הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כימות Orofacial פנוטיפים ב צפרדעים

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52062

⸱

6 בנובמבר 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

שיטה לכמת את גודלו וצורת orofacial של עוברי laevis Xenopus פותחה. בפרוטוקול זה, מדידות גודל מסורתיות בשילוב עם morphometrics הגיאומטרי כדי לאפשר ניתוחים מתוחכמים יותר של התפתחות וליקויי orofacial.

תקציר

צפרדעים הפכו לכלי חשוב עבור לנתח את המנגנונים לפיקוח על בנייה ופגמי craniofacial. שיטה לכמת פיתוח orofacial תאפשר לניתוח קפדני יותר של פנוטיפים orofacial על ביטול עם חומרים שיכולים מבחינה גנטית או מולקולרי לתפעל ביטוי גנים או תפקוד חלבון. שימוש בשתי תמונות ממדיות של הראשים העובריים, ממדים-כגון גודל מסורתיים כרוחב orofacial, גובה וarea- נמדדים. בנוסף, מדד עגלגלות של פתיחת הפה העוברית משמש לתאר את הצורה של הפה. morphometrics הגיאומטרי של שתי תמונות ממדיות אלה מבוצעים גם כדי לספק מבט מתוחכם יותר של שינויים בצורתו של אזור orofacial. ציוני דרך מוקצות לנקודות ספציפיות באזור orofacial וקואורדינטות נוצרות. ניתוח מרכיבי עיקרון משמש להפחתת קואורדינטות ציון דרך לרכיבי עיקרון שאז להפלות הטיפולקבוצות. תוצאות אלו מוצגות כעלילת פיזור שבו אנשים עם צורות orofacial דומות להתקבץ יחדיו. זה גם שימושי לביצוע ניתוח פונקצית מבחין, שסטטיסטי משווה את עמדותיהם של ציוני הדרך בין שתי קבוצות טיפול. ניתוח זה מוצג ברשת שינוי בהם שינויים בעמדת ציון דרך נתפסים כוקטורים. רשת היא על גבי וקטורים אלה, כך שדפוס השתאה מוצג כדי להראות היכן עמדות ציון דרך משמעותיות השתנו. שינויי צורה בניתוח פונקצית המבחין מבוססים על מדד סטטיסטי, ולכן יכולים להיות מוערך על ידי p-value. ניתוח זה הוא פשוט ונגיש, הדורש רק stereoscope ותוכנה חופשית, ובכך יהיה משאב מחקר והוראה רב-ערך.

מבוא

בין הסוגים הנפוצים וההרסניים ביותר של מומים מולדים אנושיים כאלה המשפיעים על הפה ופנים, הם כמו בקיעי orofacial 1. ילדים עם מבני orofacial פגומים לעבור ניתוחים רבים במהלך חייהם ואת המאבק עם מומי פנים, דיבור, שמיעה ובעיות אכילה. לכן, קידום מחקר חדש בפיתוח cranio- וorofacial הוא בעל חשיבות עליונה למניעה וטיפול בסוגים אלה של מומים מולדים בבני אדם. Laevis Xenopus התפתח ככלי חדש ללנתח את המנגנונים לפיקוח על בניית craniofacial (כמה דוגמאות כוללות את 2,3,4 -11). לכן, שיטה כמותית לניתוח שינויים בגודל ובצורה במהלך פיתוח של הראש והפנים של מין זה יכול להיות מאוד חזק 3.

כאן, אנו מציגים שיטה כאמור; שילוב מדידות גודל מסורתיים עם morphometrics הגיאומטרי מותאם ממחקר צפרדעים 12 ושפע של מחקרי ניתוח מבנה פנים אנושיים 13-15. מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים לכמת גודל פנים וצורות כדי להבחין בין פנוטיפים orofacial השונים במהלך התפתחות נורמלית ולא נורמלית. ניתוח זה יאפשר לבידול טוב יותר בין פגמי craniofacial העדינים כגון אלה הנובעים מהשפעות סינרגיסטי של גנים ו / או גורמים סביבתיים. בנוסף, שיטת כימות זה עשויה גם לחשוף אפילו שיפור או הצלה קל של פגם orofacial. זה כן הופך אותו למדריך שימושי בניתוח הרפוי פוטנציאלי.

