תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

סיכום

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תקציר

פגיעה המוחית איסכמי היא בין המצבים השכיחים וההרסניים ביותר להתפשר תפקוד מוח תקין, ולעתים קרובות מובילה למתמידים ליקויים תפקודיים בחולים שנפגעו. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, עדיין אין אפשרות טיפול יעילה זמינה המפחיתה את פגיעה עצבית ומגנה על תאי עצב באזורי איסכמי ממוות שני מעוכב. מחקר בתחום זה בדרך כלל כרוך בשימוש במודלים של בעלי חיים מורכבים ובעייתיים. תרבויות הפרוסה organotypic Entorhino-היפוקמפוס תיגר עם חמצן וקיפוח גלוקוז (OGD) הוקמו במודלים חוץ גופית המחקים איסכמיה מוחית. ההיבט החדשני של מחקר זה הוא ששינויים של כלי דם במוח נלמדים בנוסף לשינויים עצביים ואת התגובה של שניהם תא העצבי וכלי דם התא ניתן להשוות ומתואם. השיטות שהוצגו בפרוטוקול זה באופן משמעותי להרחיב את היישומים הפוטנציאליים של אוגישת התרבות הפרוסה ganotypic. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. זאת בניגוד מוחלט לניסויים בבעלי החיים מסובכים ובעייתיים גרימת שבץ ואיסכמיה in vivo. על ידי הרחבת הניתוח לכולל את חקר התגובה של כלי הדם יכול לספק דרכים חדשות על איך לשמר ולשחזר תפקודי מוח. גישת התרבות הפרוסה המוצגת כאן עשויה להתפתח לכלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי ועשויה להיות שימושי לבדיקת אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection.

מבוא

מערכת העצבים המרכזית היא רגישה במיוחד לאובדן או הפחתה של חמצן ואספקת הגלוקוז על ידי מערכת כלי הדם. אפילו הפרעה קצרה ולא של אספקת דם למוח יכולה לגרום לאובדן קבוע של תפקוד של אזורי המוח הרלוונטיים מובילים לתסמונות שבץ טיפוסיות. בנוסף לאובדן העצבי באזורים שנפגעו העיקריים, יש בדרך כלל הוא אובדן עצבי המאוחר נוסף באמצעות נזק המשני. לרוע המזל עד עכשיו, אין טיפול נוירו להפחתת מוות עצבי המשני היה זמין ^1. מאמצי מחקר לחקר המנגנונים של נזק משני מסתמכים על השימוש במודלים של בעלי החיים של איסכמיה המוחית כמו עורקים התיכון ספיגה מוחין וטכניקות שונות טרומבוטיים חסימה (לסקירה האחרונה לראות ^2). במקביל, גם בשל מגבלות וחששות אתיים עם השימוש במודלים של בעלי חיים, התרבות הפרוסה organotypic של רקמות CNS השונות היה בשימוש המאפשר סטהdy של תגובות עצביות לסוג שונים של פציעות ^3-5.

ללימוד התגובה העצבית בתנאים המחקים פגיעה מוחית איסכמי, מערכת המודל של חסך גלוקוז החמצן (OGD) פותחה. במודל זה, תרבויות פרוסה באופן זמני נחשפו למדיום שחסר גלוקוז וכבר equilibrated עם גז חנקן בהיעדר החמצן. עם טיפול כזה, ניתן לגרום לפגיעה עצבית ואובדן שהוא די דומה לזה שנצפה לאחר פגיעת איסכמית in vivo ^{6, 7.} בהיפוקמפוס, טיפול כזה גורם לאיבוד עצבי במיוחד בCA1, אך לא ב אזור CA3 או gyrus המשונן של ההיפוקמפוס. בניגוד לכך, המחקר של תגובות של כלי דם בתרבויות פרוסה עד כה לא בוצע באופן נרחב. סיבה ברורה היא חוסר זרימת הדם וזלוף כלי דם במודל התרבות הפרוסה. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר כי ניתן לשמור בכלי lood במערכת העצבים המרכזית פורסים תרבויות במשך כמה ימים ^{8, 9.}

המטרה הכללית של שיטה זו היא לפקח לא רק את גורלם של תאי עצב לאחר OGD אבל להאריך את המחקר לגורל והשיפוץ של כלי הדם שהוא חלק חשוב מהתגובה לפציעה. עד כה מחקרים כאלה דורשים השימוש בניסויים בבעלי חיים (דה יונג et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). בפרוטוקול מובא כאן, אנו פירוט כיצד ניתן לעשות מחקרים כאלה בתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס תיגר גם עם היפוקסיה או על ידי נגעי הפעלת יתר רעילים ואחריו ניתוח של שתי תגובות הישרדות וכלי דם עצביות. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר שפורסם בעבר בנושא זה ¹⁰ ויכול להיות שימושי עבור כל מעבדה מתעניינת באינטראקציות עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית המועצה של 22 ספטמבר 2010 (2010/63 / איחוד אירופי) ונסקרו והתיר על ידי הרשויות שוויצרית.

