הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

10.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52042

⸱

12 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

תקציר

אנו מדווחים כאן על פרוטוקול חזק ויעיל לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים לאחר הזרקת mRNA לביציות לא מופרות של אמפיוקסוס הצפלוכורדיט, Branchiostoma lanceolatum. אנו משתמשים במבנים עבור mCherry ו-eGFP ממוקדים ממברנה וגרעין ששונו כדי להתאים לשימוש בקודון אמפיוקסוס ורצפי קונצנזוס של קוזאק. אנו מתארים את סוג מחטי ההזרקה שיש להשתמש בהן, את פרוטוקול הקיבוע של הביציות הלא מופרות ואת מערך ההזרקה הכולל. טכניקה זו מייצרת עוברים בעלי תווית פלואורסצנטית, בהם ניתן לנתח את הדינמיקה של התנהגויות התאים במהלך ההתפתחות המוקדמת באמצעות אסטרטגיות הדמיה העדכניות ביותר in vivo. פיתוח טכניקת מיקרו-הזרקה במין אמפיוקסוס זה יאפשר ניתוחי הדמיה חיים של התנהגויות תאים בעובר כמו גם מניפולציות ספציפיות לגנים, כולל ביטוי יתר של גנים ונוקדאון. בסך הכל, פרוטוקול זה יגבש עוד יותר את אמפיוקסוס האקורדיט הבסיסי כמודל של בעלי חיים לטיפול בשאלות הקשורות למנגנוני ההתפתחות העוברית, וחשוב מכך, להתפתחותם.

מבוא

במהלך פיתוח, תא בודד מוליד כל אורגניזם בתהליך מורכב ביותר שיש בו שני חלוקות תא ותנועות. כדי להבין טוב יותר את העקרונות הביולוגיים העומדים בבסיס הדינמיקה של התנהגות תא, ביולוגים התפתחותיים החלו להשתמש בטכניקות ההדמיה vivo הקרינה מבוססת. תאים מסוימים של תאים, כגון קרום תא, יכולים גם להיות שכותרתו על ידי טיפולים עם צבעי ניאון, גישה הקשתה על ידי חוסר הייחוד ושל חדירת רקמת 1, או על ידי ההקדמה הספציפית לעובר של mRNAs אקסוגניים קידוד חלבוני ניאון 2. טכניקות שונות יכולות לשמש לאספקה ​​היעילה של תרכובות חיצוניות, כגון mRNAs. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל, microinjection, electroporation, הפצצה עם microparticles, lipofection ותמרת 3,4. למרות שכל הגישות הללו יכולים לשמש כדי להציג את התרכובות אקסוגניים לפיתוח עובר, רק microinjection מאפשר היישום של כמויות מוגדרות מראש ומדויקות לכל תא 3. טכניקות Microinjection תוארו עבור כל מערכות המודל ההתפתחותי הגדולות 4 (לדוגמא, זבובי פירות, נמטודות, דג הזברה, צפרדעים, עכברים), כמו גם לכמה מודלים חלופיים 4, כוללים אלה המשמשים למחקרים השוואתיים שמטרתו להבין את האבולוציה של מנגנוני התפתחות (למשל, שושנות ים, תולעי תולעים טבעתיים, קיפודי ים, tunicates ascidian, amphioxus מיתרני הראש).

Cephalochordates, אשר יחד עם tunicates ובעלי חוליות להקים מַעֲרָכָה chordate, במיוחד דגמים מתאימים היטב לחקר האבולוציה של chordates והגיוון של בעלי חוליות מאב קדמון חסר חוליות 5-8. שושלת מיתרני הראש התפצלה בשלב מוקדם מאוד במהלך האבולוציה chordate; וcephalochordates הקיים, אשר מחולקים לשלושה genera (Branchiostoma, Asymmetron וEpigonichthys), דומה לבעלי חוליות הן מבחינת האנטומיה כוללת ואדריכלות הגנום 5-8. של המינים על 30 של cephalochordates שתוארו עד כה, חמש זמינים למחקרים עובריים והתפתחותיים 6,9: lucayanum Asymmetron (אִזְמֵלוֹן בהאמה), מיתרני ראש הדגלונים (amphioxus פלורידה), lanceolatum מיתרני הראש (amphioxus האירופי), מיתרני הראש belcheri (amphioxus הסיני) ומיתרני הראש ג'אפוניכאם (amphioxus היפני). מבוגרים הבשלים של שלושה ממינים אלו (lanceolatum ב ', ב' ו- B. belcheri ג'אפוניכאם) יכולים להיגרם ללהשריץ על פי דרישה בעונת הרבייה 10,11. בנוסף, לפחות עבור B. lanceolatum, השרצה יעילה יכולה גם להיגרם במי ים מלאכותיים 12, ובכך הופכת את מיני מיתרני ראש מסוימים הזה נגיש לLaboratories שאין להם גישה למי ים טבעי. שילוב, בB. lanceolatum, של גישה נוחה ואמינה לעוברים עם שיטת אספקה ​​יעילה, כגון microinjection, עד כה טכניקת המשלוח בלבד שפותחה בamphioxus (בשני B. דגלונים וB. belcheri) 13-15, תאפשר הפיתוח של חבילת רומן של טכניקות מניפולטיביות, כולל tracing- שושלת וגישות המבוססת על התנהגות תא דינמי.

