פיתחנו פרוטוקול פלואורסצנטי ספציפי לגדיל (FISH) המותאם אישית בקלות בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. זה מאפשר בחינה מפורטת של דינמיקת RNA עם תובנה בו-זמנית לגבי מבנה הכרומטין, הארגון הגרעיני וויסות השעתוק ברמת התא הבודד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
שילוב ניאון RNA הכלאה באתר (דגים) עם immunofluorescence (חיסוני דגים) יוצר בטכניקה שיכולה להיות מועסק ברמת התא הבודד כדי לזהות את הדינמיקה המרחבית של לוקליזציה RNA עם תובנה סימולטני ללוקליזציה של חלבונים, שינויים אפיגנטיים ופרטים נוספים אשר יכול להיות מודגש על ידי immunofluorescence. איון כרומוזום X הוא פרדיגמה להשתקת גנים ארוכה RNA קידוד שאינו (lncRNA) בתיווך. הצטברות X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA (נקראת Xist ענן) באחת משני כרומוזומים X-בנקבות יונקים היא שלב קריטי ליזום איון כרומוזום X. RNA Xist במישרין או בעקיפין אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים ומציג נופים אפיגנטיים ברורים לכרומוזום X פעיל (Xi). סימן היכר ידוע אפיגנטיים אחד Xi הוא trimethyl ליזין היסטון H3 27 שינוי (H3K27me3). כאן אנו מתארים חיסוני FISH פשוט ומהירפרוטוקול לאיתור Xist RNA באמצעות RNA FISH עם בדיקות oligonucleotide מרובות בשילוב עם immunofluorescence של H3K27me3 לבחון את הלוקליזציה של Xist RNA ושינויים אפיגנטיים הקשורים. שימוש בתוצאות בדיקות oligonucleotide בזמן דגירה קצר יותר וגילוי רגיש יותר של Xist RNA בהשוואה לבדיקות RNA במבחנה עיבד (riboprobes). פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של lncRNAs והשינוי אפיגנטיים הקשורים אליו, מבנה הכרומטין, ארגון גרעיני ורגולצית תעתיק.
מבוא
איון כרומוזום X יונקים (xci) הוא אסטרטגיה כדי לפצות על חוסר האיזון במינון גן צמוד X בין XX וXY, שבו אחד משני כרומוזומי X-בנקבות הוא תעתיק 1 מומת. איון כרומוזום X הוא מערכת מודל נהדרת עבור RNA קידוד שאינו ארוך מחקר (lncRNA). איון כרומוזום X מוסדר על ידי lncRNAs מרובה, ונחקר בהרחבה בעשרות השנים האחרונות לחשוף את מנגנוני crosstalk בין lncRNAs, שעתוק, מבנה הכרומטין וארגון גרעיני 2, 3.
מרכז איון X (XIC) הממוקם על כרומוזום X הוא מוקד גנטי מורכב מורכב ממספר גני ייצור RNAs ללא קידוד 4. X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA ביונקי eutherian....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בדיקה הכנה
- להשיג oligonucleotides מרובה הייחודי בXist (oligonucleotides 20-30 נוקלאוטיד באורך, טמפרטורת 63-65 מעלות צלזיוס היתוך, טבלת 1) עם שינוי 5'-אמינו ולהשעות במים.
- כמויות בריכת equimolar של oligonucleotides עם 5'-אמינו שינוי (סה"כ 4.5 מיקרוגרם) ותווית עם צבע פלואורסצנטי אמין-reactive הבא הוראות היצרן.
- ממיסים את oligonucleotides נקווה ב5 μl הסופי של מים nuclease חינם ול....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נציג תמונות של חיסוני FISH מהיר מוצגות באיור 1 א. שיתוף לוקליזציה של אות הענן וH3K27me3 Xist RNA על Xi התגלתה בהבחנת תאים נקביים. ביום 12 על בידול, יותר מ -90% מתאי EB היו ענן Xist (איור 1). בדיקות oligonucleotide הקצר חדרו יעילות לתוך הגרעינים, שמובילות להדמיה של כמעט כל אותות H3K27me3 שיתוף מקומי עם Xist RNA (איור 1 ג; 97%, n = 150).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה, שהצגנו פרוטוקול חיסוני FISH מהיר שלוקח פחות מ 5 שעות כדי להשלים הכנת שקופיות, Xist RNA FISH, וimmunofluorescence לH3K27me3. בהשוואה לגישה חיסונית FISH הכללי לXist RNA זיהוי, אשר בדרך כלל צריך דגירה הלילה לRNA FISH, פרוטוקול זה לא רק מפחית באופן משמעותי את משך זמן, אלא גם משפר את הרגישות של חיסון-FISH באמצעות בדיקות oligonucleotide.
מאז Xist הוא עיבד מאוד במהלך איון כרומוזום X והתמליל שלה נמצא לצבור עוצמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
תודות
אנו מודים ל-Hongjae Sunwoo על עצות מועילות לתכנון אוליגונוקלאוטידים ב-RNA FISH. אנו מודים גם לסרניטי קרטיס על עריכת כתב היד. ניו יורק נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט למחקר בחו"ל של האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS). עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (RO1-GM102184), קרן המחקר March of Dimes (#6-FY12-337), וקרן ההתפתחות ומענק הנאמן במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי ל-Y.O.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אוליגונוקלאוטידים עם שינוי אמינו 5' | IDT | ||
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 | |
| MicroSpin G-25 עמודות | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
| בקר סרום אלבומין, דרגת ביולוגיה מולקולרית (עבור מאגר הכלאה) | Roche | ||
| היסטון H3K27me3 נוגדן | מוטיב פעיל | 61017 | |
| Alexa Fluor 555 עז נגד עכבר, ספיחה צולבת גבוהה | Life Technologies | A21424 | |
| ProLong Gold נוגדן נגד דהייה | Life Technologies | P36931 |
מקורות
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