.1 הגדרת תרבויות פרוסה Organotypic Entorhino-היפוקמפוס

1. הכן תרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס (EHOSCs) מגורי 4 עכבר היום (P4) לאחר לידה באמצעות ^4,11 שיטת הדגירה סטטי. כאן, להשתמש בעכברי C57BL6 וCB6F1.
   1. קח כ 30 דקות לכל גור עכבר להכנת תרבויות פרוסה, כלומר, 3 שעות להמלטה של 6 גורי עכבר. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים בזרימה שולחן עבודה מינרית עם מכשירי ניתוח עיקור.
   2. על מנת להימנע מהפרעות אפשריות מהעמדה של הפרוסה לאורך ציר septo-זמני, להשתמש רק בהיפוקמפוס פרוסות של חצי במחיצה. אם לא צוין אחרת, לבצע את כל הצעדים על RT.
2. חותך את tהוא בראש של גור עכבר P4 עם מספריים כירורגיות. אין הרדמה נדרשת לצעד זה.
   1. הסר את הגולגולת סביב המוח ולזהות את הסדק שבין סוף הזנב של אונות המוח והמוח התיכון. מוציא בזהירות את החלק ממקורי המוח אל המוח התיכון, מהגולגולת ולמקם אותו במדיום הכנה קר כקרח בהיקף של MEM השלים עם טופס התייצב של L-גלוטמין.
3. המשך לנתיחה תחת סטראו עם המוח להיות שקוע בבינוני הכנה קרה כקרח. הסר קרומי המוח שנותר מההמיספרות בקליפת המוח. זהה את ההיפוקמפוס במשטח הזנב המדיאלי של האונה ולהפריד אותו יחד עם קליפת entorhinal הסמוכה משאר המוח.
   1. העברת הרקמה לרקמת מסוק ולחתוך 400 מיקרומטר פרוסות עבות תחת רוחבי תנאי ספטית לציר septo-הזמני של ההיפוקמפוס.
4. מניחים את הפרוסות על ceהתרבות מוסיף ll (כ 6 פרוסות לכל הכנס) ו דגירתם ב6 צלחות גם עם 1 מ"ל לכל טוב של מדיום דגירה (47 מ"ל MEM, 25 מ"ל נשר בינוני, 25 מ"ל סרום סוס, 1 מ"ל Glutamax אני, 1 מ"ל של פתרון סטרילי 10% גלוקוז, pH 7.3) באווירת humidified עם 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס. לשנות את המדיום למחרת ולאחר מכן בכל יום אחר שלשבוע 1.

.2 במבחנה היפוקסיה והחמצן גלוקוז מניעת עם reperfusion

1. ראה טבלת מס '1 ללוח זמנים מדויקים של ההליך. EHOSCs תרבות במשך 5 ימים (DIV5) לפני החשיפה להיפוקסיה או OGD. בנקודה זו בזמן לעבור בינוני ממדיום דגירה המכיל 25% בסרום סוס סרום בינוני חינם עם ההרכב הבא: בינוני Neurobasal עם 2% תוסף B27, Glutamax 1% וגלוקוז 0.1% נוספים.
2. הכן את מדיום OGD כמפורט ב7 .the ריכוזים סופיים של רכיבי הפניה יהיה הבא: 0.3מ"מ CaCl _2, 70 mM NaCl, 5.25 מ"מ NaHCO _3, 70 מ"מ KCl, 1.25 סוכרוז מ"מ לאא ₂ PO _4, 2 מ"מ MgSO _4, ו10 מ"מ בpH 6.8. הוסף 1 מ"ל של מדיום OGD היטב כל אחד משני לוחות תרבית רקמה 6 היטב.
   1. Perfuse בינוני OGD עם N ₂ עבור שעה 1 בתא היפוקסיה ואז לאטום ולשמור O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש ברצועות אנאירובי כאינדיקטורים חוסר חמצן. קחו למשל את המדיום להיות חמצן חופשי כאשר את הצבע של הרצועות השתנה מורוד ללבן.
   3. לאינדוקציה של היפוקסיה, להשתמש בינוני סרום ללא עם גלוקוז במקום בינוני OGD. לפני השימוש, תנקב בינוני עם N ₂ בתא היפוקסיה, כמפורט לעיל למדיום OGD.
3. לפני פרוסות נחשפות לOGD, תנקב בינוני OGD שוב עם N ₂ למשך 30 דקות. הוסף 2 μl של 1 מ"ג / מ"ל ​​propidium יודיד (PI) פתרון לכל טוב (לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל) לפרוסות למשך 30 דקות ובחררק פרוסות בריאים לניסויים כפי שצוינו על ידי מספרים נמוכים של תאים חיוביים לצרכן.
4. השתמש בלוח הזמנים של חשיפת OGD וreperfusion מצויינים באיור 1. לשלול פרוסות או חמצן בלבד (היפוקסיה) או חמצן וגלוקוז (OGD) במשך 15 דקות.
   1. לאינדוקציה של היפוקסיה או OGD, להעביר פרוסות לתוך מדיום OGD ולשמור במשך 15 דקות בתא היפוקסיה. ודא שכל הנוזלים שנותרו בצדדים של להכניס אותם להישאף משם כאשר התרבויות עברו ממדיום רגיל עד בינוני OGD ובחזרה.
   2. לאחר היפוקסיה או OGD, להחליף את מדיום OGD עם מדיום סרום ללא מחומצן ותרבויות מותר להתאושש במשך 3, 24 או 48 שעות במדיום סרום ללא בחממה הרגילה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2. להוסיף PI שוב לפני קיבוע לקביעת המוות של תאים.

