מאמר שיטה

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר

DOI:

10.3791/52032

⸱

28 בינואר 2015

 , 
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כולל נהלים מפורטים לבידוד תאים שמקורם בשתן מחולי ניוון שרירים; תכנות מחדש יעיל ומהיר שלהם באמצעות התמרת נגיף סנדאי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cardiomyopathy dystrophic הוא תוצאה הבינה היטב של ניוון שרירים. יצירת תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מחולים עם מחלת ניוון שרירים היא מקור רב ערך לסלולרי במבחנה מערכות מודל מחלה ויכולה לשמש למחקרי הקרנת סמים. תאי שמקורם בחולה שתן כבר בשימוש בתכנות מחדש מוצלח בתאי גזע pluripotent מושרה במטרה לבנות מודל cardiomyopathy dystrophic 1. בהתייחסו לחששות הבטיחות של שילוב מערכות וקטור, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות וקטור וירוס שאינו שילוב סנדאי לתמרה של יאמאנאקה גורמים לתאי שתן שנאספו מחולים עם מחלת ניוון שרירים. פרוטוקול זה יוצר לתכנות מחדש באופן מלא שיבוטים תוך 2-3 שבועות. תאי pluripotent הם נטול וקטור על ידי מעבר-13. יכול להיות מובחן iPSCs dystrophic אלה לתוך שריר לב ומשמש גם ללמוד מנגנוני מחלה או להקרנת סמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיופתיה היא הסיבה המובילה השניה למוות בחולים עם מחלת ניוון שרירים דושן והבקר (MD). למרות שמוטציות בגן דיסטרופין צמוד X להתרחש ב 1: 3,500 לידות של זכרים, מעט מאוד ידוע על האירועים המולקולריים ותאיים שמוביל לנזק לשרירי לב מתקדם. תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה נגזרים מחולי ניוון שרירים צמחו ככלי רומן כדי לחקור את מנגנוני מחלה הבסיסיים ולהשתמש בסמים להקרנת 1,2.

אי הנוחות הצפויה של ביופסיות עור או דגימות דם עלול להניא חולים צעירים ו / או האפוטרופוסים שלהם לתת את ההסכמה להשתתפות במחקר. דגימות שתן הן מקור בלתי פולשנית של תאים סומטיים שamendable לשיטות תכנות מחדש. הראינו לאחרונה כי תאי שתן שנאספו מחולי ניוון שרירים יכולים להיות מתורבתים וביעילות לתכנות מחדש לiPSCs באמצעות התמרה retroviral עם גורמי יאמאנאקה (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc; OSKM) 1. החסרון של מסירת גן retroviral הוא שילוב של גני תכנות מחדש לכרומוזומים המארח האקראי. כדי להתגבר על מגבלה זו, השתמשנו וירוס סנדאי הלא שילוב לתכנות מחדש של תאי שתן.

פרוטוקול זה מפרט את תכנות מחדש של תאי וירוס סנדאי שתן מבודדים מחולי ניוון שרירים אז מה שיכול להיות מובחן לתוך שריר לב או סוגי תאים אחרים למחקר נוסף. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם למחלות ספציפיות מטופל אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: חולים ו / או האפוטרופוסים שלהם צריכים לתת הסכמה מדעת להשתתפות במועצה לביקורת מוסדית אישרו מחקר.

1. חוצצים והכנות מדיה

  1. חיץ כביסה: כדי להכין של חיץ כביסה 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של עט 100x / פתרון סטרפטוקוקוס (100 U / ml פניצילין + 100 / מיליליטר מיקרוגרם של סטרפטומיצין) 99 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט חיץ (PBS).
  2. תא אב שתן בינוני (UPC): כדי להכין מדיום UPC, לערבב כמויות שווה של תא בינוני keratinocyte סרום חינם (KSF) בינוני + אב.
    1. KSF בינוני: כדי להכין מדיום keratinocyte, להוסיף 5 / מיליליטר ng של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 50 / מיליליטר ng של תמצית בלוטת יותרת המוח שור (BPE), 30 / מיליליטר ng של רעלן הכולרה, ופתרון העט / סטרפטוקוקוס (100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) ל 500 מיליליטר בינוני KSF.
    2. תא אב בינוני: להוסיף שלושה רבעים של DMEM עם רבע מתקשורת Ham-F12 ולהשלים עם 10% FBS, 0.4 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 0.1רעלן הכולרה ננומטר, 5 ng / ml אינסולין, 1.8 x 10 -4 אדנין M, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 2 x 10 thyronine M triiodo, 10 ng / ml EGF, והעט / סטרפטוקוקוס פתרון -9.
  3. הס בינוני: הוסף 20% החלפת KO-סרום (K-SR), חומצות אמינו לא חיוניות 1x ממ, l-גלוטמין 2 מ"מ, β-mercaptoethanol 100 מיקרומטר, 20 ng / ml bFGF ועט / סטרפטוקוקוס 400 מיליליטר DMEM / בינוני F12.

