Method Article

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

DOI:

10.3791/52014

⸱

November 22nd, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S -Adenosyl-l-מתיונין (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTase) לזרז את העברת הקבוצה מתיל מופעלת מAdoMet לתפקידים מסוימים בדנ"א, רנ"א, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות. תגובת מתילציה טבעית זה יכול להיות מורחב למגוון רחב של תגובות אלקילציה באמצעות אנלוגים cofactor סינטטיים. החלפה של מרכז sulfonium תגובה של AdoMet עם טבעת aziridine מובילה לקו-פקטורים שיכולים להיות בשילוב עם ה- DNA על ידי MTases DNA השונים. יכול להיות מצויד קו-פקטורי aziridine אלה עם קבוצות כתב בעמדות שונות של מחצית אדנין ומשמשים לM equence הספציפי S ethyltransferase- אני nduced ing הבל L של DNA (DNA מחייך). כדוגמא טיפוסית שאנו נותנים לפרוטוקול biotinylation של פלסמיד דנ"א pBR322 ברצף 5'-ATCG 'T-3 עם DNA MTase M.BseCI והקו-פקטורי aziridine 6BAz בצעד אחד. סיומת של קבוצה מתיל מופעלת עם תוצאות קבוצות אלקיל בלתי רוויות בסוג אחר של אנלוגים AdoMet המשמשים לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups ctivated G (mTAG). הואיל וצד הרשתות המורחבות מופעלות על ידי מרכז sulfonium וקשר בלתי רווי, קו-פקטורים אלה נקראים אנלוגים AdoMet כפולים הופעלו. אנלוגים אלה לא רק פונקציה כקו-פקטורים לMTases DNA, כמו הקו-פקטורי aziridine, אלא גם לRNA, חלבונים וMTases מולקולה קטנה. הם משמשים בדרך כלל לשינוי האנזימטית של מצעי MTase עם קבוצות פונקציונליות ייחודיות אשר כותרתו עם קבוצות כתב בצעד כימי שני. זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לתיוג הקרינה חלבון היסטון H3 של. קבוצת propargyl קטנה מועברת מSeAdoYn האנלוגי cofactor לחלבון על ידי ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ואחריו תיוג לחיצהH3 היסטון alkynylated עם אזיד טמרה. תיוג בתיווך MTase עם אנלוגים cofactor הוא טכנולוגיה המאפשרת ליישומים מרגשים רבים כוללים זיהוי ומחקר פונקציונלי של מצעי MTase כמו גם genotyping DNA וגילוי מתילציה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג ספציפי של חומצות גרעין וחלבוני 1,2 3,4 הוא עניין גדול לאפיונים פונקציונליים, אבחון רפואי וביוטכנולוגיה (ננו). כאן אנו מציגים שיטת תיוג האנזימטית לbiopolymers אלה המבוסס על -adenosyl-l-מתיונין S (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTases). המעמד הזה של אנזימים (EC 2.1.1.) מיועד לעמדות פרט nucleophilic (חנקן, חמצן, גופרית ואטומה פחמן) בתוך שאריות ספציפיות של חומצות גרעין וחלבונים ובאופן טבעי מעביר את הקבוצה מתיל מופעלת של AdoMet cofactor (איור 1 א) 5. בנוסף, MTases יכול לנצל אנלוגים cofactor סינטטיים לתיוג ספציפי עם תגי זיקה, fluorophores או תוויות אחרות (איור 1) 6. שתי כיתות של אנלוגים AdoMet פותחו: קו-פקטורי Aziridine לי ethyltransferase- M S equence ספציפי L ing (מחייך) 7 ואנלוגים כפולים מופעלים AdoMet לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups G ctivated (mTAG) 8.

