מאמר שיטה

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

DOI:

10.3791/51994

⸱

9 באוקטובר 2014

 ,  ,  , 
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, 3Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי הפריסה המרחבית והתנועה של רכיבי קרום כמו שומנים וחלבונים הם גורמי מפתח בוויסות של פונקציות רבות תאיות. עם זאת, בשל הדינמיקה מהירה והמבנים הזעירים המעורבים, נדרשת רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה מאוד כדי לתפוס את ההתנהגות האמיתית של מולקולות. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הניסוי ללימוד הדינמיקה של חלבוני פלזמה קרום fluorescently שהכותרת ושומנים בתאים חיים עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה. יש לציין, גישה זו אינה צריכה לעקוב אחר כל מולקולה, אך היא מחשבת התנהגות אוכלוסייה תוך שימוש בכל המולקולות באזור נתון של הקרום. נקודת המוצא היא הדמיה מהירה של אזור נתון על הממברנה. לאחר מכן, פונקצית autocorrelation מרחב ובזמן מוחלטת מחושבת מקשרת תמונות שנרכשו בהגדלת עיכובי זמן, למשל כל 2, 3, n חזרות. ניתן להוכיח כי הרוחבשל השיא של עליות פונקצית autocorrelation מרחבית בהגדלת עיכוב זמן כפונקציה של תנועת חלקיקים עקב דיפוזיה. לכן, ראוי של הסדרה של פונקציות autocorrelation מאפשר לחלץ את החלבון בפועל מתכוון עקירה מרובעת מההדמיה (iMSD), כאן מוצג בצורה של diffusivity לכאורה נגד עקירה ממוצעת. זה מניב מבט כמותית של הדינמיקה הממוצעת של מולקולות בודדות עם דיוק ננומטר. על ידי שימוש בגרסת GFP-tagged של transferrin קולטן (TFR) וATTO488 המסומנת 1-palmitoyl-2-הידרוקסי sn -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) ניתן לצפות ברגולצית spatiotemporal של דיפוזיה חלבון והשומנים על אזורי קרום מיקרומטר בגודל בטווח זמן מיקרו ל-מילי שניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החל מהמודל המקורי "פסיפס נוזל" על ידי זינגר וניקולסון, התמונה של קרום פלזמה סלולארי כבר מעודכנת באופן רציף במהלך העשורים האחרונים על מנת לכלול את התפקיד המתפתח של תחומים שלד תא ושומנים בדם 1,2.

התצפיות הראשונות התקבלו על ידי שחזור ניאון לאחר photobleaching הסרת לוט (FRAP) שחלק ניכר של חלבונים בממברנה הוא נייח 3-5. מחקריו החלוציים הללו, למרות שמאוד אינפורמטיבי, סבלו מעניה יחסית ברזולוציה במרחב (מיקרון) וזמן (שניות) של מערכי FRAP. כמו כן, להיות מדידת מיצוע הרכב, FRAP חסר במתן מידע על מולקולה בודדת התנהגות.

בהקשר זה, את האפשרות לתייג מולקולה בודדת עם תגים בהירים מאוד (המאפשרים מחקר של המולקולה אחת תהליך דיפוזיה בכל פעם) במיוחד היה מוצלח מאוד. במיוחד, על ידי לחיצה עלרזולוציה של הגישה יחידה חלקיקים מעקב (SPT) ללוח הזמנים מיקרו, Kusumi, et גישה צברה אל. לתכונות ידועות של דינמיקת שומנים וחלבונים שתרמו רב להכרה בתפקידו של שלד קרום מבוסס אקטין בפיזיולוגיה קרום 6 זמן , 7. ממצאים אלה שנוצרו מה שנקרא 'כלונסאות וגדר' מודל, שבו דיפוזיה שומנים והחלבונים מוסדרת על ידי שלד מבוסס אקטין. עם זאת, על מנת לקבל גישה לכמות העצומה של מידע המסופק על ידי נושאים רבים ניסיוניים SPT יש לטפל. במיוחד, הליך התיוג מורכב בדרך כלל על ידי צעדים רבים כמו ייצור, טיהור והכנסה של המינים שכותרתו לתוך המערכת. יתר על כן, חברות תקליטים גדולות, כמו נקודות קוונטיות או חלקיקי מתכת, נדרשות לעתים קרובות כדי להגיע ללוח זמנים משנה אלפית השנייה וcrosslinking של מולקולות המטרה על ידי התווית לא ניתן היה להימנע במקרים רבים. לבסוף, מסלולים רביםיש שיירשם כדי שיתאים לקריטריונים סטטיסטיים ובו זמנית בצפיפות נמוכה של התווית נדרש כדי לאפשר מעקב.