השילוב של מדידות פנים וmorphometrics הגיאומטרי שאנו מציגים כאן מאפשר ניתוח סטטיסטי מקיף יותר של שניהם בגודל ובצורה של אזור orofacial מאשר פרוטוקולים הנוכחיים אשר במידה רבה לנצל רק אחת או 15-18 האחר. יתר על כן, אנו מציגים דרך פשוטה להעריך הן את המדיאלי ומטוסים לרוחב שלהפנים ללא צורך בציוד הדמיה תלת-ממדי מתוחכם המשמש במחקרים הנוכחיים 13,19.

אנו מדגימים פרוטוקול זה על צפרדעי laevis עוברים שטופלו במעכב קולטני חומצה רטינואית שגורם פיתוח orofacial חריג ו2,3 חיך שסוע חציון. כימות של הממדים וצורה של אזור orofacial בעוברים אלה חשפה שינויים בmidface שדומה לבני אדם עם בקיעי חיך דומים ומודלים של עכברי 20,21. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעות של תרכובות אחרות בפיתוח orofacial כגון חומרים טבעיים, קוטלי עשבים, או חלבונים כגון גורמי גדילה. יתר על כן, שינויי גודל וצורת orofacial הנובעים מהפרעות של ביטוי גנים באמצעות הפסד או רווח של ניסויי פונקציה (באמצעות morpholinos antisense או מצננים / Talens) יכול להיות גם לכמת באמצעות פרוטוקול זה. לבסוף, פיתחנו specifica שיטה זוlly להעריך מורפולוגיה צפרדעים; עם זאת, הוא שונה בקלות לניתוח של כל חוליות. יישומים אחרים יכולים לכלול גם שימוש בפרוטוקול זה להשוואה בין מינים קשורים באופן הדוק למחקרים אבולוציוניים או אקולוגיים. בעוד הדוגמא שאנו מספקים כאן מנצלת פרוטוקול זה כדי לתאר את הניתוח באזור orofacial, זה יכול בקלות להיות שונה לניתוח של אזורים אחרים, איברים, או מבנים.

פרוטוקול כימות orofacial זה יהפוך למשאב יקר ערך עבור קהילת המחקר, כמו גם כלי ללימוד מצוין לסטודנטים לתואר ראשון כהפגנת וידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו באמצעות laevis Xenopus אושרו על ידי IACUC (# AD20261 פרוטוקול).