figure-introduction-1
איור 1: תגובות זרזו ידי methyltransferases (MTases) העברת א תיל קבוצה מהקו-הפקטורים הטבעיים AdoMet (SAM) למצעים שונים, כולל DNA, RNA, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות B. התיוג / functionalization של חומצות גרעין וחלבונים (לעדכונו =.. זוגות בסיסים לDNA, נוקלאוטידים לחומצות אמינו RNA וחלבונים; XXXXX = רצף הכרה בMTase עם שאריות יעד בירוק) עם אנלוגים cofactor סינטטיים. קו-פקטורי Aziridine המכילים קבוצת כתב (כדור הכחול)מצורף לטבעת אדנין הם הרצף במיוחד בשילוב עם שאריות היעד (משמאל) ואנלוגים מופעלים כפולים AdoMet להוביל להעברת חלק מרשתות אלקיל הוארכו ביצוע Y כתב כימי (מימין) שיכול להיות מתויג בתגובה לחץ bioorthogonal בשלב שני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קו-פקטורי Aziridine יעבדו הכי טוב עם MTases DNA. הם מכילים טבעת membered שלוש עם אטום חנקן 9 (או N -mustard 10,11) במקום מרכז sulfonium קבוצה תגובתי כ. Protonation של אטום חנקן זה מפעיל את טבעת aziridine להתקפת nucleophilic ידי נוקלאוטיד היעד שמוביל לקוולנטיים צימוד של כל הקו-הפקטור עם DNA. על ידי הצמדת קבוצות כתב לטבעת אדנין הקו-פקטורי aziridine ניתן להשתמש בשילוב עם MTases DNA לתייג DNA בשלב אחד ( g> איור 1, משמאל) 7,12. זו באה לידי הביטוי בפירוט לbiotinylation של DNA עם 13 6BAz - 15 (קו-פקטור aziridine עם ביוטין מצורף לעמדת 6 של טבעת אדנין) ואדנין הספציפי DNA MTase מstearothermophilus Bacillus (M.BseCI) 16 (איור 2, ראה פרוטוקול סעיף 2: תיוג צעד אחד של DNA באמצעות aziridine קו-פקטורים). בנוסף לM.BseCI ("רצף ההכרה, MTases DNA מThermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG -3 5'-ATCG T-3)"), מheamolyticus Haemophilus (M.HhaI, 5 "-G C GC-3 ') ומספירופלסמה (M.SssI, 5'- C G-3") שימשו בהצלחה לbiotinylate DNA עם 6BAz 17. יתר על כן, יכול להיות מועסק קו-פקטורי aziridine לתיוג DNA הקרינה צעד אחד 18,19.

ontent "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד "> figure-introduction-2
איור 2:. Biotinylation צעד אחד ספציפי רצף של DNA עם M.BseCI ו6BAz DNA MTase M.BseCI מכיר את רצף פעמיים תקועים DNA 5'-ATCG T-3 "ובאופן טבעי methylates קבוצת אמינו של אדנין השני שאריות (ירוק) באמצעות AdoMet. עם הקו-פקטור aziridine 6BAz במהלך התגובה משתנה וM.BseCI מוביל לרצף biotinylation DNA הספציפי על ידי צימוד כל cofactor כולל ביוטין (כחול) עם אדנין היעד. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנלוגים AdoMet מופעלים זוגי מכילים הוארכו שרשרות צד בלתי רוויות במקום קבוצה מתיל במרכז sulfonium (איור 1 20. הקשר כפול או משולש בלתי רווי בβ-עמדה למרכז sulfonium אלקטרוני מפצה אפקטים סטרית שליליים בתוך מדינת המעבר על ידי ייצוב conjugative. מאחר ששני מרכז sulfonium והקשר בלתי רווי להפעיל את שרשרת הצד להעברה האנזימטית, הקו-הפקטורים הללו בשם אנלוגים AdoMet כפול הופעלו. בדרך כלל, הם משמשים להעברת רשתות בצד עם קבוצות ייחודיות כימיות (כתבים כימיים), כמו קבוצות אמינו, alkyne ויזיד, לתיוג הכימותרפיה סלקטיבי בשלב שני 8,21. באופן כללי, אנלוגים מופעלים כפולים AdoMet לא יכולים לתפקד רק כקו-פקטורים לDNA MTases 8,20,21 אלא גם לRNA MTases 22,23 וMTases חלבון 24-28 המאפשרים תיוג נוסף של RNA וחלבונים. עם זאת, בצד הרשתות המורחבות הן sterically תובעניים יותר מקבוצה מתיל והרחבת האתרים הפעילים MTase על ידי חלבון הנדסה היא לעתים קרובותen נדרש כדי להשיג קצבי העברה יעילה. פתרון נוסף לבעיה זו הוא להשתמש אנלוגי AdoMet עם קבוצה קטנה propargyl (שלושה פחמנים) שבו alkyne המסוף משרת שתי פונקציות: 1. ייצוב של מצב המעבר בעת ההעברה האנזימטית ו2. ידית תגובה לשינויים כימיים הבאים על ידי נחושת cycloaddition אזיד-alkyne זרז (CuAAC) לחץ כימיה. התברר כי propargylic כתוצאה האנלוגית AdoMet 29 הוא די יציב בתנאים ניטראליים או מעט בסיסיים ושימוש מוגבל בלבד. חסרון זה יכול להיות קבוע על ידי החלפת אטום הגופרית עם סלניום. הקו-פקטור תוצאת 5 '- [(Se) [(3 S) -3-אמינו-3-carboxypropyl] אבזר-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosine (SeAdoYn, איור 3) מתקבל על ידי DNA wild-type, RNA וMTases חלבון 30-32 שיבטלו את הצורך בהנדסת חלבונים במקרים רבים. זה בא לידי ביטוי על ידי הקרינה פרו תיוג חלבון עם ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (איור 3, ראה סעיף פרוטוקול 3: תיוג חלבון שני שלבים באמצעות קו-פקטורים כפולים מופעלים).

