אנו מציגים שיטה של הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
bilayers שומנים נתמך (SLBs) נמצא בשימוש נרחב כמודל ללימוד תכונות קרום (הפרדת פאזות, אשכולות, דינמיקה) והאינטראקציה שלה עם תרכובות אחרות, כגון תרופות או פפטידים. עם זאת מאפייני SLB שונים בהתאם לתמיכה בשימוש.
טכניקות המשמשות בדרך כלל להדמית SLB ומדידות הן מיקרוסקופיה הקרינה מולקולה בודדת, FCS ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). מכיוון שרוב מחקרי הדמיה אופטיים מתבצעים על תמיכת זכוכית, תוך AFM דורש משטח שטוח מאוד (בדרך כלל נציץ), תוצאות של טכניקות אלה לא ניתן להשוות באופן ישיר, שכן המאפיינים של הטעינה והחלקות של חומרים אלו משפיעים במידה רבה דיפוזיה. למרבה הצער, ברמה הגבוהה של מיומנות ידנית הנדרשת לחיתוך והדבקת פרוסות דקות של נציץ לשקופית הזכוכית מציגה משוכת לשימוש השגרתי של נציץ להכנת SLB. למרות שזה יהיה שיטת הבחירה, נציץ והכין כזהמשטחים לעתים קרובות בסופו של דבר להיות לא אחיד (גלי) וקשה לתמונה, במיוחד עם מרחק עבודה קטן, עדשות צמצם מספריות גבוהות. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לשחזור להכנת משטחים נציץ דקים ושטוחים לתצהיר שלפוחית שומנים בדם והכנת SLB. בנוסף, קאמרי המותאם אישית שלנו דורש כמויות קטנות מאוד של שלפוחית להיווצרות SLB. התוצאות הכוללות ההליך בייצור יעיל, פשוט וזול של משטחי bilayer שומנים באיכות גבוהה, כי הם ישירות דומים לאלה המשמשים במחקרי AFM.
מבוא
המטרה הכללית של הפרוטוקול הנוכחי היא להראות שיטה להכנת משטחים נציץ להדמיה ברזולוציה גבוהה של שומנים בדם bilayers נציץ נתמך (SLBs) באמצעות מיקרוסקופ אופטי סך הקרינה ההשתקפות פנימית (TIRFM) או confocal, אשר יכול גם להיות משולב עם כוח אטומי מיקרוסקופ (AFM).
SLBs הוא מודל המשמש באופן נרחב למחקרים רבים של אשכולות שומנים בדם, הפרדה פאזות, דינמיקה של מרכיבי bilayer או האינטראקציות שלהם עם פפטידים, חלבונים או תרכובות אחרות 1-5. מצעים שונים עשויים לשמש להיווצרות SLB (כלומר זכוכית, נציץ, דו תחמוצת הצורן, פולימרים), בהתאם לאופי של המחקר 4,6-8. מחקרי קרום אופייניים להסתמך על שיטות הדמיה המבוססת על מיקרוסקופיה, כגון TIRFM וAFM. לפיכך, להדמית TIRFM, משטח זכוכית הוא בחירה אופיינית בגלל הזכוכית היא שקופה. הכנת הזכוכית היא קלה יחסית, ואיכות התוצאות היא בעיקרנקבע על ידי פני השטח יסודיים ניקוי לפני התצהיר של שלפוחית שומנים. AFM בשל הרזולוציה הגבוהה הצירית דורש משטחים נציץ. מיכה הוא מינרל סיליקט, עם קרוב ל מחשוף בסיס מושלם. לפיכך, נציץ ביקע הטרי הוא שטוח אטומי, המאפשר תצפית של הפרשי גובה קרום אפילו בקנה המידה תת ננומטר 9.
מחקרי דיפוזיה תוך שימוש בשיטות כגון מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS), אחת מולקולת מעקב (SMT), והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) הראו עם זאת, כי דינמיקת הקרום השומני תלויה במידה רבה בסוג של משטח עליו הם מופקדים, לפיה זכוכית ותציץ יכול לתת תוצאות שונות באופן נרחב 10,11. הבדלים אלה כוללים לא רק את מקדמי דיפוזיה של בדיקות הקרום, אלא גם את זיהוי של אוכלוסיות נפרדות של חלקיקים לשדר עם תעריפים שונים, ואולי גם מעבר בין מדינות שונות.
כך,ההשוואה הישירה של תוצאות שהושגו תוך שימוש בטכניקות TIRFM וAFM היא לעתים קרובות בעייתית, אלא אם כן אותו המשטח (במקרה נציץ זה) משמש. אמנם יש כמה מחקרים שבם ההדמיה bilayer TIRFM וAFM נערכה על אותו המשטח נציץ 12,13, נציץ ומשמש רק לעתים נדירות למיקרוסקופיה אופטית, בעיקר בגלל בעיות טיפול. הכנה נציץ דורשת חיתוך ביד לעלונים דקים, אשר לאחר מכן מודבקים על coverslip באמצעות דבק אופטי 12. שיטת אולם זה דורשת קצת תרגול כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. יתר על כן, המשטחים שהושגו הם לעתים קרובות גליים ועבים, מה שהופך אותם קשה לשימוש עם מרחק עבודה נמוך, עדשות צמצם מספריות גבוהות.