1. ריאגנטים הכנה וחומרים דרושים

  1. ריאגנטים:
    1. הפוך 1 ליטר של 10x MBS (מלוח של בארת השתנה) פתרון 22. להוסיף NaCl (880 מ"מ), KCl (10 מ"מ), MgSO 4 (10 מ"מ), HEPES (50 מ"מ, pH 7.8), וNaHCO 3 (25 מ"מ) ל1 ליטר של מים מזוקקים. התאם ל- pH 7.8 עם NaOH.
    2. הפוך 1 ליטר של MBS 1x על ידי דילול של פתרון MBS 10x ב900 מיליליטר של מים מזוקקים 100 מיליליטר. להוסיף 0.7 מיליליטר של M CaCl פתרון 2 1.
    3. הפוך 1 ליטר של 0.1x MBS על ידי דילול של פתרון 1x MBS ב900 מיליליטר של מים מזוקקים 100 מיליליטר. ל1 ליטר של פתרון MBS 0.1x, להוסיף 1 מיליליטר של 10 מ"ג פתרון גנטמיצין מיליליטר / לשימוש בתרבות עובר.
    4. הפוך MBS מלח גבוה על ידי המסת 4 מיליליטר של 5 M NaCl בשל 10x MBS 100 מיליליטר. ואז להוסיף מים מזוקקים עד נפח כולל הוא 1 ל
    5. הפוך 70% אתנול על ידי דילול דואר 100%thanol 70% אתנול באמצעות מים מזוקקים.
    6. הפוך BMS-543 על ידי הכנת פתרון מניות 10 מ"מ בsulfoxide דימתיל (DMSO).
    7. הפוך paraformaldehyde% 4 (PFA) על ידי הוספת 4 גרם של אבקת paraformaldehyde 50 מיליליטר מים מזוקקים. חום על פלטה חשמלית לכ -65 מעלות צלזיוס, ובשלב להוסיף 5 M NaOH ירידה מבחינת עד פתרון מנקה.
      1. לאחר הפתרון מנקה, מסירים מאש ומוסיף 50 מיליליטר 2x PBS ו -100 Tween-20 μl. אפשר להתקרר לRT על קרח. התאם ל- pH בין 7.2 ו -7.5 שימוש בHCl.
    8. בצע פתרון ופר פוספט עם Tween (PBT) על ידי המסת 8 גרם NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 גרם של Na 2 4 HPO, ו0.24 גרם של KH 2 PO 4 ב800 מיליליטר מים מזוקקים. באמצעות HCl, להתאים את ה- pH 7.4. הוסף 2 מיליליטר של Tween-20. התאם את עוצמת קול סופי עם מים מזוקקים שווה 1 L.
    9. בצע פתרון ציסטאין על ידי המסת 1 גרם של ציסטאין ב 50 מיליליטר מים מזוקקים או 0.1x MBS. להוסיף 1.5 מיליליטר של 5 M NaOHnd להתאים את ה- pH 7.8.
    10. הפוך 10% מניות פתרון benzocaine על ידי הוספת 10 גרם של אבקת benzocaine 100 מיליליטר 100% EtOH. להמתת חסד של זכרים בוגרים ועוברים מוכנים לקיבעון, לדלל את פתרון 0.05%.
    11. בצע פתרון אחסון אשכים על ידי הוספת 1 מיליליטר של סרום עגל עד 9 מיליליטר של חיץ L15.
  2. נדרשו כלים וציוד:
    1. השג את הציוד המפורט בטבלה של חומרים וציוד, שמוצג באיור 1.
    2. לשנות כלי פיפטה. הנח את קצה פיפטה פסטר זכוכית לתוך להבת מבער בונזן. סובב את קצה פיפטה עד שהוא נמס ויוצר סוף אטום מעוגל.
    3. שטח פלסטלינה לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי פלסטיק, החלקה על מנת לכסות את כל הצלחת (ניתן להשתמש בכל גודל) (איור 1Aiv).
      1. לחץ קל מחט מתגרה ישר לתוך הצלחת מרופדת חימר בזווית של 45 מעלות. החזק את המחט יש, ולאט לאט להזיז את פטרילחלק אופקי כדי ליצור קו בדיכאון (איור 1Bi). חזור על פעולה עבור המספר הרצוי של שורות.
      2. השתמש בסופו של כלי טפטפת זכוכית כדי להפוך את השקעים רדודים, עגולים בכל שורה של המנה מצופה חימר למקום ראשי עובר (איור 1Bii) וסיוע בארגון העוברים בזמן צילום.
      3. לצילום, למלא צלחת עם PBT (איור 1Biii). בין שימושים, לשטוף ביסודיות את הצלחת ומשטח חימר עם מים סטריליים, ואחריו 70% אתנול.