3 טיפולים תרופתיים של תרבויות Organotypic Slice Entorhino-היפוקמפוס

1. CulturEHOSCs דואר במשך 5 ימים (DIV5) במדיום דגירה לפני החשיפה לטיפולים תרופתיים. התחל טיפולים תרופתיים או במהלך OGD או מייד לאחר OGD כאשר פרוסות מועברות למדיום חופשי בסרום.
2. טיפולים להגנה מפני OGD.
   1. הוסף 100 מיקרומטר 6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-דיונה (CNQX) או tetrodotoxin 1 מיקרומטר (TTX) למדיום התרבות במהלך האינדוקציה OGD (ל15 דקות) או מייד אחרי גיוס OGD ל30 דקות. ואז, דגירה במדיום סרום ללא normoxic ל48 שעות לפני הקיבוע.
3. טיפולים לזירוז מות הפעלת יתר רעיל.
   1. לאחר 5 ימים בתרבויות מתג בינוני דגירה לסרום מדיום חופשי המכיל 100 מיקרומטר (RS) -α-אמינו-3-הידרוקסי 5-methyl-4-isoxazolepropionic חומצה (AMPA) למשך 30 דקות.
   2. הסר את מדיום התרבות המכיל AMPA על ידי שאיפה (דואג להסיר כל מדיום שיורית על מוסיף), ולאחר מכן להעביר את הפרוסות לצלחות טריות עם מדיום סרום נורמלי חופשי ולשמור אותם ל48 שעות עד קיבעון.

.4 תרבויות Organotypic Slice קיבוע וImmunostaining של Entorhino-היפוקמפוס

1. יודיד Propidium מכתים (PI).
   1. להוסיף PI ל30 דקות למדיום התרבות של פרוסות המתגוררות בריכוז של 2 מיקרוגרם / מ"ל. צפה תרבויות לחיות עם מיקרוסקופ הפוך מצויד באופטיקה הקרינה ובחר פרוסות לטיפולים נוספים. עבור מכתים PI בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, להוסיף פתרון PI 30 דקות לפני הקיבוע של התרבויות.
2. קיבוע של הפרוסות.
   1. הסר את מדיום התרבות מצלחת 6 היטב ולהוסיף 3 מ"ל של paraformaldehyde מוכן טרי 4% (PFA) זה טוב. לאחר מכן למקם את צלחת 6 היטב במקרר ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. הסר את פתרון PFA ביום שלמחרת ולשטוף את הפרוסות 3-4 פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
3. הסרת פרוסות מi תרבית תאיםnsert והליך חסימת אימונוהיסטוכימיה סעיפים ריחוף ללא.
   1. לנתק בזהירות ולהסיר את הפרוסות מהתרבות מוסיף באמצעות מברשת צבע אמנות של הגודל 0 או קטנים יותר. העבר את כל פרוסה בודדת לתוך באר של צלחת גם 96 מלאות בחסימת מאגר (PBS עם 3% בסרום נורמלי עז (NGS) ו -2% Triton-X100). שמור את הפרוסות במאגר החסימה לשעה 2 ב RT תחת תסיסה המתמדת של שייקר מסלולית.
4. Immunostaining של התרבויות הפרוסה
   1. לתיוג כלי דם להשתמש אנטי laminin polyclonal בדילול של 1: 200 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100.
   2. לנוירונים תיוג להשתמש אנטי microtubule הקשורים החלבון 2 (MAP2) בדילול של 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100.
   3. דגירה את הפרוסות עם נוגדנים ראשוניים ל48 שעות ב 4 ° C. עם תסיסה מתמדת. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף אותם בPBS עם 0.5% Triton-X100 ל3-4 פעמים.
   4. לדלל נוגדנים משני 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. דגירה את הפרוסות לשעה 2 ב RT בחושך עם הנוגדנים משני מצומדות fluorophore Alexa. השתמש נגד הארנב המתאים העז או נוגדנים משני עז אנטי עכבר מצומדת לAlexa 350 או 488.
   5. הסר את פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שנאגר מלוח טריס (TBS); לעלות אותם על שקופיות זכוכית וcoverslip השקופיות עם Mowiol.
5. מיקרוסקופית של פרוסות המוכתמות
6. צפה פרוסות המוכתמות או במיקרוסקופ רגיל עם ציוד epifluorescence או עם מיקרוסקופ confocal. קח תמונות עם מצלמה מתאימה. עבור חלק מתמונות, להפוך את ניגוד הקרינה כדי להניב כלי קדרות צבעוניים על רקע בהיר (איורים 5, 6).