משטחי מיכה מוכנים כפי שתואר בפרוטוקול זה הם דקים מאוד (~ 220 מיקרומטר, כולל עובי coverslip של 170 מיקרומטר) ושטוח מאוד, הימנעות "גלי", שהוא קריטי להדמיה ברזולוציה גבוהה מוצלחת. הם יכולים לשמשעבור setups TIRFM או confocal. יתר על כן, ניתן להעביר את אותו הדגימות לAFM, ואפילו צילמו בו זמנית עם TIRFM / confocal ו AFM. שילוב של שתי טכניקות אלו מאפשרת קשר ישיר של דיפוזיה התנהגות עם מבנה קרום bilayer 14. מכיוון שמשטחים נציץ הם ביקע טריים, שהם נקיים ואינם דורשים זמן רב, בצורה גרועה לשחזור, והליכי ניקוי שעלול להיות מסוכנים (פרוטוקולי ניקוי זכוכית בדרך כלל כוללים כימיקלים כגון פתרון Piranha, חומצה גופרתית, נתרן / אשלגן הידרוקסידי). הרכבה של חדר קטן, גם תואר בפרוטוקול, מפחית את עוצמת הקול של שלפוחית הנדרשת להיווצרות bilayer יעילה פחות מ50 μl. לבסוף, את כל התהליך של הרכבה משטח הוא לא זמן רב (הכנה לוקחת פחות מ 30 דקות), ואינה דורשת רמה גבוהה של מיומנות ידנית, כפי שעושה מחשוף נציץ קונבנציונלי והדבקה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מיכה ושקופיות הכנה
- מקום מס '1 וחצי (0.17 מ"מ) coverslips למדף מכתים.
- Sonicate במשך 30 דקות בחומר ניקוי 2% ב60 ° C.
- שטוף 20 פעמים עם מים deionized.
- הסר שקופיות באמצעות מלקחיים ומכה יבש באמצעות אוויר או חנקן דחוס.
- חותכים גיליון נציץ לתוך 10 x 10 מ"מ חתיכות מרובעות באמצעות מספריים או סכין גילוח.
- חותכים כל חתיכה נציץ לתוך 2-3 עלונים דקים באמצעות סכין גילוח.
הערה: שלב זה דורש שימוש בסכין חד.
2. עצרת מיכה וקאמרי הרכבה
- שקופית נקייה מיקרוסקופית זכוכית עם אתנול.
- עלון דבק נציץ לחתוך בשלב 1.6 לשקופית זכוכית באמצעות דבק אופטי. דבק צמיגות נמוך מומלץ לפזר טוב יותר את הירידה ומדביק את המיקה.
- לרפא תחת מנורת UV, 10 דקות.
הערה: הדבק הוא נרפא על ידי אור UV עם ספיגה מקסימלית בטווח של 350 ל380nm ואנרגיה המומלצת requIRED לריפוי מלא הוא 4.5 J / 2 סנטימטר. עם זאת, מקורות אור שונים יכולים לשמש לצעד זה (ראה חומרים המסופקים על ידי ספק דבק). - לחשוף את משטח נציץ נקי על ידי הסרת כמה השכבות הראשונות עם סקוטש.
- מניחים טיפה קטנה (~ 20 מיקרומטר) של דבק אופטי על גבי המשטח נציץ.
הערה: בשלב זה, דבק צמיגות גבוה עם רמת autofluorescence הנמוכה מומלץ. הניסיון שלנו הראה כי שימוש בשילוב של נמוך (שלב 2.2) ודבקי צמיגות גבוהים מגביר את היעילות באופן משמעותי מפיצול נציץ (שלב 2.7). - מניח בעדינות coverslip נוקה לאחרונה על הירידה של דבק, הימנעות בועות אוויר, בואו נתפשר על דקות 1.
- לרפא תחת מנורת UV, 10 דקות.
הערה: לאחר שלב זה, את הכריך של שקופיות זכוכית, נציץ וcoverslip ניתן לאחסן לתקופה ארוכה יחסי של זמן (עד מספר שבועות). להמשיך לשלב הבא ממש לפני הכנת SLB בפועל, כדי לוודא שהמשטח נציץ הוא טרי.
הערה: הדבק הוא נרפא על ידי אור UV עם ספיגה מקסימלית בטווח של 350 ל380nm והאנרגיה המומלצת הנדרשת לריפוי מלא הוא 4.5J/cm 2. עם זאת, מקורות אור שונים יכולים לשמש לצעד זה (ראה חומרים המסופקים על ידי ספק דבק). - באמצעות סכין exacto, בעדינות לרדת מאופני coverslip משקופיות זכוכית הצד כפי שמוצג בסרטון. ברוב המקרים, שכבה דקה ושטוחה של נציץ תישאר מחוברת לcoverslip. מיכה מצורף לשקופית זכוכית ניתן לעשות שימוש חוזר (חוזר מצעד 2.4).