2. טיפולי תרבות ומונעי העובר laevis Xenopus

  1. בהפריה חוץ גופית ותרבות של ביצי צפרדעים:
    1. השג ותרבות Xenopus laevis עובר באמצעות שיטות סטנדרטיים פורסם 22,23.
    2. בקצרה, להרדים זכר בוגר על ידי טבילה ב0.05% פתרון benzocaine. לנתח אשכים ולאחסן במאגר אחסון אשכים. הזרקנשים בוגרות עם גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG), לאסוף ביצים בMBS מלח גבוה, ולהפרות במבחנה עם אשכים גזורים (איור 2 א, ב ').
    3. עוברי תרבות ב0.1x MBS ב 15 מעלות צלזיוס עד שיגיע לשלב הרצוי (עובר שלב על פי הטבלה רגילה של laevis Xenopus ידי Nieuwkoop ופאבר 24,25).
      1. כאן, עובר תרבות עד שלב 22 (24 שעות לאחר הפריה (hpf)), ולהסיר את קרום vitelline תחת סטראו באמצעות שני זוגות מלקחיים חידדו. העברה עובר עם סטנדרטי, פיפטה העברה חד פעמית לצלחת נקייה פטרי (בקוטר 100 מ"מ) המכילה 30-40 מיליליטר של 0.1x MBS.
  2. טיפולים מונעי של עוברי צפרדעים (באיור 2):
    1. מלא את הבארות הכרחיות של תרבות צלחת 24 גם עם 1 מיליליטר של 0.1x MBS באמצעות פיפטה-אדם מכויל. תיחום מחוץ להיטב עם סימן נקודת קנסאה (איור 2 ד, הבלעה). השתמש בסמן גם לתייג את התוכן שיש להוסיף לכל אחד גם על מכסה צלחת תרבות 24 גם. להעתיק את המידע הזה על גבי דף הגדרה 24 גם במחברת המעבדה.
    2. העבר 5-10 עוברים לבאר כל שימוש בתקן, פיפטה העברה חד פעמית (איור 2 ג). הנח אותו המספר של עוברים בכל טוב.
    3. ראש הדף למעלה או להסיר את MBS 0.1x, כך שהוא ברמה עם הקו המסומן 1 מיליליטר (איור 2 ד). הוספת הנפח המתאים של DMSO (כך שהנפח הסופי של DMSO הוא 1%) ועדינות מערבולת. היזהר שלא להוסיף DMSO הקרוב מדי לעוברים, ולהימנע ממגע של עובר עם פני השטח של המאגר.
    4. הוספת הנפח המתאים של חומר כימי לבארות המיועדות ועדינות מערבולת שוב. כאן, להוסיף 1 μl של 10 מ"מ BMS-453 (אנטגוניסט לרצפטור חומצה רטינואית) ו -9 μl של DMSO ל 1 מיליליטר של 0.1x MBS.
    5. אם הכימי רגיש לאור, באופן רופף לעטוף את רחוב ללא מוצאצלחת מכשור בנייר אלומיניום. עוברי תרבות ב-15 מעלות צלזיוס חממה עד השלב הרצוי. בדוגמא זו, טיפול בעוברים ל16-18 שעות.
  3. שטיפת עוברים מחוץ לטיפול וגידול עד שלבי ראשן:
    1. הסר מחצית עד שלושה רבעים מהפתרון עם טפטפת העברה חד פעמי. היזהר שלא להפריע לעוברים. בעזרת פיפטה העברה חדשה, למלא את היטב עם 0.1x MBS. חזור על 3-6 פעמים זה.
    2. העברה עובר לצלחת פטרי גדולה (150 מ"מ בקוטר) המכילה של 0.1x MBS עם גנטמיצין 100 מיליליטר (1 מיליליטר / ליטר). דגירה עובר ב 15 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים שלב 42-45 (hpf 82-100).
    3. לשנות את גנטמיצין פתרון MBS 0.1x מכיל יומי, ולהסיר עובר מת מייד על מנת למנוע זיהום או מוות של עוברים אחרים. רשום את מספר העוברים המתים במחברת מעבדה.
  4. עוברי תיקון בparaformaldehyde (PFA):
    1. תקן את העוברים בין שלבי 42 ו -45 (82 ו -100hpf, בהתאמה) על ידי העברתן לצלחת תרבות חדשה 24 גם מכילה 1-2 מיליליטר של MBS 0.1x. תווית את המכסה עם אותו המידע כהגדרת הטיפול שתוארה לעיל (הסעיף 2.2.1).
    2. להסיר כמה שיותר MBS 0.1x מכל טוב שאפשר, ועדיין משאיר את העוברים מכוסים והבטחת קשר מינימאלי כדי למנוע פגיעה. להוסיף 1-2 מיליליטר של 0.05% פתרון benzocaine ב0.1x MBS ולדגור עד עוברים כבר לא מגיבים לגירויים.
    3. להוסיף 1-2 מיליליטר של PFA 4%. לחלופין, למקם את העוברים בצינורות microcentrifuge כותרת לקיבעון, אם מועדפים.
    4. דגירה עובר בPFA למשך 24 שעות ב 4 ° C על שייקר מסתובב. הסר PFA על ידי ביצוע 3-4 שוטף עם PBT במשך 3-5 שעות.