בהשוואה לSPT, ספקטרוסקופיה מתאם הקרינה (FCS), להתגבר על רבים מחסרונות אלה, מייצגת גישה מאוד מבטיחה ללמוד דינמיקה מולקולרית. למעשה, FCS עובד היטב גם עם תוויות עמומות וצפופות, מה שמאפשר ללמוד את הדינמיקה של מולקולות מתויג חלבון פלואורסצנטי בתאי transfected הזמני. כמו כן, זה מאפשר להגיע לסטטיסטיקה גבוהה בכמות מוגבלת של זמן. לבסוף, למרות הצפיפות "הגבוהה" של תוויות FCS מספק מידע מולקולות בודדות. תודה לכל המאפיינים האלה, FCS מייצגת גישה מאוד פשוטה ויושם בהרחבה ללמוד דינמיקת שומנים וחלבונים הן בממברנות מודל ובשידור חיים תאים 8-10. גישות רבות ושונות הוצעו כדי להגביר את היכולת של FCS כדי לחשוף את הפרטים של דיפוזיה מולקולרית. לדוגמא, זה היה shשלו כי על ידי ביצוע FCS באזורי תצפית שונה בגודל אחד יכול להגדיר תכונות "חוק דיפוזיה FCS" מאיר עיניים מוסתרות של תנועה המולקולרית 11,12. חוץ מזה שהיה שונה בגודל, באזור המוקד היה גם משוכפל 13, עבר בחלל לאורך קווי 14-20 או מצומדות עם מצלמות מהירות 21,22. באמצעות המתאם 'מרחב ובזמן "אלה גישות, פרמטרים ביולוגיים רלוונטיים של מספר מרכיבי קרום תוארו כמותית משני קרומי מודל ואלה ביולוגיים בפועל, ובכך תובנה מניבות לארגון המרחבי קרום.

עם זאת, בכל FRAP ויישומי FCS שתואר עד כה בגודל של אזור המוקד מייצג מגבלה ברזולוציה מרחבית שלא ניתן להתגבר עליו. שיטות הדמיה ברזולוציה סופר כמה פותחו לאחרונה כדי לעקוף מגבלה זו. חלקם מבוססים על דיוק לוקליזציה, כגון מיקרוסקופיה אופטית סטוכסטיים שחזור (STORM) 23,24, מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (PALM) 25, PALM הקרינה (FPALM) 26, וPALM מעקב חלקיק יחיד (sptPALM) 27: הכמות הגדולה יחסית של פוטונים הנדרשים בכל תמונה, לעומת זאת, מגביל את הרזולוציה של הזמן שיטות אלה לפחות כמה אלפיות השניה, ובכך פוגעות תחולתם in vivo.

בניגוד לכך, חלופה מבטיחה להדמיה ברזולוציה סופר נפתח על ידי מרחבית ויסות פליטת הקרינה עם שיטות מגורה דלדול פליטה (STED או מעברים הפיכים saturable אופטי הקרינה (RESOLFT)) 28,29. גישות אלה משלבים עיצוב תצפית הנפח נמוך בהרבה מהמגבלה העקיפה עם האפשרות להשתמש מיקרוסקופי סריקה מהירה ומערכות איתור. בשילוב עם ניתוח תנודות הקרינה, מיקרוסקופיה STED אפשרה לחקור ישירות את דינמיקת spatiotemporal ננומטריים של שומנים וproteins בקרום תא חי 30,31.

ניתן להשיג את אותו כמויות הפיזיות של מיקרוסקופיה מבוססת STED ידי ספקטרוסקופיה הותאם מרחב ובזמן מתאם תמונה (STICS 32,33) שיטה שמתאימה ללימוד הדינמיקה של חלבוני fluorescently- מתויג קרום ו / או שומנים בתאים חיים ועל ידי מיקרוסקופ מסחרי. פרוטוקול הניסוי המובא כאן מורכב על ידי כמה צעדים. הראשון דורש הדמיה מהירה של האזור של עניין על הממברנה. לאחר מכן, הערימה של תמונות וכתוצאה מכך משמשת לחישוב פונקציות מתאם מרחב וזמן הממוצע. על ידי התאמת הסדרה של פונקציות מתאם, ניתן להשיג "חוק דיפוזיה 'המולקולרי ישירות מהדמיה בצורה של diffusivity לכאורה (אפליקציה D) - לעומת עלילת עקירת -average. עלילה זו באופן ביקורתי תלויה בסביבה נבחנה על ידי המולקולות ומאפשרת הכרה ישירות מצבי דיפוזיה בפועלשל השומנים בדם / החלבון של עניין.

