אנו מציגים שיטה של הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
bilayers שומנים נתמך (SLBs) נמצא בשימוש נרחב כמודל ללימוד תכונות קרום (הפרדת פאזות, אשכולות, דינמיקה) והאינטראקציה שלה עם תרכובות אחרות, כגון תרופות או פפטידים. עם זאת מאפייני SLB שונים בהתאם לתמיכה בשימוש.
טכניקות המשמשות בדרך כלל להדמית SLB ומדידות הן מיקרוסקופיה הקרינה מולקולה בודדת, FCS ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). מכיוון שרוב מחקרי הדמיה אופטיים מתבצעים על תמיכת זכוכית, תוך AFM דורש משטח שטוח מאוד (בדרך כלל נציץ), תוצאות של טכניקות אלה לא ניתן להשוות באופן ישיר, שכן המאפיינים של הטעינה והחלקות של חומרים אלו משפיעים במידה רבה דיפוזיה. למרבה הצער, ברמה הגבוהה של מיומנות ידנית הנדרשת לחיתוך והדבקת פרוסות דקות של נציץ לשקופית הזכוכית מציגה משוכת לשימוש השגרתי של נציץ להכנת SLB. למרות שזה יהיה שיטת הבחירה, נציץ והכין כזהמשטחים לעתים קרובות בסופו של דבר להיות לא אחיד (גלי) וקשה לתמונה, במיוחד עם מרחק עבודה קטן, עדשות צמצם מספריות גבוהות. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לשחזור להכנת משטחים נציץ דקים ושטוחים לתצהיר שלפוחית שומנים בדם והכנת SLB. בנוסף, קאמרי המותאם אישית שלנו דורש כמויות קטנות מאוד של שלפוחית להיווצרות SLB. התוצאות הכוללות ההליך בייצור יעיל, פשוט וזול של משטחי bilayer שומנים באיכות גבוהה, כי הם ישירות דומים לאלה המשמשים במחקרי AFM.
מבוא
המטרה הכללית של הפרוטוקול הנוכחי היא להראות שיטה להכנת משטחים נציץ להדמיה ברזולוציה גבוהה של שומנים בדם bilayers נציץ נתמך (SLBs) באמצעות מיקרוסקופ אופטי סך הקרינה ההשתקפות פנימית (TIRFM) או confocal, אשר יכול גם להיות משולב עם כוח אטומי מיקרוסקופ (AFM).
SLBs הוא מודל המשמש באופן נרחב למחקרים רבים של אשכולות שומנים בדם, הפרדה פאזות, דינמיקה של מרכיבי bilayer או האינטראקציות שלהם עם פפטידים, חלבונים או תרכובות אחרות 1-5. מצעים שונים עשויים לשמש להיווצרות SLB (כלומר זכוכית, נציץ, דו תחמוצת הצורן, פולימרים), בהתאם לאופי של המחקר 4,6-8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מיכה ושקופיות הכנה
- מקום מס '1 וחצי (0.17 מ"מ) coverslips למדף מכתים.
- Sonicate במשך 30 דקות בחומר ניקוי 2% ב60 ° C.
- שטוף 20 פעמים עם מים deionized.
- הסר שקופיות באמצעות מלקחיים ומכה יבש באמצעות אוויר או חנקן דחוס.
- חותכים גיליון נציץ לתוך 10 x 10 מ"מ חתיכות מרובעות באמצעות מספריים או סכין גילוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דיפוזיה ההתנהגות של בדיקות שומנים בדם ניאון בSLBs היא שונה בהתאם למצע. TIRFM בשילוב עם טכניקת SMT הוא שיטה יקר המאפשר הדמית תנועות חלקיקים וחילוץ מקדמי דיפוזיה שלהם. אותות מולקולה אחת של בדיקה Sphingomyelin-ATTO647N לשדר בdOPC bilayer (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) נתמך על זכוכית ואציץ מוצגים במצורפת דמות אנימציה. המשטח נציץ נערך על פי הפרוטוקול שהוצג כאן. כדי להעריך עיוותים אופטיות, רוחב מלא במחצית המרבית (FWHM) נמדד ובממוצע לכל פונקצית 20 נקודת התפשטות (כוחו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת משטחים נציץ חלקים ודקים לתצהיר bilayer שומנים והדמיה ברזולוציה גבוהה. הטכניקה דורשת מיומנויות ידניות מינימליות, מוגבלות בעיקר לפירוק זהיר של כריך הזכוכית נציץ זכוכית (שלב 2.8), שהוא קריטי לקבלת משטח נציץ באיכות גבוהה. בדיקה של נציץ ביקע טרי נדרשה תמיד, בשלב זה, שכן הוא מאפשר ליציץ להתנתק מהדבק האופטי ללא ביקוע, והשאירה את האזורים חשופים של דבק אופטי. שעלול לגרום לתצהיר לא רצוי של bilayer בדבק במקום במיקה. המשטח נציץ הוכן באמצעות השיטה המתוארת היא עם כמה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
יש הסופרים לא תודות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 מ"מ - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (חומר ניקוי) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| דבק אופטי (גבוה צמיגות) | Norland Products | NOA63 | |
| דבק אופטי (צמיגות נמוכה) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| מנורת UV | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | המנורה הוגדרה ל-100% הספק |
מקורות
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