3. מצלם את אזור Orofacial של ראשני צפרדעים

  1. הכנה מראש צילום (זה מתואר באיור 3):
    1. הנח עוברים קבועים בצלחת פטרי גדולה (150מ"מ קוטר) המכיל כ 100 מיליליטר של PBT.
    2. לעשות שני חתכים לנתק את הראש מהגוף (איור 3 א, קווים שחורים מוצקים). ראשון, להחזיק את העובר עם זוג המלקחיים ולעשות חתך בצד האחורי של הבטן עם אזמל סטרילי (איור 3 ב). לעשות חתך שני בצד הקדמי של הבטן, ליד הלב, כדי להסיר את הראש (איור 3 ג) לחלוטין.
    3. פיפטה ניתקה ראשי עובר לתוך צלחת מרופדת חימר (חלק 1.2.2) שימוש בתקן, פיפטה העברה חד פעמית.
      1. עבור תצוגות קדמיות, השתמש בשני זוגות מלקחיים למצב את הצד אחורי ראשי העובר בפנים השקעים עגולים. שימוש במלקחיים כדי לתפעל שני ראש העובר והחימר מסביב, עוברי מצב כזה שהם עומדים בפני המצלמה ואינם מוטים לאחור או לכל צד (איור 3D). דחף בעדינות את החימר מקיף סביב הראש באמצעות מלקחיים ו / או הזכוכיתכלי פיפטה כדי לאבטח את הראש במקום.
      2. לנוף צדדי, להשתמש במלקחיים כדי למקם את הראש עובר בתוך השקעים עגולים כזה שהם בצד שלהם, פונים לאותו כיוון, והם שטוחים נגד החימר. מניפולציות ראש העובר וחימר מסביב כך שבלוטות המלט של כל העוברים מוצבות כלפי מטה באותה הזווית (איור 3E). השתמש בשורות נמשכות עם המחט מתגרה כמדריך כדי להבטיח דיוק, כאשר במדידות לרוחב.
  2. לכידת תמונות של ראש הראשן:
    1. לצלם את הראש של ראשן שימוש בכל מיקרוסקופ לנתח עם מצלמה דיגיטלית שמחוברת לתוכנת המצלמה המקבילה. השתמש בהגדלה הגבוהה ביותר שיכול להיות כל הזמן קבוע לכל העוברים.
    2. מרכז עוברים ולהתמודד עם כולם באותו הכיוון. צלם תמונות באמצעות תנאי התאורה הטובים ביותר שיאפשר לתמונה מדויקת ביותר של אזור orofacial. מיקוםאורות, כדי למנוע צללים מוגזמים. לשמור תמונות כ.tiff קבצים עם הרזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית.