בפרטים נוספים, כפי שמוצג 34 בעבר, פונקצית קורלציה אוטומטית מרחב ובזמן של סדרת תמונה שנרכשה באופן ביקורתי תלויה בדינמיקה של המולקולות נעות בסדרת התמונה שנאסף (יש לציין כי באותו ההיגיון ניתן להחיל ברכישת אונליין שבו רק ממד אחד בחלל נחשב). בפרט, אנו מגדירים את פונקצית המתאם הגבוהה ככל:

figure-introduction-1 (1)

בי figure-introduction-2 מייצג את עוצמת הקרינה שנמדדה בx העמדה, y ובזמן t, figure-introduction-3 ו figure-introduction-4 מייצג את המרחק בx וכיווני y בהתאמה, figure-introduction-5 מייצג את פער הזמן, ו figure-introduction-6 מייצג את הממוצע. פונקציה זו יכולה לבוא לידי ביטוי כמו:

figure-introduction-7 (2)

שבו 'N' מייצגת את המספר הממוצע של מולקולות באזור התצפית, figure-introduction-8 מייצגת את פעולת פיתול בחלל, ו figure-introduction-9 מייצג את autocorrelation של המותניים אינסטרומנטלי. זה אחרון יכול להתפרש כמדד של כמה הפוטונים של פולט אחד פרושים במרחב בשל ההתקנה האופטית / הקלטה (פונקצית התפשטות הנקודה שנקרא, כוחות הביטחון הפלסטיניים, גןעצרת מקורב היטב על ידי פונקצית גאוס). לבסוף, figure-introduction-10 מייצג את ההסתברות למצוא חלקיק במרחק figure-introduction-11 ו figure-introduction-12 לאחר השהיה figure-introduction-13 . אם ניקח בחשבון את דינמיקת diffusive, שבו חלקיקים לנוע באופן אקראי לכל הכיוונים ונתיבים נטו אינם נוכחים, פונקציה זו גם מקורב היטב על ידי פונקצית גאוס בי השונות יכולות להיות מזוהות כממוצעת כיכר העקירה (MSD) של החלקיקים המרגשים . לפיכך, המותניים של פונקצית המתאם (המכונה גם כ figure-introduction-14 ), יכול להיות מוגדר כסכום של MSDS החלקיקים ומותני אינסטרומנטלי וניתן למדוד על ידי גאוס בכושרטינג של פונקצית המתאם עבור כל עיכוב זמן. אני MSD נמדד ניתן להשתמש כדי לחשב diffusivity לכאורה של המולקולות נעות figure-introduction-15 ועקירה ממוצעת figure-introduction-16 כ:

figure-introduction-17 (3)

figure-introduction-18 (4)

שיקולים כמה בהגדרת הניסוי נעשה שימוש יכול להנחות את הקורא בכל הסעיפים הבאים. על מנת לרגש באופן סלקטיבי fluorophores על הקרום הבסיסי של תאי חיים נשתמש תאורה כוללת ההשתקפות פנימית (TIR), תוך שימוש בקרינת TIR מסחרי מיקרוסקופ (TIRF) (ניתן למצוא את פרטים בסעיף החומר). יתר על כן, על מנת לאסוף את ההקרינה דואר נשתמש מטרת הגדלה גבוהה (100x NA 1.47, צמצם מספרי גבוה נדרש לתאורת TIRF) ומצלמת EMCCD (גודל פיזי של פיקסל על מיקרומטר שבב 16). כדי להגיע לגודל פיקסל של 100 ננומטר אנחנו מיישמים עדשת הגדלה נוספת של 1.6x. כפי שנראה להלן, תידרש זמן ברזולוציה מתחת ל -1 msec כדי לתאר כראוי את הדינמיקה של שומני קרום מהירים להלן 100 ננומטר. על מנת להגיע לפתרון זמני זה אנחנו צריכים לבחור אזור של העניין (ROI) קטן יותר מכל השבב של המצלמה (512 x 512). בדרך זו, המצלמה תהיה לקרוא מספר מופחת של קווי הגדלת הרזולוציה הזמן. עם זאת, במשטר קריאה זו מסגרת הזמן יהיה מוגבל על ידי הזמן הנדרש כדי להעביר את החיובים מהחשיפה לשבב הקריאה על המצלמה והיא בדרך כלל בסדר הגודל של אלפיות שנייה לEMCCD 512 x 512 פיקסל. להכות מגבלה זו, טכנולוגיה מתפתחת מאפשרת הסטת ROI-הקווים רק במקום כל המסגרת, with הפחתה יעילה מעשית של הגודל נחשף שבב (הנקרא חיישן קצוץ מצב בEMCCD שלנו). לתצורה זו תהיה אפקטיבית, השבב מחוץ להחזר על ההשקעה חייב להיות מכוסה על ידי כמה חריצים רכובים בנתיב האופטי. הודות להתקנה זו רזולוציה זמן עד ל10 -4 שניות יכולים להיות מושגת. שים לב, עם זאת, כי גישה זו יכולה להיות בשילוב עם setups ניסיוני רב ושונה, כפי שהוסברה בסעיף "הדיון".