figure-introduction-3
איור 3:. תיוג הקרינה שני שלבי רצף ספציפי של היסטון H3 עם Set7 / 9, אזיד SeAdoYn וטמרה החלבון MTase Set7 / 9 באופן טבעי methylates קבוצת אמינו של ליזין 4 בH3 היסטון (H3K4, הירוקה) באמצעות AdoMet. עם הקו-הפקטור מופעל הכפול SeAdoYn MTase מעביר קבוצה קטנה propargyl (אדום) לשאריות ליזין. הקשר משולש, המסוף המצורף מכן שונו באופן סלקטיבי בתגובת לחץ bioorthogonal (cycloaddition אזיד-alkyne-זרז נחושת, CuAAC) עם (tetramethylrhodamine, כחול) fluorophore-derivatized אזיד טמרה.עומס / 52,014 52014fig3highres.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הוראות כלליות

  1. הקו-פקטור aziridine חנות 6BAz (בDMSO) וחלבון MTase Set7 / 9 ב -80 ° C וכל חומרים כימיים האחרים, כולל קו-פקטור מופעל כפול SeAdoYn וDNA MTase M.BseCI (ב- 50% גליצרול) ב -20 ° C.
  2. קבע את הריכוז של 6BAz וSeAdoYn באמצעות / Vis ספקטרוסקופיה באמצעות UV 269nm מקדמי ε ההכחדה (6BAz) = 16,000 -1 סנטימטר M -1 וε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 -1 סנטימטר M -1 במים ללא יונים. קבע את הריכוז של MTases ידי assay ברדפורד או, אם מקדם ההכחדה נגיש, באמצעות קליטה ישירה ב 280 ננומטר.
  3. נסה להימנע מיצירת בועות על ידי pipetting או vortexing האינטנסיביים על מנת למנוע אובדן של פעילות אנזים. במקום זאת, לערבב בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה.
  4. בעת הוספת קו-פקטורי aziridine מפתרונות מניות בDMSO לוודא שריכוז DMSO הסופי בassay הוא פחותמ -5%. תמיד כולל 10 מ"מ יוני מגנזיום במאגר assay כדי למנוע תגובות שאינן ספציפיות עם DNA.
  5. בעת הוספת קו-פקטורים כפולים מופעלים מפתרונות מניות חומצי להשתמש בנפחים קטנים (פתרונות מניות מרוכזים מאוד), כדי למנוע שינויי pH ולוודא כי pH של תמיסת assay אינו משתנה באופן משמעותי. הימנע thiols, למשל, β-mercaptoethanol או dithiothreitol (DTT), במאגר assay כי הם יכולים להפריע לתגובה לחץ על ידי complexation של יוני הנחושת הנדרש.

