Method Article

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

DOI:

10.3791/52014

⸱

November 22nd, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S -Adenosyl-l-מתיונין (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTase) לזרז את העברת הקבוצה מתיל מופעלת מAdoMet לתפקידים מסוימים בדנ"א, רנ"א, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות. תגובת מתילציה טבעית זה יכול להיות מורחב למגוון רחב של תגובות אלקילציה באמצעות אנלוגים cofactor סינטטיים. החלפה של מרכז sulfonium תגובה של AdoMet עם טבעת aziridine מובילה לקו-פקטורים שיכולים להיות בשילוב עם ה- DNA על ידי MTases DNA השונים. יכול להיות מצויד קו-פקטורי aziridine אלה עם קבוצות כתב בעמדות שונות של מחצית אדנין ומשמשים לM equence הספציפי S ethyltransferase- אני nduced ing הבל L של DNA (DNA מחייך). כדוגמא טיפוסית שאנו נותנים לפרוטוקול biotinylation של פלסמיד דנ"א pBR322 ברצף 5'-ATCG 'T-3 עם DNA MTase M.BseCI והקו-פקטורי aziridine 6BAz בצעד אחד. סיומת של קבוצה מתיל מופעלת עם תוצאות קבוצות אלקיל בלתי רוויות בסוג אחר של אנלוגים AdoMet המשמשים לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups ctivated G (mTAG). הואיל וצד הרשתות המורחבות מופעלות על ידי מרכז sulfonium וקשר בלתי רווי, קו-פקטורים אלה נקראים אנלוגים AdoMet כפולים הופעלו. אנלוגים אלה לא רק פונקציה כקו-פקטורים לMTases DNA, כמו הקו-פקטורי aziridine, אלא גם לRNA, חלבונים וMTases מולקולה קטנה. הם משמשים בדרך כלל לשינוי האנזימטית של מצעי MTase עם קבוצות פונקציונליות ייחודיות אשר כותרתו עם קבוצות כתב בצעד כימי שני. זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לתיוג הקרינה חלבון היסטון H3 של. קבוצת propargyl קטנה מועברת מSeAdoYn האנלוגי cofactor לחלבון על ידי ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ואחריו תיוג לחיצהH3 היסטון alkynylated עם אזיד טמרה. תיוג בתיווך MTase עם אנלוגים cofactor הוא טכנולוגיה המאפשרת ליישומים מרגשים רבים כוללים זיהוי ומחקר פונקציונלי של מצעי MTase כמו גם genotyping DNA וגילוי מתילציה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג ספציפי של חומצות גרעין וחלבוני 1,2 3,4 הוא עניין גדול לאפיונים פונקציונליים, אבחון רפואי וביוטכנולוגיה (ננו). כאן אנו מציגים שיטת תיוג האנזימטית לbiopolymers אלה המבוסס על -adenosyl-l-מתיונין S (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTases). המעמד הזה של אנזימים (EC 2.1.1.) מיועד לעמדות פרט nucleophilic (חנקן, חמצן, גופרית ואטומה פחמן) בתוך שאריות ספציפיות של חומצות גרעין וחלבונים ובאופן טבעי מעביר את הקבוצה מתיל מופעלת של AdoMet cofactor (איור 1 א) 5. בנוסף, MTases יכול לנצל אנלוגים cofactor סינטטיים לתיוג ספציפי עם תגי זיקה, fluorophores או תוויות אחרות (איור 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הוראות כלליות

  1. הקו-פקטור aziridine חנות 6BAz (בDMSO) וחלבון MTase Set7 / 9 ב -80 ° C וכל חומרים כימיים האחרים, כולל קו-פקטור מופעל כפול SeAdoYn וDNA MTase M.BseCI (ב- 50% גליצרול) ב -20 ° C.
  2. קבע את הריכוז של 6BAz וSeAdoYn באמצעות / Vis ספקטרוסקופיה באמצעות UV 269nm מקדמי ε ההכחדה (6BAz) = 16,000 -1 סנטימטר M -1 וε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 -1 סנטימטר M -1 במים ללא יונים. קבע את הריכוז של MTases ידי assay ברדפורד או....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג צעד אחד של DNA באמצעות קו-פקטורי Aziridine