הפגנה של השיטה תסופק בתאים חיים, על ידי השימוש בשתי ATTO488 מסומן 1-palmitoyl-2-הידרוקסי sn -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) וגרסה שכותרתו GFP של קולטן transferrin (GFP- TFR). במקרה של ATTO488-PPE גישה זו יכולה לשחזר בהצלחה יישום D כמעט קבוע כפונקציה של תזוזה ממוצעת המצביעה על דיפוזיה לרוב ללא תשלום, כפי שדווחה בעבר 30,35. בניגוד לכך, TFR-GFP תערוכות D יורד 6. יתר על כן, במקרה האחרון זה אפשרי לכמת את הדיפוזיה המקומית ואזור הכליאה הממוצע מעל מיקרון רב במישור הקרום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיול מערכת .1

  1. פונקצית מורחים נקודת כיול (כוחות הביטחון הפלסטיניים)
    1. לדלל 10 μl של 30 פתרון חרוז ניאון ננומטר (כ -5 מיקרומטר) ב90 μl של מים מזוקקים ולאחר מכן sonicate הפתרון עבור 20 דקות. חותך ריבוע (1 סנטימטר x 1 סנטימטר) חתיכת agarose ג'ל (3%) והפיקדון 10 μl של הפתרון בחלק העליון של הג'ל. להפוך את פיסת ג'ל על הזכוכית התחתונה של 2 סנטימטר צלחת פטרי ולסחוט את הטיפה על הזכוכית.
    2. הפעל את תוכנית ההתקנה של הרכישה, לשים המדגם בעל, להגדיר את חשיפת המצלמה וEMgain (100 אלפיות שניים ו -1,000 הם פרמטרים טובים, אבל לייעל בהתאם למערכת) ולחכות למצלמה כדי להתקרר.
    3. חשיפת מצלמה מוגדרת 100 אלפיות שני, EMgain מצלמה ל1,000, מצב רכישה למסגרת העברה, 100 חזרות ואוטומטיות לשמור את ההגדרה.
    4. שימוש בעינית ופוקוס אור מועבר על גבול ג'ל ולאחר מכן להעביר את המטרה למרכז של ג'ל, לשנות את הפוקוס וstart הליך יישור לייזר (בלאס AF, בחר 'התקנת TIRF' ובצע את הליך היישור האוטומטי).
    5. מצא את שדה הראייה עם כתמים מבודדים אחת, מדויק להתמקד בנקודה בהירה (כי בדרך כלל מייצג המצרפי חרוזים) כנקודת התייחסות, לרכוש 100 מסגרות ולחזור על השלב 5-6 פעמים כדי לרכוש כמה נקודות בודדות.
    6. לייבא את הסדרה נרכשה לתכנית עיבוד נתונים וממוצע הערימה בזמן (איור 1 א) ובחר חרוז בודד אחד. תשמור על עצמך כדי לבחור את הקטן ביותר, כדי למנוע אגרגטים חלקיקים.
    7. התאם את התפוצה שנבחרה בעוצמה (דוגמא לפרופיל חרוזים בודד מוצגת באיור 1 ב ') עם פונקצית גאוס באמצעות הפקודה "gaussfit" (בכלי ICS-Matlab בחומרים בMatlab). ודא טוב לנכון על ידי בדיקת השאריות שהושגו (דוגמא לפרופיל גאוס המצויד עם השאריות המקבילה מוצגת in איור 1 ב).
  2. כיול מצלמה
    1. הפעל את המצלמה ולחכות למצלמה כדי להתקרר. הגדרת רכישת המצלמה להגדיר, (כלומר, למצלמה המשמשת לנו להגדיר את החשיפה ל0.5 אלפית שני, EMgain מצלמה ל1,000, מצב רכישה לקצוץ מצב, גודל ההחזר על ההשקעה ל32 x 128, 10,000 חזרות) ולהתחיל את רכישת רקע המצלמה אות.
    2. סדרת מסגרת היבוא שנרכש לתכנית עיבוד נתונים. לחשב ולבדוק את העצמה הממוצעת בכל פיקסל על מנת לוודא שהרקע המצלמה הוא כ שטוח באזור הנבחר של השבב. בקצוץ מצב, להסיר הראשון וכמה קווים אופקיים שעבר (3 עד 10 בהתאם לגודל של ROI) עבור כל מסגרת, כי רקע המצלמה בדרך כלל מוטה בקווי הגבול.
    3. צור היסטוגרמה של הערכים (גם מוגדרת דיגיטלי רמה, DL) בתמונות שנרכשו ערימה (באמצעות 'היסטוריה' הפקודה בMatlab) ואת העלילה הלוגריתםשל תוצאת תדר (באמצעות פקודת semilogy בMatlab). דוגמא להפצת DL לרקע מצלמה מוצגת באיור 2.
      הערה: אם המצלמה עובדת היטב, העלילה תציג שיא כ גאוס (פרופיל פרבולית ביומן בקנה מידה) המייצג את התפלגות ערכים הקשורים לאפס פוטון אחרי דעיכה מעריכית (קו עם שיפוע שלילי ביומן בקנה המידה ) שמייצג את התפלגות ערכים הקשורים לפוטון 1 (איור 2). בפרט, במרכז ואת השונות של פונקצית גאוס מייצגים את המצלמה לקזז וטעייה, בהתאמה, ואילו קבוע הדעיכה של חלק מעריכי מייצג הערכה של DL שהוקצה על ידי המצלמה לכל פוטון יחיד. בMatlab להשתמש בסעיף "CalibrateCamera" של סקריפט בתמיכה בחומרים.
    4. חזור על הפעולה עבור כל המצלמה שנבחרה EMGain ורווח.

