנסים לתוך התא. אז קאמרי galvanotaxis מועבר לבמה מיקרוסקופ ואלקטרודות מחוברות ליישם השדה החשמלי. צדתי להציג של חדר galvanotaxis התאסף מוצג על מנת להוכיח כי הזרם החשמלי זורם על התאים באמצעות הגשרים אגר והרווח בין הזכוכית המכסה.

הדמיה 3. זמן לשגות

1. הפעל את התא הסביבתי על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ בשעת האוויר במחזור 2 לפני ההדמיה.
2. לעבור על המיקרוסקופ וליזום את תוכנת רכישת התמונה. כייל את הבמה מיקרוסקופ ובחר את מטרת 10X.
3. העבר את תאי galvanotaxis לבמה מיקרוסקופ, לאבטח את החדר עם קלטת ולהתמקד בתאים. הכנס את האלקטרודות galvanotaxis למאגרים החיצוניים עם קתודה בצד ימין. לאבטח את החוט ואלקטרודות עם קלטת.
4. הפעל את bo הכחx ליישם שדה חשמלי לתא. מדוד את מתח הפלט עם מד המתח על פני התא להגיע 2.5 וולט לתא 25 מ"מ הארוך (100 mV / מ"מ). לשמור על עוצמת השדה במהלך הניסוי על ידי התאמת התפוקה הנוכחית.
5. בחר 10 נקודות על פני התא לצלם בתוכנה כדי ליצור עשרה זמן לשגות סרטים. להגדיר את תנאי רכישה במרווחים של 10 דקות לשעה 2.
6. התחל צילומים ולהתאים את התפוקה הנוכחית במידת הצורך.
7. בסופו של הניסוי, להסיר את התא מהבמה ולתקן את התאים עם אלכוהול 95%. לפרוץ את החדר עם סכין גילוח לנקות מחדש להשתמש בו.

4. כימות Galvanotaxis

1. סובב את הזמן לשגות הסרטים ורי-אוריינט הקתודה לחלק העליון של התמונות. לייצא את הסרטים לתוכנת המעקב הסלולרי.
2. באופן ידני לעקוב (x, y) העמדה של 10-20 תאים בכל נקודת זמן מכל סרט (4 איור, B).מרחקי ההגירה והזוויות ביחס לכיוון צפון-דרום, באותו הכיוון של השדה החשמלי, יחושבו בתוכנת מעקב תא (איור 4C).
   הערה: מהירות ההגירה הממוצעת מומרת ממרחק ההגירה הכולל וכולל זמן צילומים. כיווניות מומרת מהזוויות לערך קוסינוס. אם תאים לנדוד עם יווניות אקראיות, הממוצע של קוסינוס נטו יהיה קרוב לאפס. אם התאים להעביר ישירות לכיוון הקתודה, ערך קוסינוס יהיה +1. אם התאים להעביר ישירות לכיוון האנודה, ערך קוסינוס יהיה -1.

איור 4: מעקב סלולארי למדוד יווניות) כיסוי של קווי מעקב עם תמונות תא.. העמדות (x, y) של התאים manuaמעקב lly בזמן לשגות הסרטים. . אם התאים לנדוד באופן אקראי, קוסינוס הממוצע הוא קרוב לאפס B) עם זאת, אם התאים נודדים לעבר הקתודה או האנודה, הערך של קוסינוס הממוצע הוא קרוב ל+ (קתודה) או -. (האנודה) 1.0 C ) כיווניות מוצגות על ידי ערך קוסינוס, אשר מומר מזוויות ההגירה (θ). קוסינוס (θ) שווה את היחס של המרחק (מרחק הגירה) לb מרחק (המרחק המוקרן לכיוון השדה החשמלי).

3. שמור את המדידות. לייבא את הנתונים ליישום מסד נתונים כדי לחשב את התוצאות המשולבות.
4. לייצא את הנתונים בשילוב של מהירות הגירה ממוצעת וערך קוסינוס הממוצע לגיליון אלקטרוני כדי לתכנן את הגרפים בר (איור 5).

