העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

סיכום

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

תקציר

התרבויות מועשרות קולטי האור קונוס נגזרות מרשתית חומוס עוברית הפכו לכלי הכרחי עבור חוקרים ברחבי העולם לומדים את הביולוגיה של תאי עצב ברשתית, במיוחד קולטני אור. היישומים של מערכת זו ללכת מעבר למחקר בסיסי, כפי שהם יכולים בקלות להיות מותאמים לטכנולוגיות תפוקה גבוהות לפיתוח תרופות. עם זאת, מניפולציה גנטית של קולטני האור ברשתית בתרבויות אלה הוכיחה להיות מאוד מאתגרים, שהתחזה הגבלה חשובה התועלת של המערכת. פיתחנו לאחרונה ומאומתים לשעבר אוב טכניקת electroporation פלסמיד שמגבירה את קצב transfection של תאי רשתית בתרבויות אלה על ידי פי חמש בהשוואה לפרוטוקולים זמינים כעת אחרים ^1. בשיטה זו enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27, הרשתית מוסרת, וכוס הרשתית ממוקמת בפתרון המכיל פלסמיד וElectroporated באמצעות מנהג נבנה בקלותאלקטרודות עשויות. אז הרשתית הם ניתקו ותרבותיים באמצעות נהלים סטנדרטיים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרי ביטוי יתר כמו גם לdownregulation של ביטוי גנים, למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi מונע פלסמיד, בדרך כלל השגת ביטוי transgene ב -25% מאוכלוסיית קולטי האור. הווידאו בפורמט של הפרסום הנוכחי יהפוך את הטכנולוגיה הזו בקלות נגישה לחוקרים בתחום, המאפשר חקר תפקוד גן בתרבויות רשתית עיקריות. גם יש לנו כלל הסברים מפורטים של השלבים הקריטיים של הליך זה לתוצאה ושחזור מוצלח.

מבוא

תרביות תאים ניתקות מרשתית חומוס העוברית היו בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של תא קולטי האור, כולל ההישרדות שלהם ^2-9, בידול ^10-12, תולדת neurite ^13, ועוד. היתרונות של מערכת זו, שפותחו בשנת 1980 על ידי ראובן אדלר ומשתפי פעולה ושוכללו על ידי הקבוצות האחרות שלו ^ו14-20, מתגוררים במאפיינים הפנימיים של החומוס כמודל חיה ^21. הגודל הגדול של העין החומוס, אפילו בשלבים עובריים, מספק כמויות גדולות של חומר לתרבויות. יתר על כן, כאשר תרבויות מבוצעות באמצעות יום עוברי (ED) 5 - 6 רשתית, 55 - 80% מהתאים שלהם להבחין בקולטני אור ^{14,15,18,22,23,} ומאז כ 86% מהקולטניים האור בבעלי חיים זה הם קונוסים ^24, תרבויות אלה מתאימים במיוחד למחקרים המתמקדים בסוג תא זה.

יש לנו לאחרונה developed ומתאפיין בטכניקה פשוטה שמאפשרת לtransfection פלסמיד יעילות גבוהה של התאים בתרבויות אלה, ובכך להרחיב את השימושיות של מערכת זו על ידי הקלת מחקרים הגנטי missexpression ^1. הפיתוח של טכניקה זו נבע מחלל בשיטות שיספקו רמה מקובלת של transfection כדי לאפשר לחקר תפקוד הגן באופן אוטונומי תא הספרות המדעית. זה בין שאר משום שתרבויות עצביות עיקריות הן ידוע לשמצה קשה transfect ^25,26. כמה הטכניקות הנפוצות ביותר הזמינות בעבר למטרה זו כללו שיטות כימיות transfection כגון transfection תיווך פוספט lipofection או סידן, אשר תוצאת היעילות בצו של 3-5% ויכולים להפעיל רעילות ניכרת ^27-32. למרות שהשימוש בפלסמידים עם מערכת כתב האנזימטית יכולים לעקוף את הבעיה של יעילות transfection עניה על ידי הגברת האות, הם לאלהפלות השפעות תא ספציפי, והתוצאות שלהם מבוססות על אוכלוסיית תאים קטנה שלא יכול להיות נציג של כל. שיטה נפוצה נוספת בחומוס, זיהום בנגיף RCAS, חל רק על תאים מתרבים ולכן לא מתאימה למערכת זו עיקרי רשתית התרבות ^33.

