המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש צורך דחוף לפתח גישות לתיקון הלב הפגוע, שגילו תרופות טיפוליות חדשות שאין להם השפעות רעילות על הלב, ושיפור אסטרטגיות לדגמן מחלות לב באופן מדויק. הפוטנציאל של ניצול טכנולוגיה אנושית מושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) כדי ליצור שריר לב "בצלחת" עבור יישומים אלה ממשיך לייצר גבוהה התלהבות. בשנים האחרונות, את היכולת ליצור ביעילות תאי cardiomyogenic מתאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) השתפרה מאוד, מציעה לנו הזדמנויות חדשות למודל של פיתוח לב אנושי שלבים מוקדמים מאוד לא אחרת נגישות. בניגוד לרבים שיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש צבירת תא או תוספת של Activin או BMP4 וחסונה מייצר תרביות של תאים שהם חיוביים מאוד לטרופונין לבי וT (TNNI3, TNNT2), iroquois- חלבון homeodomain הכיתהIRX-4 (IRX4), שרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם חדרית / שריר לב (MLC2v) ושרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם פרוזדורים (MLC2a) ביום 10 בכל תא הגזע העוברי האנושי (hESC) וקווי hiPSC נבדק כדי תאריך. ניתן passaged תאים ונשמרו במשך יותר מ 90 ימים בתרבות. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום וחסכוני. אפיון של שריר לב שמקורם בתאי pluripotent לעתים קרובות כולל ניתוח של סמני התייחסות, הן בmRNA ורמת חלבון. לניתוח חלבונים, cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת איכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות. עם זאת, וריאציה טכנית בהכנת מדגם יכולה באופן משמעותי להשפיע על איכות של cytometry זרימת הנתונים. לפיכך, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים צריכה לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול שונות. בהתאם לכך, מותאם פרוטוקולי צביעה לניתוח IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, וTNNT2 על ידי cytometry זרימה מתוארים.
מבוא
הדור של שריר לב מhPSCs, כולל hESC וhiPSC, יכול לתפקד כמודל במבחנה של תהליכים התפתחותיים לב אנושיים מאוד מוקדם, מתן תובנה שלבים לא אחרת נגישים למחקרים מכניסטית. מערכת מודל זה מספקת הזדמנויות ייחודיות ללמוד את המסלולים המולקולריים השולטים במחויבות שושלת לב ומפרט גורל תא. בשנים האחרונות, היכולת לייצר תאי cardiomyogenic ביעילות מhPSCs השתפרה 1-15 מאוד. עם זאת, בין פרוטוקולים יש וריאציה שורת תאים ביחס ליעילות ביצירת תאי cardiomyogenic ועיתוי שבו התאים להביע סמני תא ספציפי (לדוגמא, חדר ופרוזדורים). באופן אידיאלי, ליישומים עתידיים של מערכת מודל זה, אוכלוסיות הומוגניות יותר של תאים מוגדרים מבחינה תפקודית הן....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
.1 פתרון ומדיה הכנה
- פתרון מניות ציפוי מטריקס מוסמך hESC
- לאט להפשיר hESC מטריצה מוסמכת (5 מ"ל) על קרח בשעה 4 ºC לילה. לוותר aliquots לתוך צינורות microcentrifuge מראש צונן, 1.5 מ"ל סטרילי ולאחסן מייד ב-20 ºC.
הערה: נפח aliquot ישתנה בהתאם להרבה, ובדרך כלל נע 270-350 μl. יצרן מספק פרטים בדבר היקף aliquot הנדרש כדי להשיג את ריכוז 1x על דילול ל25 מ"ל כמתואר בשלב 2.1.
- לאט להפשיר hESC מטריצה מוסמכת (5 מ"ל) על קרח בשעה 4 ºC לילה. לוותר aliquots לתוך צינורות microcentrifuge מראש צונן, 1.5 מ"ל סטרילי ולאחסן מייד ב-20 ºC.