2. תיוג צעד אחד של DNA באמצעות קו-פקטורי Aziridine

  1. ing Label-מושרה Methyltransferase רצף ספציפי (מחייך) של ה- DNA פלסמיד עם M.BseCI DNA MTase והקו-פקטורי aziridine 6BAz.
    1. להפשיר את פתרון הקו-הפקטור של 20 מעלות צלזיוס ולהכין את תערובות תגובה על קרח.
    2. בנוסף לassay לבצע שליטה "קו-פקטור", כדי לחזות כל שינוי שאינו ספציפי, ו& #8220; אנזים "שליטה, לוודא כי הכנת MTase היא ללא AdoMet cofactor הטבעית.
    3. לתערובת 2 μl assay של חיץ שינוי 10x (המכיל 100 מ"מ טריס-HCl, 100 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ β-mercaptoethanol, pH 7.4), 2 μl של pBR322 (0.5 מיקרוגרם / μl), 10 EQ. M.BseCI לרצף הכרה בDNA (רצף הכרה 1 בpBR322) והקו-פקטורי aziridine 6BAz לריכוז סופי של 60 מיקרומטר בתוך נפח כולל של 20 μl. הוספת קו-פקטור וDNA MTase אחרון.
      הערה: β-mercaptoethanol הוא רעיל ומאכל ומזיק לסביבה.
    4. לשליטה "קו-הפקטור" להוסיף מים ללא יונים במקום M.BseCI ולשליטה "אנזים" להוסיף מים ללא יונים במקום 6BAz.
    5. מערבבים את הפתרונות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
    6. דגירה הצינורות על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    7. בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורות.
  2. assay Restriction-השינוי כדי לוודא שינוי DNA.
    1. הכן פתרון על ידי ערבוב 10 μl 10x חיץ R.TaqI (המכיל 100 מ"מ טריס-HCl, 50 מ"מ MgCl 2, 1 M NaCl, 1 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור, pH 8.0), מים ללא יוני 80 μl 3.3 μl של endonuclease הגבלה (REase) מThermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / μl). הקפד להוסיף REase בשלב האחרון.
    2. על צינור אחד מ2.1.7 להוסיף 2 μl של 10x ר 'תקי חיץ ו -28 μl של הפתרון מלמעלה (2.2.1).
    3. מערבבים את הפתרונות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
    4. דגירה הצינורות על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורות.
  3. assay משמרת electromobility (Emsa) עם streptavidin לאמת שינוי פונקציונלי.
    1. הסר 25 μl מצינור אחד (2.2.5) ולהוסיף 2.4 μl של פתרון streptavidin (1 מ"מ ביחס למ 'streptavidinonomer במאגר streptavidin מכיל 100 מ"מ Na 2 4 HPO, 100 מ"מ NaCl, pH 7.5; 4 שווה של ביוטין בסך הכל). להוסיף 2.4 μl של חיץ streptavidin לצינורות הנותרים.
    2. דגירה כל הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. ניתוח באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose.
    1. הוסף 5 μl של חיץ טעינת 6x (bromophenol 0.25% הכחולים, גליצרול 30%) על צינור אחד.
    2. מערבבים בעדינות את הפתרונות.
    3. טען 10 μl של כל דגימה לתוך הבארות של ג'ל agarose (agarose 1% במאגר TBE 0.5x מכיל 1x GelRed מפתרון 10,000x מלאי).
    4. הפעל את הג'ל במאגר TBE 0.5x עם 80 V לכ. שעה 1.
    5. דמיינו להקות DNA על שולחן UV (312 ננומטר) עם מצלמת CCD מצויד במסנן (540 ± 50 ננומטר).
      הערה: אור UV מזיק לעיניים ועור.