.2 תוויתהכנת תא

  1. כדי להכין את יפוזומים הנדרשים לשילוב שומנים 36, לפזר בנפרד 1 מ"ג של DOPE (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine), 1 מ"ג של DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-פרופאן), ו1 מ"ג של PPE-ATTO488 ב 1 מ"ל של כלורופורם. מערבבים יחד 0.5 מ"ל של תמיסת DOPE, 0.5 מ"ל של תמיסת DOTAP, ו25 μl של פתרון PPE-ATTO488 ויבש תחת ואקום ל24 שעות. הוסף 0.5 מ"ל של HEPES חיץ 20 מ"מ, מערבולת במשך 15 דקות וsonicate ל15 דקות ב 40 ° C.
  2. כדי להכין את התא, לשטוף 3 פעמים עם PBS צלחת P100 של המחוברות CHO-K1 (סינית שחלות), להוסיף 1 מ"ל של טריפסין וחנות בחממה במשך 5 דקות. להשעות תאים מנותקים הוספת 9 מ"ל של מדיום DMEM / F12 בתוספת 10% מFBS וזרע 150 μl של פתרון תא בצלחת פטרי המכילה 800 μl של אותו המדיום.
  3. חנות בחממה ל24 שעות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. עבור התאגדות שומנים, להחליף תאים בינוניים עם 500μl של מדיום סרום ללא; לאחר 30 דקות, להוסיף 2 μl של פתרון ליפוזומים; לאחר 15 לשטוף דקות עם PSB ולהוסיף בינוני DMEM / F12 חדש להדמיה.
  4. לTransfection, תאי transfect על פי פרוטוקול Lipofectamine (הוראות יצרן) באמצעות פלסמיד TFR-GFP וחנות hr 24 בחממה לפני ההדמיה.