פרוטוקול לmicroinjection יעיל של mRNAs לבטא חלבוני ניאון בB. עובר lanceolatum פותח ומכאן. יתר על כן, כדי לספק ערכת כלים בסיסיות להדמית חיה של B. עוברי lanceolatum, מערכות וקטור פותחו המאפשרות קרום הקשורים וביטוי גרעיני של חלבוני ניאון. למיקוד קרום, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) התמזג לתיבה האנושית HRAS CAAX ולוקליזציה גרעינית של mCherry וeGFP היהמתקבל על ידי היתוך לאקסון 2B היסטון דג הזברה (H2B) (איור 1, קובץ משלים 1). יתר על כן, במטרה לייעל את תרגום חלבון, הרצפים וקודונים קוזאק של המבנים שונו והותאמו לשימוש בB. lanceolatum. יחדיו, וקטורי שיטת ההזרקה וביטוי שהוצגו כאן ישמשו כבסיס לדור של גישות ניסיוניות החדשות לcephalochordates, בעיקר ניתוחים באמצעות מבוססת הקרינה האחרונה בטכניקות ההדמיה vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה של מכשירים וריאגנטים

  1. העבר את טפטפות פסטר
    1. צור סדרה של טפטפות פסטר העברה בקטרים ​​קצה שונים על ידי משיכת pipettes פסטר הארוך 230 מ"מ מעל להבה במהירויות שונות. ודא שלהתחדד ארוך ככל האפשר לשליטה חלקה ויפה של שאיפה.
    2. עם סופר יהלומים, לשרוט את פיפטה לאורך קו ניצבת לאורכו של פיפטה. בשתי הידיים, למשוך מקביל פיפטה לאורכו כדי ליצור חתך בוטה. במהירות להבה-פולני פיפטה ללא הדבקת הקצה.
    3. משתנה הקוטר של הקצה עם השלב של ביציות / עובר להיות pipetted: 300-400 מיקרומטר לביציות מופרה (150 מיקרומטר בקוטר סביב), 600 מיקרומטר לביצים מופרות (כ -500 מיקרומטר קוטר), 200-400 מיקרומטר לneurulae בקע. טפטפות שימוש עם צינור שאיפה-פיקוח פה להעביר ביציות / עובר מצלחת אחתלמשנהו.
  2. מחטי הזרקה
    1. מניפולציות נימים עם כפפות כדי להבטיח תנאי RNase ללא. השתמש בזכוכית בורוסיליקט עם נימי להט עם ממדים של 1.20 מ"מ OD, 0.94 מ"מ ID, אורך 10 מ"מ.
    2. אם נימים נמשכות לסוג של חולץ מחט חימום חוט להט שתואר ברשימת חומרים, להשתמש בהגדרות הבאות: חום 600, משוך 50, 80 Velocity, זמן 60, לחץ 200 או 300. אחרת, להבטיח כי את הצורה, שהוא חיוני לזריקות מוצלחות, הוא, כפי שמוצג באיור 2 עם התכונות הבאות: קוטר קצה חיצוני 4-8 מיקרומטר, באורך 2 סנטימטר להתחדד.
      הערה: ניתן למשוך מחטים לפני עונת הרבייה ומשמשות לאורך כל העונה.
  3. 5% מניות פתרון פנול אדומים (4x)
    1. הכן טרי לפני כל עונת השרצה.
    2. בתוך צינור מיקרומטר סינון 0.22, שוקל את 25 מ"ג של אבקה אדומה פנול.
    3. הוסף 0.5 מיליליטר של המים DNase- וRNase ללא להצינור המכיל את האבקה.
    4. ספין במשך 3-5 דקות ב18,000 XG בטמפרטורת חדר כדי לסנן-לעקר את הפתרון ולהסיר גבישים שיכולים להדביק את מחט הזריקה.
    5. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או לאחסן 250 aliquots μl ב -20 ° C.
  4. 0.25 מ"ג פתרון poly ליזין / ml
    1. הכן טרי לפני כל עונת השרצה.
    2. ממיסים 5 מ"ג poly-L ליזין ב 20 מיליליטר מים מזוקקים. חנות 5 aliquots מיליליטר ב -20 ° C.
    3. השתמש aliquot הפשרה מייד ורק פעם אחת כדי להבטיח הדבקה לשחזור וחזקה של הביציות לצלחת פולי-ליזין מצופה.
  5. סינתזת mRNA
    1. הכן טרי לפני כל עונת השרצה.
    2. Linearize 5 מיקרוגרם של ה- DNA של עניין עם האנזים המתאים (בדרך כלל לשעה 2, על 37 מעלות צלזיוס). כדי לבדוק את השלמות של מערכת העיכול, המנוהל על 2% בנפח של תערובת העיכול על 1% ג'ל agarose-TBE במאגר TBE ב 150 W במשך 20 דקות.
    3. חלץ את lineaDNA rized עם 25: 24: פנול 1 (pH 8.0): כלורופורם: אלכוהול isoamyl. וורטקס במשך 20 שניות, צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את המימי שלב (העליון).
    4. לחלץ את השלב המימי שוב עם 24: כלורופורם 1: isoamyl אלכוהול. וורטקס במשך 20 שניות, צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את השלב המימי.
    5. להאיץ את ה- DNA לינארית עם 100: 10: 300 DNA לינארית: 3 M נתרן אצטט (pH 5.2): 100% אתנול הלילה ב -20 ° C.
    6. 20 דקות צנטריפוגה ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף באתנול 70%.