- hPSC פתרונות מניות מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ביום 0, תאים ומחוברות% 100 עם מורפולוגיה קומפקטית ופסולת תא מינימאלית. בימים 1-2, זה מקובל לצפות מוות של תאים משמעותיים (40-50%), אבל תאים מצורפים ישמרו מורפולוגיה קומפקטית (איור 1 א). במהלך תקופה זו, תקשורת היא כתומה ועכורה. תקשורת פינק מציינת מוות של תאים מופרזים, ובמקרה זה, לאשר עם trypan הכחול ולהפסיק אם המוות של תאים עולה על 70%. תאים יתאוששו בימים 3-4 וצפיפות תגדל. בימים 5-6, מוות של תאים מינימאליים מתרחש וטלאים צפופים עשויים להתחיל להופיע. על ידי ימים 7-8, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קריטי להצלחה של פרוטוקול הבידול הוא השימוש בתרבויות באיכות גבוהה של hPSCs כי כבר passaged ברמת התא הבודד לפחות חמישה קטעים שקדמו לתחילתו של בידול. יעילות בידול דומה נצפתה באופן שיגרתי בין קווי hPSC שונים אם הם מחוברות 100% בתחילת הבידול, עצמאיות של שורת תאים. היעילות הכי מוצלחת הוא ציין אם נקודת המפגש של תאים בתחילת הבידול היא ≤95% או> 100%. לכן, צפיפות זריעה ועיתוי של passaging צריך להיות מותאם בקפידה עבור כל קו כדי להשיג monolayers מחוברות 100% בתחילת הבידול. בהקשר זה, ציפוי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי NIH 4R00HL094708-03, ענייני מחקר MCW ועדת ניו פקולטה פרס, וקרן קרן (קופות אתחול) במכללה הרפואית של ויסקונסין (RLG); מועצה למחקר מענקים של תכנית מחקר T13-706 / 11 (KRB) המבוסס על ערכת נושא הונג קונג; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05,394, וAHA נוסד פרס חוקר (JCW); AHA דוקטורים המלגה 12POST12050254 (PWB). אנו מודים התקווה קמפבל בcytometry הזרימה Core של דם מכון המחקר של ויסקונסין לסיוע באיסוף הנתונים ובדיקה מעמיק של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>תרבית תאים | |||
| BD מטריג'ל, מטריקס מוסמך hESC | BD Biosciences | 354277 | |
| תמיסת ניתוק תאי אקוטאז | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום | Life Technologies | 14190-136 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO, Hybri-Max, מסונן סטרילי) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| נתרן ביקרבונט | Sigma Aldrich | 53817 | |
| חומצת לימון | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 מעכב p160ROCK סלקטיבי p160ROCK R | & D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| נתרן סלניט | סיגמא אולדריץ' | S5261-10G | |
| טרנספרין (Optiferrin – מוגדר, ללא בעלי חיים, אדם רקומביננטי) | Invitria | 777TRF029 | |
| גורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF2) | R& D Systems | 4144-TC-01M | |
| גורם גדילה טרנספורמטיבי בטא 1 (TGFβ 1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 עם L-גלוטמין ו-15 מ"מ HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| אינסולין | סיגמא אולדריץ' | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 עם L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| תוסף B-27 מינוס אינסולין | Life Technologies | A1895601 | |
| תוסף B-27 (עם אינסולין) | Life Technologies | 17504-044 | |
| סרום בקר עוברי | Life Technologies | 10437 | |
| <>Flow Cytometry Reagents | |||
| Phosphate buffered salt (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא Ca2+ ו-Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| מתנול | סיגמא אולדריץ' | 179957-4L | |
| אצטון | Mallenckrodt כימיקלים | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| תמיסה כחולה טריפאן, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| <חזק>חומרים | |||
| 5 מ"ל צינור פוליסטירן תחתון עגול (ללא מכסה) | קורנינג | 352008 | להכנת תאים לזרימה ציטומטריה |
| 5 מ"ל צינור פוליסטירן תחתון עגול (עם 35 µ כובע הצמד מסננת תאים M) | קורנינג | 352235 | להכנת תאים לזרימה ציטומטריה |
| 2 מ"ל נורות גומי | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9 "בורוסיליקט לא מחובר זכוכית פסטר פיפטס | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, בוגר, ירוק | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, בוגר, אדום | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 מונה תאים אוטומטי | BioRad | 145-0102 | |
| ספירת שקופיות עבור TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 בארות צלחת מטופלת בתרבית רקמות תחתונה | שטוחה קורנינג | 353046 | |
| 20 מ"ל מזרקים | BD Plastipak | 300613 | לעיקור מסנן של aliquots |
| מסנני מזרק סטריליים, 0.2 ומיקרו; m polyethersulfone | VWR | 28145-501 | לעיקור מסנן של aliquots |
| 250 מ"ל מערכת סינון, 0.22 ומיקרו; m polyethersulfone, עיקור, כריכה נמוכה | Corning | 431096 | לעיקור מסנן של מדיה בתפזורת |
| מערכת סינון 500 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m polyethersulfone, מעקר, 431097 קורנינג בעל קשירה נמוכה | לעיקור מסנן של מדיה | ||
| <חזק>נוגדנים ובקרות איזוטיפים | |||
| >אנטי-TNNI3 (שיבוט: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | נוגדן ראשוני |
| Anti-TNNT2 (שיבוט: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | נוגדן ראשוני |
| Anti-MYL2 (MLC2v, שיבוט: 330G5) | מערכות סינפטיות | 310111 | נוגדן ראשוני |
| אנטי-MYL7 (MLC2a, שיבוט: 4E7) | Abcam | AB131661 | נוגדן ראשוני |
| נגד IRX4 | Bioss | BS-9464R | נוגדן ראשוני |
| Alexa Fluor 488 עיזים נגד עכבר IgG1 | Life Technologies | A21121 | נוגדן משני |
| Alexa Fluor 647 עיזים נגד עכבר IgG2a | Life Technologies | A21241 | נוגדן משני |
| Alexa Fluor 488 עיזים נגד עכבר IgG2b | Life Technologies | A21141 | נוגדן משני |
| Phycoerythrin(PE) עיזים נגד ארנב IgG | R& D Systems | F0110 | עכבר נוגדנים משני |
| IgG1 | BD Biosciences | 557273 | בקרת איזוטיפ |
| IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | ארנב בקרת איזוטיפ |
| IgG-PE | R& D Systems | IC105P | Isotype Control |
| <חזק>TaqMan בדיקות עבור qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | HS01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | HS01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | HS00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 | |
מקורות
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