בפרוטוקול הנוכחי enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27 (ED 5), האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוסר, וכוס הרשתית ממוקמת בתא electroporation המלא עם פתרון המכיל פלסמיד וelectroporated באמצעות מחוייט אלקטרודות, ואחרי ניתוק רשתית ותרבות תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית ^21. לאחר אופטימיזציה הליך זה הצלחנו להשיג יעילות transfection באופן עקבי על מנת של 22% מהמספר הכולל של תאים בתרבית ו -25% בקרב אוכלוסיית קולטי האור לבד, מבלי להתפשר על מאפייני הישרדות ובידול שלתרבויות ^1. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים החשובים של הליך זה על מנת להבטיח את הצלחת ושחזור של טכניקה זו.

פרוטוקול

כל הנהלים שתוארו בעבודה זו בוצעו על פי ההנחיות המומלצת על ידי הטיפול בבעלי החיים ושימוש הוועדה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. לפני זמן: הכנת מכשירים, ריאגנטים ומנות

1. הכנת הביצים: ביצי דגירה עוף הלבן ליבורנו מופרה ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% לחות יחסית במשך 5 ימים בחממת ביצה.
   הערה: חממה עם הנדנדה קיבולת עשויה להיות מועיל לתקנון וסנכרון התפתחות עוברית, אבל הנדנדה היא לא הכרחי לתוצאה של פרוטוקול זה.
2. פלסמיד הכנה:
   1. פלסמיד העיצוב לבנות לביטוי יתר של גן או downregulation (למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi ^1,34) לפי צורך. כולל גן כתב (כגון EGFP, RFP או LacZ) במבנה בכל הזדמנות אפשרית.
      הערה: חלק יזמים נפוצים כגון CMV, יכולים להיות מושתקים לאחר הזמן. Promot CAGאה (בטא-אקטין עוף עם אמרגן משפר CMV) הוא אלטרנטיבה טובה מאוד, מתן ביטוי לטווח ארוך יעיל של הגן של העניין ^35-37.
   2. הכן פתרון פלסמיד בריכוז של 1.5 מיקרוגרם / μl בPBS סטרילי. אופציונאלי: הכן פתרון פלסמיד מראש ולאחסן אותו קפוא עד מוכן לשימוש.
      הערה: ריכוזים גבוהות פלסמיד לא לגרום לעלייה משמעותית ביעילות, ואילו שימוש בריכוזים נמוכים פלסמיד להוריד את יעילות transfection ^1.
3. אלקטרודות:
   1. לשימוש האנודה זהב עבה הטה אלקטרודה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי). נקה עם אתנול 70%.
      הערה: בידוד של הזהב הטה אלקטרודה, עוזב כ 0.5 מ"מ החשוף, מומלץ למזעור זליגה של הזרם החשמלי. ניתן למצוא מידע על חומר בידוד בטבלה של חומרים ספציפיים.
   2. הפוך קתודה מב מרובע 2.5 מ"מנימה שור, רחבה 4.5 מ"מ (משמשת בדרך כלל במושכי micropipette). בעזרת מלקחיים, לבטל את התיבה מרובעת וליישר נימה לתוך רצועה ארוכה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ לנתיחה ובאמצעות סרגל כמדריך, לכופף את החוט לצורת ריבוע 'U' ארוכה 3 מ"מ בבסיס ו -2 מ"מ גבוה בצד אחד, עם צד האורך הנותר של חוט הלהט (איור 1 האחר , C - D). בעזרת מלקחיים, לטבול את האלקטרודה ב 96% אתנול ולהבה לעקר. לאחר מכן לצרף את יתרון חשמלי עם קליפ תנין קטן לזרוע הארוכה של האלקטרודה.
4. התקנת Electroporation הלשכה:
   1. להכין את חדר electroporation על ידי חיתוך את המכסה של צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר סטרילי והדביק אותו בצד, שטוח למטה, לקלטת באמצעות 100 מ"מ צלחת פטרי (איור 1E).
      הערה: מיכל אחר בצורה של גם של גודל דומה יעבוד; עם זאת, מכסה צינור microcentrifuge נגיש בקלות וautoclavable. הבארחייב להיות גדול מספיק כדי לאכלס אלקטרודה העין חומוס והקתודה, אבל לא כל כך גדול כמו לגרום לבזבוז של פתרון פלסמיד.