3. תיוג חלבון שני שלבים באמצעות קו-פקטורים הופעל זוגי

  1. Methyltransfלמחוק-בימוי העברת קבוצות הופעל (mTAG) עם Set7 / 9 וקו-פקטורים מופעלים כפולים SeAdoYn לתיוג ליזין 4 H3 היסטון (שלב שינוי).
    1. להפשיר את הרכיבים ולהכין את תערובות תגובה על קרח. הערה: שמור תמיד SeAdoYn מקורר כדי למנוע השפלה.
    2. בנוסף לassay לבצע שליטה "קו-פקטור", כדי לחזות כל שינוי ספציפי שאינו, ושליטה "אנזים", שלא לכלול את תגובות הלא ספציפיות של הבדיקה הניאון.
    3. הכן פתרון assay (20 μl) המכיל מאגר שינוי (50 מ"מ טריס-HCl, גליצרול 5%, pH 8.5), 10 מיקרומטר H3 היסטון, 10 מיקרומטר Set7 / 9 ו -600 מיקרומטר SeAdoYn (תערובת של שניהם epimers בסלניום). בשלבים האחרונים להוסיף קו-פקטור ולאחר מכן MTase.
    4. לשליטה "קו-הפקטור" להכין פתרון assay כמו ב3.1.3 ולהוסיף 60 מ"מ AdoMet להתחרות בקו-פקטור הסינתטי. לשליטה "האנזים" להוסיף מים ללא יונים במקום SeAdoYn.
    5. מערבבים את הפתרונות על ידי pipetting לאט למעלה ולמטה. בדוק את ה- pH על ידי הוספת 1 μl של כל פתרון לשדה העליון של רצועת pH (טווח pH 5 - 10).
    6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
    7. בג'ל בינתיים להכין 12% ג'ל polyacrylamide SDS (ריצה: 357 Bis-טריס pH 6.5-6.8 מ"מ, 0.1% (w APS / v), 0.04% (V / V) TEMED ו -12% acrylamide / bisacrylamide 37.5: 1 ; ג'ל טעינה: 357 מ"מ Bis-טריס pH 6.5-6.8, 0.1% (w / v) APS, 0.04% (V / V) acrylamide TEMED ו 5% / bisacrylamide 37.5: 1).
      הערה: Acrylamide / bisacrylamide הוא רעיל ומסוכן לבריאות. ללבוש כפפות במהלך הליך זה.
  2. תיוג כימי של ליזין alkinylated 4 בהיסטון H3 באמצעות cycloaddition אזיד-alkyne (שלב תיוג)-זרז נחושת (CuAAC).
    1. רגע לפני סוף תגובת השינוי להכין תערובת 5x לחץ מכילה 3 מ"מ 4 CuSO, 3 טריס מ"מ (3-hydroxypropyl-triazolylmethyl) האמין (THPTA), ascorbate נתרן 250 מ"מ ו 6 מ"מ אזיד טמרה עםנפח כולל של 20 μl.
    2. הוסף 5 μl של תמהיל לחץ 5x מוכן הטרי על צינור אחד להתחיל CuAAC ולהרוות את תגובת השינוי.
    3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה.
    4. הגן על כל הצינורות בנייר אלומיניום מהאור, כדי למנוע צילום הלבנה של fluorophore.
    5. לדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. ממטרים חלבון כדי להסיר את העודפים של fluorophore טמרה החופשי.
    1. כדי להימנע מoutshining של היסטון H3 הניאון שכותרתו על ידי אינטנסיבי הקרינה בג'ל של fluorophore טמרה החופשי, להסיר fluorophore העודף על ידי משקעים של חלבונים (3.3.2 - 3.3.4) 34.
    2. הוסף 75 מתנול μl, כלורופורם 18.8 μl ו -50 μl deionized מים על צינור אחד ובקצרה מערבולת לאחר כל ההוספה. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 5 דקות. הסר את השלב העליון מבלי להפריע את שכבת הממשק, המכילה את החלבון.
    3. להוסיף 56.3 מתנול μl לשלב שנותר in צינור אחד, מערבולת ו צנטריפוגות ב16,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה החלבון. הסר את supernatant. חזור על שלב זה לשטוף את גלולה.
    4. לכסות את הצינורות הפתוחים עם רקמה נטולה מוך ולתת להם להתייבש במשך 15 - 30 דקות.
  4. ניתוח באמצעות עמוד SDS.
    1. ממיסים את החלבונים זירז מ3.3.4 ב -20 חיץ μl SDS טעינה (50 מ"מ טריס-HCl, 2.5% (w / v) SDS, 10% (V / V) גליצרול, 320 מ"מ β-mercaptoethanol ו 0.05% (w / v) bromophenol כחול, pH 6.8). הקפד לפזר את גלולה לחלוטין על ידי שטיפת הקירות של הצינורות עם טפטפת.
    2. דגירה הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולתת להם להתקרר לטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
    3. בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורות.
    4. טען את כל הסכום של כל דגימה לתוך הבארות של ג'ל SDS polyacrylamide (3.1.7). השתמש 50 מגבי מ"מ, 50 מ"מ טריס-X (טריס-בסיס), 5 מ"מ EDTA, 0.1% (w / v) SDS כחיץ פועל אלקטרופורזה.
    5. הפעל את הג'ל עם 120 V לכ. 90 דקות.
    6. דמיין את הקרינה על שולחן UV (ננומטר 312) בג'ל עם מצלמת CCD מצויד במסנן (540 ננומטר ± 50 ננומטר).
      הערה: אור UV מזיק לעיניים ועור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג צעד אחד של DNA באמצעות קו-פקטורי Aziridine

תגובת דוגמא זו מתבצעת עם DNA MTase M.BseCI, אשר משנה את שאריות אדנין השניה בתוך רצף פעמיים תקועים 5'-ATCG T-3 "ויש לו אתר הכרה אחד על פלסמיד pBR322 (איור 4 א). כדי לבדוק תיוג פלסמיד, pBR322 הוא קרא תיגר עם endonuclease ההגבלה (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 "). יש R.TaqI שבעה אתרים בpBR322, שאחד מהם כלול באתר M.BseCI. אם תיוג מתרחש, אתר M.BseCI י...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג צעד אחד של DNA עם MTases DNA וקו-פקטורי aziridine (DNA מחייך) הוא שיטה חזקה אבל כמה היבטים יש לשקול בעת תכנון הניסוי.