אוסף דוגמאות 2. שתן

  1. להורות לחולים לשתות נוזלים 30 דקות לפני איסוף שתן על מנת להבטיח כי כמות מספקת (~ 30-40 מיליליטר) של שתן יכולה להיות שנאספו.
  2. תן חולים ו / או האפוטרופוסים שלהם ערכת איסוף שתן המכילה את הפריטים הבאים: (1) הוראות בכתב על איך להשיג דגימת שתן לתפוס סטרילי או נקייה, (2) toilettes אנטי בקטריאלי הלח, ו- (3) 100 מיליליטר סטרילי כוס אוסף דגימה. להורות חולים כדי לאסוף דגימה.
  3. מייד למקם את דגימות שתן על קרח ולהעביר לlaboraטורים בצידנית. לעבד את השתן לבידוד תא באופן מיידי. אם עיכוב הוא בלתי נמנע, לאחסן את הדגימה על קרח במשך שעה עד 4 עם הפסד מינימאלי של כדאיות תא.

3. בידוד והרחבת תאים שתן

הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט.

  1. שימוש בטפטפות סטרילי, דגימות שתן להעברת סטרילי צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל. צנטריפוגה בg × 400 במשך 10 דקות ב RT.
  2. לשאוב supernatant עוזב 1 מיליליטר בצינור; להיזהר לא להפריע תא גלולה.
  3. Resuspend ולשלב את כדורים מצינורות מרובים לתוך 7 מיליליטר של חיץ כביסה וחזור צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב RT.
  4. בזהירות לשאוב supernatant, עוזב את התא גלולה ו~ 0.2-0.5 מיליליטר של supernatant. Resuspend ב 2-3 מיליליטר של תא אב שתן בינוני (UPC) ולהעביר את ההשעיה ל4-6 בארות של האו"םצלחת 24 מצופה היטב.
  5. לאחר 72 שעות, להשלים את התרבות עם 0.5 מיליליטר של מדיום UPC טרי בכל טוב ולשנות בינוני כל 2-3 ימים לאחר. אריתרוציטים ותאי קשקש שלא לצרף הצלחת יוסרו עם השינויים בינוניים.
  6. צג התרבות לאחר 4-6 ימים.
    הערה: מושבות תאים קטנות 2-4 יתחילו להופיע. תאים יעוגלו או מאורכים המייצגים סוג I או II סוג של האפיתל כליות (RE) תאי בהתאמה 3.
  7. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים מאז פעם התאים מופיעים, הם יעברו שלב התרחבות מהיר.
  8. ברגע שהתאים מגיעים 80-90 מפגש%, סביב 9-15 ימים לאחר ציפוי, לנתק והמעבר התאים (15,000-18,000 תאים / 2 סנטימטר) על 2-4 בארות של 24 צלחת גם להתרחבות נוספת. מסמן זאת כתא מעבר 1 (P1).
  9. לאפיין תאי שתן למפרטי שושלת באמצעות ניתוח התזרים cytometric, immunohistochemצביעת iCal או באמצעות תגובת שרשרת transcriptase-פולימראז הפוכה (RT-PCR).
  10. לתכנת מחדש תאי שתן מבודדים (סעיף 4) או להקפיא אותם בהקפאה בינונית (DMEM בתוספת סרום 10% ו -10% DMSO) לcryostorage לטווח ארוך.

תכנות מחדש Cell 4. תנו שימוש וירוס סנדאי

הערה: הטיפול הנכון והשימוש בPPE (ציוד מגן אישי) מומלצת בעוד מניפולציה סוכני transfecting. בצע את השלבים בתנאים סטריליים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט הבא. הסילוק נאות של transfecting תאי סוכן ו / או transfected מומלץ להימנע מסיכון של סכנות בריאותיות וסביבתיות. לתכנות מחדש של תאי שתן, להשתמש סנדאי תכנות מחדש קיט עם שינויים לפרוטוקול המזין תלוי של היצרן כפי שיפורט להלן.