2. אקס אוב Electroporation נוהל

1. הכנה של מכשירים:
   1. לעקר כלים מיקרו לנתיחה (2 זוגות מלקחיים מעוקלים מולוני הגדולים לפתיחת קליפות ביצים וגורפים את עוברים, 2 זוגות עדין קצה המעוקל פינצטה דומון להסרת הרשתית, זוג אחד של בון שיניים מלקחיים לעדשת הסרת וזגוגית) על ידי הטבילה טיפים ב 96% אתנול ולוהט. היקף נתיחה נקי באמצעות מגבונים טבולים באתנול 70%. לחמם בקבוק של תמיסת מלח מאוזנת של האנק סידן-מגנזיום ללא סטרילי (CMF-HBSS) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מלא 100 מ"מ צלחות פטרי סטרילית ל3/4 מלא עם CMF-HBSS החם.
   2. הנח תא electroporation תחת מיקרוסקופ לנתיחה אחר נקי ומלא עם 120 μl של פתרון פלסמיד. חבר אלקטרודות למנגנון electroporation, מה שהופך אתאלקטרודה מחוייט בטוחה מחוברת לקוטב השלילי וזהב הטה אלקטרודה לקוטב החיובי.
2. אוסף עובר:
   1. נקה את הביצים על ידי מנגב פגזים עם מגבונים הרטוב באתנול 70%. לשמור על הליך סטרילי בכל שאר הפרוטוקול להתחמק מביצוע זיהום לתרבויות. בעזרת מלקחיים מעוקלים מולוני גדולים לפתוח בזהירות חור בקליפת הביצה בעדינות על ידי הקשה על הקצה המעוגל של ביצה (מעל תא האוויר) ולאחר מכן מרתק ומושכים את חתיכות קליפה.
   2. עם עוד זוג מלקחיים להסיר קרומים ולאסוף עובר על ידי גורף מתוך הביצה זה (נזהר שלא לפגוע בעובר). מניחים אותו בצלחת עם CMF-HBSS.
      הערה: איסוף עובר לפי צורך כדי לקבל את המספר הרצוי של כוסות רשתית לelectroporation כמפורט ב2.4.4
   3. שלב קריטי: שלב העוברים על פי המבורגר והמילטון ^38.
      הערה: לקבלת עוברי יעילות אופטימליותחייב להיות בשלב 27 (איור 2 א).
   4. להרדים את העוברים על ידי עריפת ראש באמצעות מלקחיים מולוני.
3. קבלת כוסות רשתית:
   1. באמצעות פינצטה דומון בסדר, enucleate בזהירות את העיניים ולהעביר לצלחת CMF-HBSS חדש.
   2. החל מהחלק האחורי של כל עין, קרובה לראש עצב הראייה, ובאמצעות שתי פינצטה דומון בסדר, להציג קצה אחד של כל פינצטה בין הרשתית העצבית ורשתית ובזהירות לנתח את הרשתית להיות זהירה כדי לא לגרום נזק לעצבים רשתית (איור 2).
      הערה: חוסר Ca ^{2 +} וMg ^{2 +} בפתרון יעזור לי הרשתית להתנתק מהרשתית העצבית בקלות רבה יותר.
4. Electroporation:
   1. הגדרת הפרמטרים של electroporator לספק 5 פולסים מרובעים של 15 וולט, 50 משך msec, ומרווח 950 אלפיות שני. מקום 'U' בצורת האלקטרודה שלילית בתוך תא electroporation (מילוי המכסה microcentrifugeאד עם 120 μl של פתרון המכיל פלסמיד).
   2. פינצטה דומון המעוקל באמצעות העברת כוס רשתית אחד לתא electroporation (על ידי גורף, לא לחיצה), ולמקם אותו בתוך האלקטרודה בצורה 'U', עם החלק האחורי של הרשתית לכיוון החלק התחתון של האלקטרודה ואת העדשה כלפי מעלה ( איור 2).
   3. מניחים את האנודה, כך שהוא נוגע בחלק הקדמי של העין, בסמוך לעדשה, ובאמצעות דוושת הרגל של electroporator לספק פולסים חשמליים.
   4. העבר את כוס רשתית electroporated לצלחת פטרי חדשה עם CMF-HBSS וחזור על הליך electroporation עם כל אחד מכוסות הרשתית שנותרו.
      הערה: עד 6 כוסות רשתית ניתן electroporated עם אותו פתרון פלסמיד ללא ירידה משמעותית ביעילות transfection.
   5. הסר את העדשה וגוף הזגוגי של כל כוס רשתית electroporated על ידי אחיזתם עם מלקחיים שיני בון ומשייכתו בעדינות באמצעות tהוא תלמיד פתיחה תוך החזקת עין במקום בגב פינצטה דומון המעוקל.
   6. המשך לניתוק והתרבות של התאים ברשתית electroporated הבאים נהלים סטנדרטיים.
      הערה: לפרוטוקול מפורט על הניתוק והתרבות של תאים ברשתית חומוס מתייחס לVergara וקנטו-סולר, 2012, קובץ נוסף 4 ²¹ בפרוטוקול זה התאים הם זורעים בצפיפות נמוכה על 6 צלחות היטב מצופה polyornithine או 35. מנות -mm (6 x 10 ⁵ תאים / 35 מ"מ בקוטר טוב או צלחת). הבינוני משמש הוא בינוני 199 עם פניצילין / גלוטמין, 10% בסרום עגל עוברי (FCS), והחומצה לינולאית-BSA ב 100 מיקרוגרם / מיליליטר. התרבויות נשמרות בחממה 37 ° C humidified עם 5% CO _2. באמצעות הליך זה, 5 - יכול בדרך כלל לקבל 6 x 10 ⁶ תאים לכל עין electroporated שלב 27.
      הערה: באופן אידיאלי, לא יותר מ 3 שעות צריכה לעבור בין אוסף עובר וציפוי תא, כדי להבטיח את הישרדות תא טובהולמזער את המתח. תזמון אופייני להתבוננות וניתוח נוסף הוא אחרי 4 ימים בתרבות, מאחר שבשלב זה התאים השיגו בידול מורפולוגיים ומולקולרי טוב וההישרדות היא עדיין גבוהה.