4. מדידה וניתוח מימדי גודל פנים בראשני צפרדעים

  1. למדוד ממדי orofacial (מסוכמים באיור 4):
    1. לקבוע את רוחב הפנים. לזהות את הנקודות בן חלק הגחון של כל עין פוגש פריפריות של הפנים (איור 4 א, ​​חיצים), ולמדוד את המרחק בין נקודות אלה (איור 4 א, ​​קו אדום).
    2. לקבוע את גובה פני. ראשית, לקבוע את קו האמצע על ידי מדידת המרחק בין כל עין וחישוב ציון המחצית. בשלב הבא, לצייר קווים אופקיים המסמנים ביותר קצות הגב של העיניים והגב רוב הנקודה של בלוטת המלט (איור 4, קווים לבנים). על קו האמצע, למדוד את המרחק בין הקווים אופקיים (איור 4, קו אדום).
    3. לקבוע tהוא אזור orofacial. השתמש באותם קווים אופקיים מציינים את קצות הגב של העיניים ובלוטת מלט כדי להדריך את מדידת שטח (איור 4C, קווים לבנים). התחל בנקודה בה הקו האופקי מציין את החלק העליון של בלוטת המלט עומד בפריפריה של הצד השמאלי של הפנים (איור 4Ca).
      1. צייר הקו לאורך הקצה של הפנים המקיפות את העין עד לנקודה שבה הקו האופקי מציין את החלק העליון של העיניים עומד בפריפריה של הפנים (איור 4Cb). תמשיך לעקוב לאורך הקו האופקי ביותר גב זה, עד לנקודה שבה עומדת בפריפריה של הצד הימני של הפנים (איור 4Cc).
      2. עקוב אחר כלפי מטה לאורך הקצה של הפנים המקיפות את העין עד לנקודה שבה הקו האופקי ביותר הגחון סימון העליון של בלוטת המלט עומד בפריפריה של הצד הימני של הפנים (איור 4Cd). תמשיך לעקוב לאורך UNT הקו הזה התחתון האופקיil הוא עומד בנקודה שבה מעקב החל. השתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי לחשב את השטח בתוך המעקב.
    4. לקבוע את אורך החוטם. על תמונות לרוחב, להפוך את קו אנכי שמסמן את הקדמית של העין. בשלב הבא, למדוד את המרחק האופקי מרוב הנקודה הקדמית שבו הפנים עומדים בקצה הגב של בלוטת המלט לקו האנכי לציון הקדמי של העין (איור 4D).
    5. לקבוע את רוחב הפה. מדוד את המרחק האופקי בין נקודות ימין ועל שמאל שבו "שפתיים" העליונה והתחתונה של פגוש הפה פתיחה (איור 4E). אלה יכולים להיחשב שווה ערך צפרדע commissures שְׁפָתִי.
    6. לקבוע את עגלגלות הפה. לחשב את הפה עגלגלות כיחס היבט הפוך שבו (4   ×   [האזור]) / (π   ×   [ציר מרכזי] 2 >).
      1. השתמש בכלי לאסו בצילום עורך להתחקות הקצוות של פתיחת הפה, כפי שמוצג באיור 4F. בחר לנתח בסרגל הכלים הראשיים, ולבחור למדוד. לחלופין, לחשב עגלגלות מהמדידה של שטח וקוטר של פתיחת הפה.
  2. ניתוח נתונים של ממדי פנים:
    1. קלט המדידות של ממדי פנים לתכנית ניתוח נתונים להשוואת קבוצת הטיפול עם השליטה. לקבוע את הממוצע של כל מדידה עבור שני קבוצות ניסוי ובקרה ליצירת גרפים בר. לקבוע סטיית תקן על מנת ליצור שורות שגיאה. לבצע מבחני t של הסטודנט לבחינה סטטיסטי השוואה בין קבוצות.
      הערה: מידע זה יכול להיות די משתנה בשל השיעורים שונים מעט של פיתוח בין עוברים.