    7. צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בואו ביבש וגלולה במים RNase ללא ריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / μl.
    8. לתמלל 1 מיקרוגרם של ה- DNA לינארית באמצעות ערכת סינתזת mRNA עם פולימראז המתאים, על פי הוראות יצרן.
    9. חלץ את ה- mRNA עם 5: 1 פנול (pH 4.7): להפסיק פתרון כלורופורם ואמוניום אצטט מצורף לערכה.
    10. וורטקס במשך 20 שניות, centrifuge 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את השלב המימי.
    11. לחלץ את השלב המימי שוב עם 24: כלורופורם 1: isoamyl אלכוהול. וורטקס במשך 20 שניות, צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ולאסוף את השלב המימי.
    12. לזרז את mRNA עם isopropanol 100% הלילה ב -20 ° C.
    13. 20 דקות צנטריפוגה ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף באתנול 80%.
    14. צנטריפוגה 10 דקות ב 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בואו היבש גלולה בטמפרטורת חדר למשך לא יותר מ 5-10 דקות כפי שלאחר מכן ניתן יהיה קשה resuspend. Resuspend בDNase- ומים RNase ללא לריכוז סופי של לפחות 2 מיקרוגרם / μl כדי להבטיח ריכוז mRNA סופי הגון בתמהיל ההזרקה.
    15. כדי לבדוק את האיכות וגודל של מוצר השעתוק, לרוץ 0.5 μl של mRNA על 1% ג'ל agarose-TBE RNase ללא במאגר TBE ב 150 W במשך 20 דקות. חנות 2 aliquots μl ב -80 ° C.
  6. מנות פולי-ליזין מצופה
    הערה: תעודת מקוריות פולי-ליזיןמנות טד משמשות כדי לשתק את הביציות במהלך הזרקה.
    1. לכל מנה 35 מ"מ תא-תרבות פטרי (5 בסך הכל), לכסות את החלק התחתון של צלחת פטרי עם 1 מיליליטר של 0.25 מ"ג פתרון poly ליזין המופשר / מיליליטר. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
    2. לכל מנה 35 מ"מ תא-תרבות פטרי (5 בסך הכל), להעביר 0.25 מ"ג פתרון poly ליזין מיליליטר / לעוד צלחת פטרי תרבית תאי 35 מ"מ. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
    3. מחק את פתרון poly ליזין 0.25 מ"ג / מיליליטר.
    4. בואו צלחות פטרי הפוכות יבשות, בטמפרטורת חדר למשך שעה 2.
    5. אחסן את הכלים מצופים פולי-ליזין-עטופים בניילון נצמד על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע זיהום למקסימום שבוע אחד.
  7. מנות מצופים agarose
    הערה: הם משמשים לעוברי תרבות מוזרקת. Agarose מספק כרית לעוברים המוזרקים ומונע מהם להידבק לתחתית הצלחת.
    1. הפוך מי ים מלאכותי (ASW) באמצעות 37-38 גר '/ comm Lמלחי ercial + 0.25 מ"מ NaHCO 3 במי אוסמוזה הפוכים.
    2. לפזר agarose לריכוז של 1% ב0.22 ASW מיקרומטר מסונן-ידי חימום במיקרוגל הפתרון.
    3. במהירות לשפוך את פתרון agarose החם מצלחת פטרי אחד 35 מ"מ לעוד אחד כדי להבטיח ציפוי agarose דק מאוד של המנה.
    4. אחסן את הכלים מצופים agarose הוא עטופים בניילון על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע זיהום למקסימום שבוע אחד.
  8. תמהיל הזרקה וטעינה של מחטי ההזרקה
    1. כ -2 שעות לפני שמתחיל זריקות, לעשות תערובת 2 μl הזרקה בRNase- וללא מים DNase עם ריכוזים סופיים של 1-1.8 מיקרוגרם / μl של mRNA, גליצרול 15%, 1.25% פנול אדומים.
      הערה: צבעי פנול האדום הפתרון, המאפשר ניטור של יעילות ההזרקה וזיהוי של עוברים הוחדרו בהצלחה. גליצרול מעדיף דיפוזיה mRNA בתוך הביצית.
    2. צנטריפוגה 4 דקות ב 18,000 XG לגבישי גלולה. שמור על קרח עד לשימוש.
    3. עם טפטפת 10 μl, לאסוף 0.5 μl של תמהיל ההזרקה, הימנעות החלק התחתון של הצינור, שבו הגבישים כבר pelleted.
    4. למילוי לפחות שתי מחטי הזרקה (במקרה אחד הפסקות במהלך ההזרקה) על ידי pipetting הירידה של 0.5 μl של תמהיל הזרקה בפתיחה הגדולה של המחט.
    5. התקן את המחטים בצנצנת אחסון עם נוזל בתחתית ב 4 ° C על מנת למנוע אידוי של תמהיל ההזרקה. בואו תמהיל ההזרקה לנסוע לאט לקצה מחט הזריקה לשעה לפחות 1 כדי למזער את היצירה של בועות.
    6. תמהיל הזרקה נוסף חנות ב -80 ° C למקסימום של שלושה שימושים נוספים, לאחר שאיכות mRNA מידרדר (מידע לא מוצג).