.5 קביעת צפיפות כלי אזורית בתרבויות

1. לכמת את vesseצפיפות l מבוססת על מעברי כלי כפי שמתואר בעיון 8.
2. השתמש בפרוסות מוכתמות עבור laminin למדידות אלה. להרכיב תמונות מוקלטות של 10X הגדלה עם רשת 6 × 6, שבו כל רשת שווה לכל מ"ר 100 x 100 מיקרומטר, שדה כולל של 0.25 מ"מ ^2.
3. שלוש רשתות כיסוי כזה באזור CA1, CA3, DG, וEC (איור 2). לספור את כלי חוצים את הקווים של הרשת.
4. לקבלת תוצאות עם רלוונטיות סטטיסטיות טובות, לבצע מדידות בלפחות 3 ניסויים בלתי תלויים, כל נתוני, כולל מ3 גורי עכבר עם 3 פרוסות לגור עכבר.
5. לקבוע את הערך של מעברי כלי הממוצע מרשתות לכל אזור ולבצע ניתוח סטטיסטי על ידי ניתוח שונה עם תיקון Bonferroni כמבחן post hoc (p <0.05 המוגדרים משמעותי כ) באמצעות תוכנה הסטטיסטית מתאימה.

תוצאות

קיפוח גלוקוז חמצן וחוסר חמצן גורמים למוות עצבי וירידה של כלי דם באופן ספציפי באזור CA1 בהיפוקמפוס.
OGD או חמצן קיפוח לבד במשך 15 דקות מושרה אינדוקציה חזקה של מוות של תאים כפי שהם נראים על ידי מכתים יודיד propidium במיוחד באזור CA1 של ההיפוקמפוס (איור 3) הדומה כפי שתואר לעיל ^7. עם סמנים כדי להמחיש את הרשת של כלי דם, נמצא כי צפיפות כלי דם והארגון הופיעו דומה לשליטה אחרי אתגר OGD ברוב חלקי התרבות למעט אזור CA1. יש צפיפות כלי דם ירד ורשת כלי ד...

דיון

עם השיטות שהוצגו כאן, ניתן להשתמש בתרבויות פרוסה organotypic היפוקמפוס ככלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. בעוד תרבויות הפרוסה organotypic היו בשימוש בעבר ללימוד תגובות עצביות לאחר איסכמיה ^{6, 7} ההיבט החדש של המחקר בו זמני של שינויים בכלי הדם משפר באופן משמעותי את היישומים הפוטנציאליים של שיטה זו. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. יתר על כן, גישת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מינימום חיוני בינוני MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	צורה מיוצבת של L-גלוטמין
Millicell תרבית תאים מוסיף	Millipore	PICM03050
בסיס בינוני נשר	Gibco	41010-026
סרום סוסים	Gibco	26050-088
מדיום נוירובזאלי	Gibco	21103-049
תוסף B27	Gibco	17504-044
רצועות אנאירוביות	Sigma-Aldrich	59886
תמיסת יודיד פרופידיום	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R& D מערכות	0169-10
CNQX	R& D מערכות	0190/10
TTX	מו"פ D systems	1078/1
פוליקלונלי אנטי-למינין	Sigma-Aldrich	L9393
אנטי-MAP2	Abcam	ab11267
אלקסה אנטי עכבר 350	בדיקות מולקולריות	A11045
אלקסה אנטי עכבר 488	בדיקות מולקולריות	A11001
אלקסה אנטי ארנב 350	בדיקות מולקולריות	A11046
אלקסה אנטי ארנב 488	בדיקות מולקולריות	A11008
תוכנת סטטיסטיקה	תוכנת GraphPad	GraphPad פריזמה
קוצץ רקמות McIlwain	טד פלה	10180
תא היפוקסיה	Billups-Rothenberg	MIC-101