.3 Data Acquisition

  1. הכנת תוכנית ההתקנה
    1. כדי טרמוסטט מיקרוסקופ, 24 שעות לפני הניסוי להפעיל את החממה.
    2. על מנת להחיל את זמן רכישת השגה המהירה ביותר, עבודה בחיישן קצוץ מצב (ראה מבוא) ולהשתמש במצלמה ראשונה להדמיה (מצלמה 1) ומצלמה שנייה כדי לבחור את התא (המצלמה 2). ערכה של הגדרת התצורה מוצגת במשלים איור S1. ואז, כדי ליישר את תור שתי מצלמות על המיקרוסקופ ולחכות למצלמות כדי להתקרר.
    3. להגדיר בשני מצלמות הפרמטרים להדמית אור מועברת (כלומר , 20 אלפיות שני לזמן חשיפה, 1 לEM רווח) ולשים את המיקרוסקופ במצב מואר שדה.
    4. שים את הדגימות בבעל ולהתמקד באמצעות עינית, לשלוח האור למצלמה 1 ודחף בעדינות את החריצים המאפשרים אור היחיד בROI המשמש להדמית תא (כאן ROI 32 x 32 פיקסלים).
    5. הזז תא באזור נבחר ולשלוח האור למצלמה 2, ולאחר מכן לצייר את ההחזר על ההשקעה בתוכנה ששולטות במצלמה 2 כדי שתהיה לי התייחסות.
  2. הדמיה (איור 3 א)
    1. קודם כל, ליישר את לייזר TIRF בהתאם לנוהל של ההתקנה שלך. בהגדרה שלנו, לבחור את "הגדרת TIRF 'ולהתחיל את הליך היישור האוטומטי. כאשר הלייזר מיושר להגדיר 70 ננומטר של עומק חדירה (כ -70 °).
    2. להגדיר זמן חשיפה ל70 אלפית שניים וEMGain 100 משני המצלמה 1 והמצלמה 2; לאחר מכן, בחר תא באמצעות מצלמה 1, ולאחר מכן לשלוח את האור במצלמה 2 ובאופן מדויק להתמקד קרום התא. הגדר את החשיפה המינימלית על caMera 2, 1,000 EMGain, חיישן קצוץ מצב, 10 5 חזרות ושמירה אוטומטית מוגדרת כמתאימות קבצים (מערכת תחבורה תמונה גמישה, פורמט שיכול להיות בקלות הצליח).
    3. הפעל את הרכישה כדי להקליט את סדרת התמונה. שחרר את רווח והמצב הקצוץ, כדי לאפשר ייצוב טמפרטורה לפני הרכישה סלולארי חדש, ולאחר מכן לחזור על שני השלבים האחרונים במטרה לרכוש 8-10 תאים.

.4 חישוב הממוצע כיכר העקירה מהדמיה (i MSD)

הערה: הפרוטוקול הבא יכול להיות מיושם ישירות לנתונים גולמיים. באותו הזמן, כל הפרוטוקול תקף לנתונים רכישות מדומה הן בMatlab ובSimFCS. ניתן למצוא הקישור להדרכות המתאימות בסעיף 'חומרי'.

  1. חישוב על ידי Matlab
    1. לייבא את הסדרה נרכשה לMatlab באמצעות ImportImageSeries תסריט. לחשב את העצמה הממוצעת של כל תמונה בזמן באמצעות שיתוףmmand אומר על 2 הממדים הראשונים ולהשתמש בעלילה כדי לראות את הווקטור וכתוצאה מכך.
    2. אם יותר מ10% מphotobleaching הוא הווה, לבטל את הסדרה או להסיר את חלקו הראשון שלהם. אם הוא נמוך, לנסות ולתקן את ההשפעה על תפקוד המתאם על ידי הפחתה לכל תמונה בעוצמה הממוצעת שלה, כפי שמוצג לפני 37.
    3. לחשב את העצמה הממוצעת של כל פיקסל באמצעות ממוצע בממד השלישי ותראה את תוצאת תמונה.
      הערה: תשומת לב מיוחדת הנדרשת על מנת להימנע ממתאמי artifactual. למעשה, כפי שהוצג קודם לטכניקות דומות 38, גבולות תא, כמו גם משלפוחית ​​המוקד יכול להציג את המתאם חזק. אם הבדיקה של התמונה הממוצעת מגלה גבולות תא או החוצה של שלפוחית ​​מוקד, לנסות להוציא את האזור המעורב בדרך אחרת לבטל את הרכישה. כדי לתקן את ההשפעה של מבנים נייחים זה להחסיר את עוצמת הזמנית הממוצעת מכל פיקסל 39.
    4. לחשב tהוא מתאם spatiotemporal (G (ξ, χ, τ)) על ידי שימוש בפונקציה CalculateSTICScorrfunc. הסר G (ξ, χ, 0) כי המתאם בשל רעש הירייה במשטר התאורה נמוך שולט G (0,0,0); המתאם בשל הגלאי שולט G (± 1,0,0), ותנועת חלקיקים בזמן החשיפה יכול לעוות G (ξ, χ, τ) לτ = 0 על ידי הגדלת המותניים נמדדו (אפקט זה נעלם לτ > 0) 34.
    5. G הממוצע (ξ, χ, τ> 0), תוך שימוש בזמן bin לוגריתמים כדי להפחית את הרעש על ידי שימוש בפונקציה "LogBinStack" בתמיכה בחומר ולאחר מכן להתאים את G וכתוצאה מכך (ξ, χ, τ) "gaussfit" באמצעות הפונקציה של הכלים ICS-Matlab בחומרים להתאושש i MSD (העמודה השנייה של המערך וכתוצאה מכך).
    6. העלילה σ הושג המותניים (τ) 2 (i MSD) כפונקציה של זמן. אם הנתונים הם רועשים מדי, תנסה להגדיל את מספר acquמסגרות ired, להגדיל את כוח הלייזר, ממוצע יותר G (ξ, χ, τ) יחד.
  2. חישוב על ידי SimFCS
    1. פתח את הקבצים שנרכשו עם ImageJ באמצעות תוסף היבואן BioFormat ולשמור סדרה נרכשה כרצף Tiff.
    2. כלי פתוח SimFCS ובחר RICS ובחר קובץ> תמונות מרובות יבוא (S2 איור משלים).
    3. בחר Fit, להכניס את הפרמטרים לרכישה הנכונות ולסגור את החלון בכושר (S3 איור משלים).
    4. בחר תצוגה> עוצמה ממוצעת> CH1 ולוודא את נוכחותו של photobleaching (S4 איור משלים).
    5. אם יותר מ10% מphotobleaching קיים קלפים שנזרקו הסדרה או אם זה עומס אפשרי שוב את התמונה ברצף הסרת החלק הראשון של הסדרה.
    6. אם הלבנת זה בחר באפשרות כלים נמוך מ10%> אני MSD> הפרמטרים שנקבע, לבדוק 'השתמש בממוצע נע ", שנקבע בפנל את ההחזר על ההשקעה בעזבהחום אדמדם של מסגרת לתשומת הלב משלם הממוצע נע שזמן הכתב הוא גבוה יותר מאשר בפעם דיפוזיה האופיינית (לחלקיקים הנעים בשניות 1 מיקרומטר 2 -1 זמן של 10 שניות הוא ממוצע נע טוב)
    7. בחרו כלים> iMSD> חישוב i MSD (איור משלים S5) ובכושר ולייצא את i MSD מהפנקס (איור משלים S6).