5. ניתוח כמותי של צורת Orofacial וMorphometrics

  1. ציוני דרך מקום וCreaקובץ te ציון הדרך לתאם (באיור 5 א).
    1. בחר ציוני דרך כזו שהם ללכוד את הצורה של תמונת היעד, וניתן להציב שוב ושוב באותו מיקום יחסי בכל הדגימות מנותחות. אם מבנה אינו קיים בכל הדגימות, אל תניח לנקודת ציון במבנה זה.
      1. כאן, מקום 24 ציוני דרך לייצג את midface עם סימנים מזהים כגון עיניים, נחיריים, ופה. לעקביות, מקום ציוני הדרך באמצע הדרך בין ציוני דרך הונחו בעבר (למשל, ציוני דרך פה, איור 5Ai).
    2. ללכוד קואורדינטות נקודת ציון וליצור "ציון הדרך לתאם קובץ". פתח את התמונה הראשונה של פנים ראשן (לדוגמא, את עובר השליטה הראשון).
      1. בחר בכרטיסייה התוספים בסרגל הכלים הראשיים ולבחור Pointpicker מהתפריט הנפתח. בחר את ציוני דרך כרטיסיית הוספת נקודות ומקום במקומות רצויים כציוני דרך יופיעו כצלבים צבעוניים ( איור 5Ai).
      2. הזז מקומות ציון דרך לאחר מיקום על ידי בחירת כלי צלבי העבר. כאשר כל ציוני הדרך הוצבו על התמונה, בחר בכרטיסיית תוצאות תצוגה בסרגל הכלים הראשיים ולבחור הצג (איור 5Aii) כדי להציג את קואורדינטות אתר ולהעתיק לתכנית גיליון אלקטרוני (איור 5Aiii).
      3. בעת הדבקת קואורדינטות אלה מעוברים הראשונים לתכנית גיליון אלקטרוני, להשאיר שורה ריקה מעל לנתונים. בטור ב 'בשורה זו ריקה (שורת 1), "LM =" סוג עם מספר ציוני דרך במדגם. הנה, הזן "LM = 24" מאז 24 ציוני דרך נוצרו (איור 5Aiii, תיבה אדומה).
      4. בשורה מתחת לנקודתי נתונים, הסוג "id =" עם שם זיהוי המדגם. כאן באיור 5Aiii, הזן "ID = CON1", מאחר שזו נקודת הציון לתאם נתונים של עובר השליטה הראשון (איור 5Aiii, חץ אדום).
      5. חזור על תהליך זה עם פניהם של כל עובר בניסוי (הניסוי וביקורת) עד שכל קואורדינטות נקודת הציון כבר נכנסו לתוך הגיליון האלקטרוני.
        הערה: חשוב שכל עובר ניתן שם ייחודי ב" = זיהוי "השורה. הנה לדוגמא, הסדרה הבאה של קואורדינטות נקודת ציון ניתנת תעודת הזהות של "CON2" שכן הוא היה העובר השני בקבוצת הביקורת.
      6. העתק את העמודות השניה ושלישית כולו למסמך טקסט ולשמור כקובץ txt.
  2. הגדר את תוכנת מורפומטריות לניתוח נתונים (באיור 5 ב).
    1. כאן, בחר באפשרות צור נתונים חדשים סט בתפריט הראשי בתוכנה morphometric. תן שם לקובץ והנתונים שנקבעו בתיבות המתאימות (לדוגמא, "חומצה הרטינואית עיכוב" ו- "ציוני דרך פנים", בהתאמה) במסך הקופץ (איור 5Bi). לייבא את הקובץ כפי TPS, וselect קובץ הטקסט של קואורדינטות ליצור מערך נתונים (איור 5Bi, חץ אדום).
    2. יישור נתונים ופרוקרוסטס להתאים:
      1. בצע פרוקרוסטס כושר ויישור. סמן את הנתונים שנקבעו בכרטיסיית פרויקט העץ, לבחור פעולות הכנות בסרגל הכלים הראשיים, וניו Fit סדום בתפריט הנפתח.
      2. בחר יישור על ידי ציר ראשי ובחר לבצע פרוקרוסטס Fit בחלק התחתון של התיבה (איור 5Bii, חץ אדום). חזור להקדמת תפריט נפתחת, בחר באפשרות צור שונות המשותפות מטריקס (איור 5Biii), ובחר לבצע.