2. איסוף החומר ביולוגי, Microinjection ותרבות העובר

  1. אוסף ביצית וזרע
    הערה: ראה Theodosiouאל et. 12 לפרוטוקול מפורט לגרימת השרצה ולאוסף תאים-מין.
    1. זכרים ונקבות בהלם ASW ב 23 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    2. שעה עד שעות לפני השקיעה, להעביר את המבוגרים לכוסות בודדות בASW בגיל 19 ° C משום שרוב המבוגרים שרצים 1-2 שעות לאחר שקיעה.
    3. יש לשטוף 35 מ"מ צלחות פטרי בASW המסונן ולתת להם הפוך יבשה כדי למנוע את הביציות מלהידבק לתחתית הצלחת.
    4. על ההשרצה, לאסוף מייד זרע וביציות עם טפטפת 1,000 μl.
      1. שמור זרע וביציות נפרדות מamphioxus המבוגר בגלל המגע הוא מזיק לבריאות תא מין (מידע לא מוצג).
      2. יתר על כן, להימנע מהבהיל המבוגרים, מה שמוביל לתנועות שתתפוגגנה, ולכן לדלל, שניהם זרע וביציות. כדי לשמור על הזרע פעיל זמן רב ככל האפשר וכדי לייעל את שיעור הפריה, לאסוף את הזרע כמרוכז ככל האפשר.
    5. שמורזרע על קרח בצינור 1.5 מיליליטר.
    6. העבר את הביציות בASW המסונן לתוך 35 מ"מ צלחות פטרי-שטף מראש.
    7. העברת 100-500 ביציות עם פיפטה פסטר העברה בעבר משך 300-400 מיקרומטר לעוד 35 מ"מ צלחת פטרי לבצע את הזריקות.
    8. להפרות את שארית המצמד כביקורת על זרע וביצית באיכות או לניסויים אחרים.
  2. הזרקת ביצית
    1. התקן את מחט הזריקה על micromanipulator בזווית 50 מעלות ביחס למישור האופקי.
      הערה: זוויות של פחות מ -50 מעלות ידחוף את הביציות סביב על הצלחת, ואילו זוויות של יותר מ -50 מעלות לא תאפשר ניטור מתאים של מיקום מחט ביחס לביצית.
    2. תחת בהיקף ניתוחים ניאון עם 25x oculars, להעביר 30 ביציות עם פיפטה פסטר העברת 300-400 מיקרומטר על צלחת פולי-ליזין מצופה המכילה ASW המסונן.
    3. להפקיד את הביציות לאורך קו לבצעזריקות בדרך מסודרת ולהבחין שהוחדרו מביציות מוזרקות אינן. הזרק מספרים קטנים (30 ביציות) כדי לצמצם את זמן החשיפה של ביציות לפולי-ליזין, אשר נוטה לעוות עוברים מתפתחים (מידע לא מוצג).
    4. השתמש בתאורת השדה הכהה כדי להבהיר את הביציות כשקופות ככל האפשר.
    5. עם ידית התנועה הגסה של micromanipulator, להביא את מחט הזריקה קרובה לביצית.
    6. עם מלקחיים עדינים, לחתוך לפתוח את המחט ברמה שבה הקצה מתחיל להיות עקום. על ידי פועם עם המזרק, לוודא שתערובת ההזרקה האדומה היא למעשה זורמת החוצה של המחט.
    7. בהגדלה 200X ועם ידית תנועת הקנס של micromanipulator, בעדינות להזיז את מחט הזריקה בתוך הליבה של הביצית.
      הערה: אם הוכנס גם באופן שטחי, הפתרון המוזרק לא יישאר בתוך הביצית. אם הוכנס רחוק מדי, הביצית תושמד.
    8. הזרק עם 1-3 פולסים של 120 durat msecיון ולחץ psi 1-10. אם המחט היא בסדר מספיק, להזריק עם זרימה רציפה בלחץ קבוע. ודא שעוצמת הזריקה מתאימה ל1/5 ל1/3 מהיקף ביצית אחת.
    9. לאחר הזרקה, למשוך את המחט החוצה במהירות כדי למנוע דליפה של הביצית.