- בדוק את איכות פני השטח על ידי עין בלתי מזוינת או תחת מיקרוסקופ לנתח, על מנת לוודא כי שכבה נציץ עדיין דבוקה לcoverslip ולא הוסרה לחלוטין במהלך הפיצול בשלב 2.8. מה שהופך את שריטה קטנה עם מלקחיים או לנתח מחט יעזור להבחין בין הדבק שבו יש עקביות שונה במובחן מיציץ.
- הוצא את אטם גומי ממיליליטר בקבוקון כובע 1.5 ולהדביק את הכובע הפוך אל פני השטח באמצעות אופטידבק או לק, ולרפא עם מנורת UV, או שאוויר יבש 10 דקות, בהתאמה.
הערה: אם המדגם הוא מוכן לבו זמנית אופטי (TIRFM או confocal) עם ההדמיה AFM, מיליליטר בקבוקון כובע 1.5 עשוי להיות קטן מדי כדי לעלות על ראש AFM על הבמה מיקרוסקופ. במקרה זה, הכובע עשוי להיות מוחלף על ידי כל O-טבעת פלסטיק בקוטר גדול יותר, מתאימה לראש AFM גובר. במקרה כאשר הניסוי דורש הסרת המכסה מבלי לפגוע במשטח נציץ, גריז סיליקון יכול לשמש במקום דבק או לק.
3. גיבוש נתמך יפידים bilayer (SLB)
- הנח פתרון יפוזום מוכן טרי לתוך תא עם משטח. ההיקף המינימאלי הנדרש להיווצרות SLB הוא ~ 30 μl.
הערה: לפרטים נוספים על יפוזום והיווצרות SLB, עיין בפרוטוקולים שפורסמו, כגון כגון התיק ואח' 2014 15.. - להמשיך עם היווצרות SLB באמצעות פרוטוקול רצוי. במהלך דגירה והדמיה, החדר יכול להיות ממוקם בחום לחסום או במה מיקרוסקופ מחוממת כדי לשמור דרושה כדי לשמור על השומנים בשימוש מעל לטמפרטורת ההתכה שלהם טמפרטורה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דיפוזיה ההתנהגות של בדיקות שומנים בדם ניאון בSLBs היא שונה בהתאם למצע. TIRFM בשילוב עם טכניקת SMT הוא שיטה יקר המאפשר הדמית תנועות חלקיקים וחילוץ מקדמי דיפוזיה שלהם. אותות מולקולה אחת של בדיקה Sphingomyelin-ATTO647N לשדר בdOPC bilayer (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) נתמך על זכוכית ואציץ מוצגים במצורפת דמות אנימציה. המשטח נציץ נערך על פי הפרוטוקול שהוצג כאן. כדי להעריך עיוותים אופטיות, רוחב מלא במחצית המרבית (FWHM) נמדד ובממוצע לכל פונקצית 20 נקודת התפשטות (כוחו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת משטחים נציץ חלקים ודקים לתצהיר bilayer שומנים והדמיה ברזולוציה גבוהה. הטכניקה דורשת מיומנויות ידניות מינימליות, מוגבלות בעיקר לפירוק זהיר של כריך הזכוכית נציץ זכוכית (שלב 2.8), שהוא קריטי לקבלת משטח נציץ באיכות גבוהה. בדיקה של נציץ ביקע טרי נדרשה תמיד, בשלב זה, שכן הוא מאפשר ליציץ להתנתק מהדבק האופטי ללא ביקוע, והשאירה את האזורים חשופים של דבק אופטי. שעלול לגרום לתצהיר לא רצוי של bilayer בדבק במקום במיקה. המשטח נציץ הוכן באמצעות השיטה המתוארת היא עם כמה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
יש הסופרים לא תודות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Coverslips 24 x 50 מ"מ - No H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (חומר ניקוי) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| דבק אופטי (גבוה צמיגות) | Norland Products | NOA63 | |
| דבק אופטי (צמיגות נמוכה) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyelin-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| מנורת UV | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | המנורה הוגדרה ל-100% הספק |
מקורות
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).
- Plochberger, B., et al. Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer. Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).
- El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).
- Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures. Biointerphases. 5, 120-130 (2010).
- Strulson, M. K., Maurer, J. A. Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers. Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).
- Satriano, C., et al. Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation. Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).
- Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).
- Singh, S., Keller, D. J. Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers. Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).
- Przybylo, M., et al. Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions. Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).
- Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics. Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).
- Oreopoulos, J., Yip, C. M. Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Methods. 46, 2-10 (2008).
- Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers. J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).
- Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy. J Chem Phys. 134, (2011).
- Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7, (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