קו-פקטור Aziridine: ריכוז 6BAz לתיוג DNA עם M.BseCI היה 60 מיקרומטר. בעת השימוש בMTases DNA האחר ריכוז הקו-הפקטור צריך להיות מותאם, ריכוזים למשל נמוך כמו 20 מיקרומטר להיות מועסק עם DNA MTase M.TaqI 19. יש ריכוזים נמוכים 6BAz היתרון שעודף פי ארבעה של streptavidin (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים חושפים את האינטרס הפיננסי המתחרה הבא: E.W. הוא ממציא של פטנטים קשורים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לקרסטין גלנסק על הכנת MTases M.BseCI ו-Set7/9 ומודים בהכרת תודה על המימון של יוזמת המצוינות של הממשלות הפדרליות והמדינתיות הגרמניות ואוניברסיטת RWTH אאכן. המחברים שמחים לספק 6BAz ו-SeAdoYn או אנלוגים אחרים של קופקטורים למחקר שיתופי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6BAzמסונתז על פי Weinhold et al., מספר פטנט US 8,129,106, פורסם ב-6 במרץ 2012.
β-MercaptoethanolServa28625
חומצה אצטיתFisher Scientific10304980
תמיסת אקרילאמיד/BIS, 37.5:1Serva10688
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100
אמוניום פרסולפט (APS)Serva13375
Bis-TrisGerbu1304
חומצה בוריתגרבו1115
ברומופנול כחול Na מלחServa15375
נחושת (II) סולפטAldrichC1297
כלורופורםפישר Scientific10020090
Coomassie Brilliant BlueServa17525
EDTA מלח דיסודיוםגרבו1034
אתנולMerck100983
GelRed (10,000x במים)ביוטיום41003
גליצרול (99.5%)Gerbu2006
FastRuler סולם DNA לטווח נמוךThermo ScientificSM1103
היסטון H3פלסמיד ביטוי שהתקבל מד"ר פיליפ וויגט ופרופ' דני ריינברג; ביטוי ובידוד על פי T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
פלסמיד ביטוי M.BseCIשהתקבל מד"ר מיכאל קוקינידיס; ביטוי ובידוד על פי Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
מתנולפישר סיינטיפיק10675112
מגנזיום כלוריד  הקסהידרטJ.T. Baker4003
MOPSGerbu1081
נתרןכלורי גרבו1112
רצועת pH (Neutralit)Merck1,095,330,001
pBR322Thermo ScientificSD0041
R.TaqI (10 u/µ l)Thermo ScientificER0671
SeAdoYnמסונתז על פי Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9ביטוי פלסמיד שהתקבל מפרופ' דני ריינברג, ביטוי ובידוד על פי ד. ריינברג ואחרים, Genes Dev.2002, 16, 479-489.
סטרפטווידיןגרבו3058
(+)-נתרן L-אסקורבטסיגמא מדעי החייםA7631
SDS גרבו גרגירי1833
די-נתרן מימן פוספטMerck106,586
TAMRA אזידמסונתז על פי הפניה 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x)Thermo ScientificB28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Acros Organics42058
Tris-HClGerbu1028
Tris-X (TRIS-base)Gerbu1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)Sigma-Aldrich762342

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
  2. Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
  3. Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
  4. Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
  5. Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
  6. Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
  7. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
  8. Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
  9. Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
  10. Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
  11. Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
  12. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
  13. Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
  14. Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
  15. Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
  16. Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
  17. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. , 8,129,106 (2012).
  18. Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
  19. Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
  20. Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
  21. Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
  22. Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
  23. Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
  24. Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
  25. Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
  26. Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
  27. Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
  28. Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
  29. Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
  30. Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
  31. Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
  32. Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
  33. Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
  34. Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
  35. Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
  36. Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
  37. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
  38. Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
  39. Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190(2013).
  40. Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
  41. Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
  42. Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
  43. Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
  44. Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Methyltransferase LabelingSequence specific DNA LabelingProtein Fluorescence LabelingAziridine Cofactor AnaloguesDouble activated AdoMet AnaloguesM BseCI DNA MethyltransferaseSet7 9 Histone MethyltransferaseSMILing DNA TechniquemTAG Enzymatic TransferClick Chemistry Labeling

Related Articles