    10. ודא שהפתרון המוזרק נשאר בתוך הביצית ושאחרי כמה שניות, הפתרון המוזרק מתפשט בכל הביצית.
    11. על מנת להעביר את הביצית הבאה בתור.
    12. לשמור על כמה עוברי uninjected של כל סדרה כביקורת שלילית להעריך את הקרינה הרקע בעת הסריקה לעוברים מוזרקים.
  3. בחירת הפריה, של עוברים מוזרקים ותרבות עובר
    1. להפרות את הביציות בהקדם סדרה כבר הזריק. כאיכות ביצית יורדת עם זמן, להזריק ולהפרות ביציות בתוך שעה 1 אחרי ההשרצה 12.
    2. תלוי בריכוז הזרע, להוסיף 1-5 טיפות של זרע לביציות ולערבל את הצלחת.
      הערה: מעטפת ההפריה צריכה להיות ברורה בעוברים לאחר דקות על 1.
    3. לאפשר לעוברים ללהתנתק המנה פולי-ליזין מצופה, תוך הזרקת סדרה נוספת של ביציות.
    4. מעביר את העוברים עם פיפטה פסטר מיקרומטר ההעברה 600 לצלחת פטרי מצופה agarose. הסר את העוברים מהצלחת פולי-ליזין מצופה בהקדם האפשרי, אם זה בכלל אפשרי לפני שלב 2-התא.
      הערה: במקרה של חשיפה ממושכת לפולי-ליזין, העוברים נוטים להיות blastulae צפוף וגדוש, שטוח בצד נוגע בתחתית הצלחת.
    5. בשלב 2 תאים ל4 תאים, בחר בהיקף ניתוחים ניאון עם מסנן DSR העוברים בהצלחה המוזרק, כלומר, אלה עם מורפולוגיה נורמלית כי תערוכת אות ניאון אדומה נגזרת פנול האדום.
    6. שמרו את העוברים בתרבות בASW המסונן בצלחות פטרי מצופה agarose ב 19 ° C עד השלב הרצוי לבהדמיה vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המפורט לעיל מספק את הבסיס לmicroinjection של B. ביציות lanceolatum ומכאן למבוא לפיתוח ב ' עוברי lanceolatum של mRNA קידוד חלבוני ניאון להדמית in vivo. למרות שהטכניקה היא בהחלט חזקה ואמינה, שיעור הזריקות מוצלחות תוך שימוש בפרוטוקול זה נשאר משתנה (טבלה 1). ההסבר סביר מאוד לעובדה מסקרנת זה הוא ההשתנות הקיצונית של ציפורני ביצית: קבוצות ביצה שונות אכן מתנהגות בצורה שונה מאוד, כאשר נתון ללחץ ההזרקה. ביציות חלקם ולא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, אנו מציגים, בפעם הראשונה, פרוטוקול מפורט ושחזור להזרקה של B. ביציות lanceolatum, אשר, לאחר B. הדגלונים 13,14 ו- B. 15 belcheri, לכן מיני amphioxus שלישיים, שלטכניקה כזו שתוארה. חשוב לציין, הפרוטוקול מתואר כאן כולל גם את התיאור של מערכות וקטור המתאים לייצור חלבוני ניאון בB. lanceolatum מmRNA המוזרק מיוצר במבחנה (שיפורט להלן). יחד, כלים החדשים אלה מאפשרים הדמיה vivo של ההתפתחות המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להכיר את התמיכה על ידי "Animalerie Centrale de Gif-sur-איווט" לגידול בעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מANR (ANR-09-BLAN-0262-02 וANR-11-JSV2-002-01) למייקל שוברט, על ידי המענק של האיחוד האירופי FP6 "Embryomics" ועל ידי מענק ANR "ANR- 10-BLAN-121,801 Dev-תהליך "לז'אן-פרנסואה ניקולא ונדין Peyriéras. João עמנואל Carvalho ממומן על ידי מענק דוקטורט FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