  1. כדי להבטיח תכנות מחדש יעילות גבוהה באמצעות וירוס סנדאי, שימוש קטעים 1-5 תאי שתן שמהיריםly החלוקה. אם התאים לא לשכפל היטב או להיות senescent, להשליך אותם כפי שהם לא לתכנת מחדש את יעילות.
  2. זרע 60,000 תאים לכל גם בשתי בארות של צלחת 6 היטב. מארק זה כמו יום -2. התאם צפיפות זריעת תאים (5 x 4-9 אוקטובר x 10 4 תאים לכל טוב) לפי צורך כדי להגיע 80-90% על ידי מפגש יום 0.
  3. ביום 0 (48 שעות לאחר ציפוי התאים), להכין את וקטורי סנדאי תכנות מחדש (sev) המכילים כל אחד מגורמי OSKM ארבעה. להוסיף כל אחד מהווקטורים עד 1 מיליליטר של מדיום UPC מחומם מראש. השתמש במשרד פנים של 1-1.5 (5-7.5 x 10 5 CIU), אשר הוא מספק לתאי שתן תכנות מחדש. לשאוב הבינוני ומוסיף באיטיות 1 מיליליטר UPC + sev לטוב אחד תאי השתן. השתמש גם השני כשליטת התמרה שלילית.
  4. ביום 1, להחליף את מדיום UPC + sev עם מדיום UPC טרי. מוות של תאים מסוימים נתפס לאחר 24 שעות בשל cytotoxicity ויראלי.
  5. בהתאם ליעילות של תכנות מחדש clonתצורות דואר והמורפולוגיה הקומפקטית, לשמור על שינוי הבינוני מדי יום עד שהיום 6 או 7.
  6. יום אחד לפני הניתוק של תאי transduced (יום 5 או 6), להכין צלחות מזין MEF ידי ציפוי mitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 3 שעות) שטופל MEFs בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר, על 0.1 ג'לטין% מצופה 100 מנות מ"מ 2 תרבות.
  7. למחרת (יום 6 או 7), לנתק את התאים עם טריפסין 0.25%, resuspend התאים במדיום UPC וצלחת 5 x 10 4 - צלחת מזין 2 x 10 5 תאים / 100 מ"מ 2 MEF.
  8. למחרת, לעבור למדיום הס ולשנות את המדיום בכל יום. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ כדי לפקח על תאים הפכו.
    הערה: התאים ליצור אגרגטים משובטים עם מורפולוגיה אופיינית מרוצפת ויש להם גרעין גבוה יחס cytoplasmic (לאחר התמרה 12-18 ימים).
  9. בתוך שבועות עד שלושה שבועות לאחר התמרה, לאסוף מושבות ולהעביר לצלחות חדשות לclonהרחבת אל.
  10. לבצע מכתים תא חי לבחירת השיבוטים iPSC ידי דוגרים תאים עם TRA-1-81 נוגדן עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור ואחריו מכתים דלפק עם נוגדנים משני מצומדות צבע ניאון ספציפי עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור.
  11. שימוש במחט אינץ 'G ½ 1 26 לצלב-לבקוע TRA-1-81 שיבוטים גדולים יותר החיוביים iPSC לחתיכות בגודל שווה קטנות (4-6 חתיכות לשיבוט).
  12. השתמש פיפטה טיפ סטרילי כדי לאסוף ולהעביר 10-20 חתיכות צלב בקע משיבוטים מרובים לבאר כל Matrigel (10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) -coated 24 צלחת היטב עם מדיום הס.
    הערה: פיסות משיבוט אחד מצופה בנפרד לתוך באר אחד לא להרחיב או לשמור על pluripotency.
  13. לשנות מהס עד בינוני iPSC 24-48 שעות לאחר השיבוטים לתכנות מחדש מחוברים אל פני השטח Matrigel.
  14. במהלך תחזוקה על צלחות Matrigel מצופה, ידני scraPE-את כל תאים מובחנים או תאים מזינים MEF לזהם בעזרת פיפטה טיפ להעשיר לשיבוטי dystrophic לתכנות מחדש וpluripotent מלא iPSC (MD-iPSC).
  15. לאחר שיבוטים בודדים שהגיעו לגודל מיקרומטר ~ 100, להרחיב את השיבוטים על ידי מתנער עם 0.48 mM EDTA (חומצת ethylenediaminetetraacetic) פתרון במשך 3 דקות וציפוי אגרגטים תא קטנים של MD-iPSCs התלוי במדיום iPSC (בתוספת 5 מיקרומטר Y27632, Rho קינאז מעכב ) על matrigel הטרי (10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) מצופה 12 צלחת גם. שנה בינונית iPSC יומי.
  16. תכנות מחדש מלא של כל שיבוט יכול להיקבע על ידי שני ניתוח ביטוי גנים של גני OSKM ומכתים immunohistochemical של סמני pluripotency (Oct3 / 4 וTRA-1-81). הערכה קפדני של פוטנציאל pluripotency צריך להיות מועסק כדי לאשר קווי iPSC לתכנות מחדש באופן מלא יכולים להתמיין לשלוש שכבות נבט. זה יכול להיות מושלם גם על ידי גוף embryoid assay (EB) היווצרות והבידול או terassay היווצרות Atoma.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב התאים המבודדים משתן אנושי הם חיוביים לסמני אב וpericyte uroepithelial כגון CD44, CD73, וCD146 (97.37%, 97.09%, ו97.3% בהתאמה; איור 1 א ו -1 B). תאים אלה באו לידי ביטוי גם סמני mesenchymal אחרים כגון אקטין אלפא-שריר החלק וvimentin (איור 1). ניתוח RT-PCR נותן עדות לאוכלוסייה מעורבת של תאים בתרביות שביש ביטוי חלש של cytokeratin-7 (CK-7) וUroplakin (UP) -Ia & -IIIa, סמנים של שושלת uroepithelial (איור 1 ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמנות מחלות לב וכלי דם באמצעות iPSCs הופכת גישה נפוצה להבין את התרומה הגנטית 4-6. כמה קשיים בלתי צפויים של קבלת דגימות תאים מחולים, ילדים צעירים במיוחד, יכולים להימנע על ידי המציע את האפשרות של גישה לא פולשנית כגון איסוף שתן. באוכלוסיית חולים הצעירה הזה, הוא לעתים קרובות קשה לאסוף נפח השתן מספיק כדי להניב מספיק תאי שתן לתכנות מחדש. אימון החולים הצעירים לשתות נוזלים 30 דקות לפני האיסוף שתן משפר את ההצלחה של בידוד תא שתן. עם זאת, אוספי שתן חוזרים ייתכן שיהיו צורך באוכלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי קידום ויסקונסין בריאה יותר והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, המכונים הלאומיים לבריאות, באמצעות מענק מספר 8UL1TR000055. תוכנו הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