Results

שתי שורות של תאי ערמונית (pRNS-1-1 וPNT2) נחקרו בשיטה זו. תאים בשני הקווים להעביר במהירויות דומות של 1.0 +/- 0.3 מיקרון / min במהלך 2 שעות (איור 5 א). עם זאת, כיווניות לשדה החשמלי היא 0.7 +/- 0.3 לpRNS-1-1 הקו, ו -0.2 +/- 0.8 לקו PNT2 (איור 5). התוצאות מראות הבדל משמעותי בgalvanotaxis של שתי שורות תאים אלה (p <0.01, 100 תאים היו במעקב), המצביע על כך שיש להם מנגנוני איתות תאיים שונים הגורמים לתגובות שונות כיוונית לרמזים positional.

Discussion

הניתוח של תגובת galvanotaxis של תא היה חיווי פונקציונלי חשוב עבור רבים נודדים או צמיחה סלולריות מעבד ^{27, 28.} כאן אנו משתמשים קאמריים מחוייט עם משטח זכוכית לצלם את שתי שורות תאי ערמונית. שורות תאים אלה הפגינו דרגות שונות של galvanotaxis, ואנחנו משערים כי הלוקליזציה תאית או ההפעלה של החלבונים מתווכים-galvanotaxis עלולה להתנגש בתהליך של יצירת שורות תאים האלמותיות, וכתוצאה מכך ההבדל שנצפה בתגובת galvanotaxis.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<תאים חזקים>
pRNS-1-1 תאי			Lee, et al. (1994)
תאי ערמונית PNT2	סיגמא-אולדריץ'	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
<חזק>בינוני ותמיסות
RPMI 1640 בינוני	Invitrogen	11875-093	להתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש
סרום בקר עוברי - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% ב-PBS, לחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100x)	Life Technologies	15240	להוסיף 5 מ"ל ל-500 מ"ל בינוני
2-פרופנול	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ Na<>sub2HPO4 ו-1.5 מ"מ KH2PO4 ב-1,000 מ"ל של H2 O, pH עד 7.4 ואוטוקלאב, מתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש
0.25% טריפסין-EDTA	Invitrogen	25200-056	להתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש, יש לטפל בתאים במשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות; C
<חזק>מכשיר Galvanotaxis
תאי Galvanotaxis	Precision Plastics Inc, CA		תאי PVC שקופים ולא רעילים. אנא צור קשר עם המחברים לקבלת מפרט העיצוב.
אלקטרודות Galvanotaxis		חשמלית UCD	אלקטרודות מפותלות פלטינה עם כבלים גמישים
תיבת חשמל Galvanotaxis	הנדסת מצעים, קליפורניה		תפוקת מתח DC בעיצוב מותאם אישית עם מד מתח
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית, גדולה, 45 x 50 מ"מ, מס' 1.5	פישר	12-544-F
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית, קטנה, 25 x 25 מ"מ, מס' 1	ThermoScientific	3307
סמן נקודת יהלום	ThermoScientific	750
אוטם סיליקון בדרגה ימית, שקוף	3M	051135-08019
גריז ואקום גבוה	Dow Corning	2021846-0807
מזרק 6 מ"ל	פישר סיינטיפיק	05-561-64
מזרק Nichiryo, 1.5 מ"ל	Nichiryo	SG-M
אפליקטורים כותנה	מוצרים רפואיים פורטיאן	806-WC
Qtips	ג'ונסון & ג'ונסון	729389
Nalgene 180 צינורות PVC	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar
Razor	Blade Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	מופעל עם רוטור A-4-62
Cellometer Auto T4	Nexcelom	אוטומטי T4
תאי ספירת תאים	Nexcelom	CHT4-SD100-002	עומס 20 & #956; l פתרונות תאים לספירת
צלחת חימום טמפרטורת תרבות	Bel-Art Scienceware	370150000	כדי לשמור על תאי הגלוונוטקסיס ב-37 מעלות; C
מיקרוסקופ Eclipse TE-2000 עם במה ממונעת ותא סביבתי	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 אובייקטיבי מצלמת	Nikon
Retiga EX CCD	Qimaging		Cooled CCD camara, מונו-צבע, 12 סיביות
אוויר דחוס עם 5% CO2	Airgas		הזמנה מיוחדת
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image רכישת תוכנה
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell תוכנת מעקב ומותאמת אישית למדידת זוויות נדידה
FileMaker Pro Advanced, 8.0	יוצר
Microsoft Excel 2008 עבור Mac	Microsoft