תגובת דוגמא זו מתבצעת עם DNA MTase M.BseCI, אשר משנה את שאריות אדנין השניה בתוך רצף פעמיים תקועים 5'-ATCG T-3 "ויש לו אתר הכרה אחד על פלסמיד pBR322 (איור 4 א). כדי לבדוק תיוג פלסמיד, pBR322 הוא קרא תיגר עם endonuclease ההגבלה (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 "). יש R.TaqI שבעה אתרים בpBR322, שאחד מהם כלול באתר M.BseCI. אם תיוג מתרחש, אתר M.BseCI י.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג צעד אחד של DNA עם MTases DNA וקו-פקטורי aziridine (DNA מחייך) הוא שיטה חזקה אבל כמה היבטים יש לשקול בעת תכנון הניסוי.

קו-פקטור Aziridine: ריכוז 6BAz לתיוג DNA עם M.BseCI היה 60 מיקרומטר. בעת השימוש בMTases DNA האחר ריכוז הקו-הפקטור צריך להיות מותאם, ריכוזים למשל נמוך כמו 20 מיקרומטר להיות מועסק עם DNA MTase M.TaqI 19. יש ריכוזים נמוכים 6BAz היתרון שעודף פי ארבעה של streptavidin (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים חושפים את האינטרס הפיננסי המתחרה הבא: E.W. הוא ממציא של פטנטים קשורים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לקרסטין גלנסק על הכנת MTases M.BseCI ו-Set7/9 ומודים בהכרת תודה על המימון של יוזמת המצוינות של הממשלות הפדרליות והמדינתיות הגרמניות ואוניברסיטת RWTH אאכן. המחברים שמחים לספק 6BAz ו-SeAdoYn או אנלוגים אחרים של קופקטורים למחקר שיתופי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6BAzמסונתז על פי Weinhold et al., מספר פטנט US 8,129,106, פורסם ב-6 במרץ 2012.
β-MercaptoethanolServa28625
חומצה אצטיתFisher Scientific10304980
תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5:1Serva10688
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100
אמוניום פרסולפט (APS)Serva13375
Bis-TrisGerbu1304
חומצה בוריתגרבו1115
ברומופנול כחול Na מלחServa15375
נחושת (II) סולפטAldrichC1297
כלורופורםפישר Scientific10020090
Coomassie Brilliant BlueServa17525
EDTA מלח דיסודיוםגרבו1034
אתנולMerck100983
GelRed (10,000x במים)ביוטיום41003
גליצרול (99.5%)Gerbu2006
FastRuler סולם DNA לטווח נמוךThermo ScientificSM1103
היסטון H3פלסמיד ביטוי שהתקבל מד"ר פיליפ וויגט ופרופ' דני ריינברג; ביטוי ובידוד על פי T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
פלסמיד ביטוי M.BseCIשהתקבל מד"ר מיכאל קוקינידיס; ביטוי ובידוד על פי Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
מתנולפישר סיינטיפיק10675112
מגנזיום כלוריד  הקסהידרטJ.T. Baker4003
MOPSGerbu1081
נתרןכלורי גרבו1112
רצועת pH (Neutralit)Merck1,095,330,001
pBR322Thermo ScientificSD0041
R.TaqI (10 u/µ l)Thermo ScientificER0671
SeAdoYnמסונתז על פי Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9ביטוי פלסמיד שהתקבל מפרופ' דני ריינברג, ביטוי ובידוד על פי ד. ריינברג ואחרים, Genes Dev.2002, 16, 479-489.
סטרפטווידיןגרבו3058
(+)-נתרן L-אסקורבטסיגמא מדעי החייםA7631
SDS גרבו גרגירי1833
די-נתרן מימן פוספטMerck106,586
TAMRA אזידמסונתז על פי הפניה 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x)Thermo ScientificB28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Acros Organics42058
Tris-HClGerbu1028
Tris-X (TRIS-base)Gerbu1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)Sigma-Aldrich762342

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
  2. Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Methyltransferase LabelingSequence specific DNA LabelingProtein Fluorescence LabelingAziridine Cofactor AnaloguesDouble activated AdoMet AnaloguesM BseCI DNA MethyltransferaseSet7 9 Histone MethyltransferaseSMILing DNA TechniquemTAG Enzymatic TransferClick Chemistry Labeling

Related Articles