בקשות לווקטורים שתוארו כאן ניתן לפנות ישירות למחברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים מתכלים
35 מ"מ צלחות פטריפלקון353001מטופלת בתרבית
(Stericup 1 ליטר)FisherW217190.22 & #956; m
צינורות Spin-XCostar81600.22 & #956; m
צנצנת אחסון מחט לנימים בקוטר 1.2 מ"מWPIE212
פיפטותבאורך 230 מ"מ
צינור שאיפהDutscher75056
נימים למחטי הזרקהSutterBF 120-94-10זכוכית בורוסיליקט עם נימה, OD 1.20 מ"מ, ID 0.94 מ"מ, אורך 10 מ"מ
<חזק>ריאגנטים
אגרוז נמס נמוךסיגמאA9414
פנולאדום סיגמא114537
גליצרולסיגמאG2025
פולי-L-ליזין הידרוברומידסיגמאP9155
H2O, ערכת תמלול ללא DNase/RNaseGibco10977-035
mMessage mMachine SP6ערכתסינתזה mRNAAM1340
פנול pH 8SigmaP4557
24:1 כלורופורם: אלכוהול איזואמיליSigmaC0549
5:1 פנול pH 4.7: כלורופורםSigmaP1944
מלחי גבישי שונית (200 ק"ג)Europrix מלחים מסחריים
NaHCO3SigmaS6014
<חזק>ציוד
היקף ניתוח פלואורסצנטי עם הגדלה של 200XLeicaMZ16F25X oculars, מסנני DSR ו-GFP2
מיקרומניפולטורMarzhauzerM-33
מזרקPicospritzerדגם II או
חולץ מחטSutterP97חולץ מחט נימה חימום
מלקחיים עדיניםFine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5
יחידת סינון פסטר של אמביון III

מקורות

  1. Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
  3. Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
  4. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841(2014).
  5. Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
  6. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  7. Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
  8. Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
  9. Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  10. Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
  11. Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461(2013).
  12. Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
  13. Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
  14. Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
  15. Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
  16. Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
  17. Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
  18. Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
  21. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292(2000).
  22. Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
  23. Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
  24. Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
  25. Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
  26. Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
  27. Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
  28. Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
  29. Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
  30. Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
  31. Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
  32. Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599(1371).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Vivo
ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.