תוצאות

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט לtransfection פלסמיד לכוסות רשתית חומוס enucleated לתרבית תאים ניתק שלאחר מכן. Transfection מושגת על ידי שימוש בelectroporation קל לעשות אלקטרודות מותאמות אישית (איורים 1 - 2). הפרמטרים שתוארו בפרוטוקול זה כבר מותאם להשגת יעילות transfection שנע בין 20 ל 27% (עם ממוצע של 22%) (איור 3D). שימו לב כי, לטעמים האמורים לעיל, תוצאות אלה לכמת אחרי 4 ימים בתרבות. בהקשר זה, יעילות transfection מתייחסת לאחוז התאים המבטאים את הגן ...

דיון

השלב הקריטי ביותר להצלחה של פרוטוקול זה הוא בחירת השלב המתאים של העוברים. בפרסומים קודמים, מגוון של שלבים עובריים ניתן לתרבויות אלה, מוגדרים בדרך כלל על ידי הימים של ימי דגירה או עוברי (ED); כך זה בדרך כלל להניח כי השימוש בED 5 לED 6 עוברים יניבו תוצאות שווה ערך. עם זאת מצאנו כי בשלב 27 (ED 5), יעילות transfection תהיה סביב 22% מכלל אוכלוסיית התא, כאמור לעיל; עדיין יעילות תקטן ל -16% אם באמצעות שלב 28 עוברים (ED 5.5), ועד 12% בשלב 29 (ED 6) ^1. שלבים קריטיים אחרים כוללים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ECM 830 אלקטרו מרובע Porator	BTX / מכשיר הרווארד	45-0052
Genetrode, בצורת L, 5 מ"מ קצה זהב	BTX / מכשיר הרווארד	45-0115 דגם 512	אלקטרודה עם קצה זהב המשמשת כאנודה
צינורות פולימיד	אוורור רפואי	בהתאמה אישית	קוטר פנימי: 0.5 מ"מ / עובי דופן: 0.15 - 0.2 מ"מ. משמש לבידוד אלקטרודה
עם קצה זהבחוט קופסה מרובע 2.5 מ"מ, רוחב 4.5 מ"מ	Sutter Instrument Company	FB245B	משמש לייצור אלקטרודת
קתודה HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום	Gibco - Life Technologies	14175-095
מלקחיים מולוני	Roboz	RS-8254	משונן; עקומה קלה; פינצטה באורך 4.5 אינץ'
Dumont 5/45	Roboz	RS-5058	דפוס #5, זווית 45 מעלות; גודל קצה .10 x .06 מ"מ; מלקחיים מיקרו בון באורך 109 מ"מ
1x2 שיניים	Roboz	RS-5172	; שיניים 1x2, שיניים 0.12 מ"מ; אורך 3.75 אינץ'; רוחב קצה 0.3 מ"מ

, פלטפורמת קשירה