4 אונקיות כוס דגימה עם מכסהSTL אספקה רפואיתM9AMSAS340לאיסוף דגימות שתן
15 מ"ל צינורות BD-Falconפישר סיינטיפיק352097
50 מ"ל צינורות BD-Falconפישר סיינטיפיק352098
כיסויי זכוכית עגוליםפישר סיינטיפיק12-545-81
ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS SendaiLife TechnologiesA1378-001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023
Pen-Strep עם גלוטמין Life Technologies15140-122חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
תוסף B-27 עם אינסולין (50x)Life Technologies17504-044חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
תוסף B-27 עם אינסולין (50x)Life Technologies0050129SAחם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
DMEM/F12 (1:1)Life Technologies11330-032חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
Versene, 1:5,000Life Technologies15040066חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
bFGF (10 ומיקרו; ז)Life Technologies13256-029חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
מחסניות Cell Counter CartridgesLife TechnologiesC10228
סרום נוקאאוט (500  בקבוק מ"ל)Life Technologies10828-028חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
תרבית תאי התאוששות הקפאהחיים בינוניים12648-010
Keratinocyte-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
DMEM, גלוקוז גבוה, GlutamaxLife Technologies10566-016חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
תערובת התזונה F-12 של Ham Life Technologies11765-054חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
חלבון אנושי רקומביננטי EGF, Liquid FormLife TechnologiesPHG0311Lחם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
אינסולין, רקומביננט אנושי, אבץ SolnLife Technologies12585-014חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
TeSR-E8טכנולוגיות תאי גזע5940חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
מעכב ROCK (Y-27632)SelleckS1049חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
MatrigelBD Biosciences354277מטריצה מוסמכת hESC, ערכת מיני RNeasy ללא LVED
 Qiagen74104
iScript cDNA ערכת סינתזהBio-Rad170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo-ScientificK1081
מוסמךFBS סיגמא אולדריץ'F6178חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
Adenine BioreagentSigma AldrichA2786-5Gחם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
רעלן כולרה מ-Vibrio choleraeSigma AldrichC8052-.5MGחם ב-37 מעלות ו-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
הידרוקורטיזוןסיגמא אולדריץ'H0888-1Gחם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
הולו-טרנספרין מאדםסיגמא אולדריץ'T0665-50MGחם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
3,3',5-Triiodo-L-thyronine מלח נתרןסיגמא אולדריץT6397-100MGחם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
DAPI Santa Cruz BiotechnologySC-3598
Fluoromount Aquous הרכבה בינוניתSigma AldrichF4680
16% ParaformaldehydeAlfa-Aesar43368
<חזק>נוגדנים
עכבר אנטי CD44 - מסומן ב-FITC BD Biosciences560977
Mouse anti CD146 - מסומן ב-PEBD Biosciences561013
Mouse anti CD73 - מסומן ב-PEBD Biosciences561014
Mouse anti-α-Smooth Muscle actinSigma AldrichA2547
Mouse anti-VimentinAbcamab8978-100
Mouse Anti - TRA-1-81Life Technologies411100
ארנב אנטי אוק 3/4סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-9081
עכבר נגד דיסטרופיןLeicaBiosystems NCL-DYSB
טכנולוגיות '

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
  2. Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
  3. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  6. Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
  7. Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
  8. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  9. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
  10. Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
  11. González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
  12. Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RT PCR

מאמרים קשורים