.5 חישוב חוק דיפוזיה מi MSD

  1. להתאים כמה נקודות הראשונות להסיק ליירט (σ 0 2) (5 נקודות הן בדרך כלל מספיק, אבל יכולות להיות מצוידות יותר נקודות אם הם מראים התנהגות ליניארית) ולהשוות את הערך הזה עם כוחות הביטחון הפלסטיניים שנמדדו בעבר 2. אם הם דומים, את הדינמיקה של fluorophores המבודד הם עוקבים אחריו. לעומת זאת, אם σ 0 2 >> כוחות הביטחון הפלסטיניים 2 לנסות לרכוש יותר מהר כדי להבטיח שדינמיקה לא מוסתר נמצאות 34.
  2. לחשב את diffusivity לכאורה (האפליקציה D) ועקירה הממוצעת (R) באמצעות משוואות 3 ו -4 (ראה מבוא).
  3. האפליקציה D עלילה כפונקציה של R כדי להשיג חוק דיפוזיה השוואה עם מה שנמדד עם וריאציה מקום FCS 12 (איור 3D) המבוססת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לכייל את המותניים אינסטרומנטלי, את דמותו של ננו חרוז ניאון בודד יכולה להיות מדד כמתואר בשלב פרוטוקול 1.1. תמונת ניאון אופיינית של חרוזים אלה מוצגת באיור 1. ההולם של חלוקת עוצמה על ידי פונקצית גאוס 2D נותן בחזרה שאריות טובות ומאפשר מדידת המותניים אינסטרומנטלי ב270 ננומטר. ערך זה הוא בהסכם טוב עם המגבלה העקיפה הצפויה המוערכת על ידי משוואת ריילי. כיול זה אינו הכרחי למדידת הדינמיקה של חלקיקים, אבל זה נדרש כדי למדוד את גודל חלקיקים הנראית לעין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) מייצג את אחת מהאסטרטגיות הנפוצות ביותר ללמוד דינמיקה מולקולרית ויש לו את היתרון הגדול של מדידת מסלולי חלקיקים. זה בתורו מאפשר חיטוט ההתנהגות של כמה אפילו חלקיקים שכותרתו במערכת מורכבת. עם זאת, כדי להגיע ליתרון זה SPT בדרך כלל זקוק לצפיפות נמוכה של החללית ותוויות בהירות מאוד. במיוחד, כדי לקבל רזולוציה גבוהה של זמן (טווח μsec) בדיקה אורגנית בדרך כלל נדרשת (לדוגמא, נקודות קוונטיות או חלקיקי מתכת): במקרה זה הליך מורכב של ייצור, תיוג ולהכניסו למער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי NIH-P41 P41-RRO3155 ו-NIH P50-GM076516 (מענק ל-EG), ו-Fondazione Monte dei Paschi di Siena (מענק ל-FB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
iXon Ultra 897AndorDU-897U-CS0
SolisAndor
CHO-K1ATCCCCL-61
ATTO 488 מסומן PPEATTO-TEC GmbHAD 488-151
DOPEAvanti Polar Lipids, Inc.
DOTAPAvanti Polar Lipids, Inc.890890
100x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמיןג'יבקו10378-016
DMEM/F-12גיבקו21331
FBSגיבקו10082147
HEPESגיבקו15630-106 
PBSGibco10010-023
SimFCS 3.0Globals Softwareניתן להוריד את התוכנה כאן: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 עם מודול TIRFLeica
LAS AFLeica
Lipofectamine 2000Lipofectamine11668019
MatlabMathWork
ImageJNIH
[header]
C-terminal GFP מתויג קולטן טראנפריןOriGeneRG200980
AgarSigma AldrichA5306
ChloroformSigma Aldrich528730
חרוזי לטקס, צהוב-ירוק פלואורסצנטי, 30 ננומטרSigma AldrichL5155
סוניקה חומרי ניקוי אולטרסאונדSOLTECETH S3
צלחות פטריWillcoGWSt-3522
יבואן ביו-פורמט עבור Matlabhttp://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
ICS-MatLab Toolshttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip
סימולציה על ידי Matlab הדרכהhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
סימולציה על ידי SimFCS הדרכהhttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt
850725

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Vereb, G., et al. yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (14), 8053-8058 (1073).
  3. Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts. 84 (5), 1290-1293 (1987).
  4. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (12), 4594-4598 (1976).
  5. Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching. J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).
  6. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 351-378 (2005).
  7. Kusumi, A., Ike, H., Nakada, C., Murase, K., Fujiwara, T. Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules. Semin. Immunol. 17 (1), 3-21 (2005).
  8. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36, 176-182 (1999).
  9. Gielen, E., et al. Diffusion of sphingomyelin and myelin oligodendrocyte glycoprotein in the membrane of OLN-93 oligodendroglial cells studied by fluorescence correlation spectroscopy. C. R. Biol. 328 (12), 1057-1064 (2005).
  10. Weiss, M., Hashimoto, H., Nilsson, T. Anomalous protein diffusion in living cells as seen by fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 84, 4043-4052 (2003).
  11. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophys. J. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  12. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO J. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  13. Ries, J., Schwille, P. Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  14. Ruan, Q., Cheng, M. A., Levi, M., Gratton, E., Mantulin, W. W. Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS). Biophys. J. 87 (2), 1260-1267 (2004).
  15. Berland, K. M., So, P. T., Chen, Y., Mantulin, W. W., Gratton, E. Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation. Biophys. J. 71, 410-420 (1996).
  16. Heinemann, F., Betaneli, V., Thomas, F. A., Schwille, P. Quantifying lipid diffusion by fluorescence correlation spectroscopy: a critical treatise. Langmuir. 28 (37), 13395-13404 (2012).
  17. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (25), 9863-9868 (2012).
  18. Sanchez, S. A., Tricerri, M. A., Gratton, E. Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (19), 7314-7319 (2012).
  19. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy of intact nuclear pore complexes. Biophys. J. 101 (4), 27-29 (2012).
  20. Di Rienzo, C., et al. Unveiling LOX-1 receptor interplay with nanotopography: mechanotransduction and atherosclerosis onset. Sci. Rep. 3, 10-1038 (2013).
  21. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophys. J. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  22. Kannan, B., et al. Electron multiplying charge-coupled device camera based fluorescence correlation spectroscopy. Anal. Chem. 78 (10), 3444-3451 (2006).
  23. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-508 (2011).
  24. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3 (10), 793-795 (2006).
  25. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  26. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  27. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  28. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  29. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  30. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457 (7233), 1159-1162 (2009).
  31. Hedde, P. N., et al. Stimulated emission depletion-based raster image correlation spectroscopy reveals biomolecular dynamics in live cells. Nat. Commun. 4, Forthcoming.
  32. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  33. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. J. Cell Sci. 119, 5204-5214 (2006).
  34. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  35. Mueller, V., et al. STED nanoscopy reveals molecular details of cholesterol- and cytoskeleton-modulated lipid interactions in living cells. Biophys. J. 101 (7), 1651-1660 (2011).
  36. Kleusch, C., Hersch, N., Hoffmann, B., Merkel, R., Csiszar, A. Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization. Molecules. 17 (1), 1055-1073 (2012).
  37. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophys. J. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  38. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49 (3), 141-164 (2007).
  39. Digman, M. A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89 (2), 1317-1327 (2005).
  40. Ritchie, K., et al. Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking. Biophys. J. 88 (3), 2266-2277 (2005).
  41. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, 229-236 (1993).
  42. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  43. Wohland, T., Shi, X., Sankaran, J., Stelzer, E. H. Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. Opt. Express. 18 (10), 10627-10641 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP

מאמרים קשורים