      3. הצג את המתאמים של מטריקס השונה המשותפת בכרטיסיית התוצאות.
    3. צור "קובץ מסווג" על ידי הקצאת כל דגימה בנתונים מוגדרים משתנה מסווג המקום להבחין אם הוא משתייך בקבוצת הניסוי או לקבוצת הביקורת.
      1. תוויות לשתי עמודות בגיליון אלקטרוני. תווית הכותרת של קולום הראשוןn עם "תעודת זהות" וקלט של אותו המזהה הניתן לכל דגימה (לדוגמא, CON1, RARINHIB1, וכן הלאה; איור 5Biv). תווית הכותרת של העמודה השנייה עם "טיפול" וקלט לתוך כל תא קבוצת הטיפול שמתאימה למדגם הרשום בתא מזהה הסמוך.
      2. כאן, להשתמש במדבקות "מעכב השליטה וRAR" כמסווגים (איור 5Biv). העתק לקובץ טקסט ולשמור כקובץ txt. משתני יבוא מסווג לתוכנת morphometric. בחר התאמה על ידי מזהה, ופתח את קובץ הטקסט (איור 5Bv).
  3. צור עלילת פיזור ניתוח מרכיבים עיקרי (PCA) על ידי בחירה בתפריט הנפתח של הווריאציה והבחירה עיקרי רכיב ניתוח (איור 6Ai). בשלב הבא, בחר בכרטיסייה הגרפיקה כדי לראות שלוש לשוניות נוספות: שינויי צורת מחשב, ערכים עצמיים, וציוני מחשב (איור 6Aii). ציוני PC הכרטיסייה מציגה בivariate scatterplot המרכיב העיקרי של נתוני ציון דרך בכושר סדום (איור 6Aii).
    1. כדי לשנות את המרכיבים עיקריים הם זממו, להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה ובחר את הציר הרצוי לשנות (איור 6Aiii, חץ אדום).
    2. בחר בכלי נקודות צבע נתונים (איור 6Aiii). מסווגים בחר יובא קודם (סעיף 5.2.2) בתפריט הנפתח השני שמופיע כדי לקבוע את הצבע של כל קטגוריה (איור 6Aiv).
    3. להציג את כמות שונות שנתפסה על ידי כל אחד ממרכיבים העיקריים בכרטיסיית התוצאות (איור 6Av). גרף יצוא כקובץ .bmp.
  4. צור רשת שינוי ניתוח פונקצית מבחין (DFA) בתוכנה מורפומטריות ידי בחירת ניתוח פונקצית Discriminant תחת לשונית ההשוואה (איור 6Bi). בתפריט המוקפץ, להבטיח כי בסיס הנתונים המתאימים הוא selected ואת סוג הנתונים הוא קואורדינטות פרוקרוסטס-כושר.
    1. סמן את הזוגות של קבוצות להשוואה, ולהפעיל 1,000 בדיקות תמורה (איור 6Bii).
    2. תחת הגרפיקה, לצפות במפת הווקטור של הקואורדינטות בכרטיסיית הבדל צורה (איור 6Biii). אם התמונה היא הפוכה, להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה להעיף את התרשים בכיוון הנכון (איור 6Biii).
    3. כיוון הווקטורים משקף את פער צורה מהקבוצה הראשונה בהשוואה לשנייה, אשר מוצג בתפריט פונקציות Discriminant לפני הפעלת הניתוח (איור 6Bii). להפוך את הכיוון של הווקטורים, להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה ולשנות את הסימן של גורם קנה המידה, כך שהוא שלילי (איור 6Biii, ד). הערך של הערך בקנה מידה מוגדר בפקטור של עשר בצורה הטובה ביותר מייצגת את ההבדלים הסטטיסטיים בעמדת ציון דרך between שתי קבוצות ללא עיוות, ובדרך כלל נשארים בברירת המחדל (איור 6Biv).
    4. כמו כן, בתפריט המוקפץ, לשנות את הגרף לרשת שינוי כדי להרכיב את הווקטורים על רשת (איור 6Biii, v).
    5. ציין את מספר הקווים אופקיים ואנכיים של הרשת בתפריט המוקפץ (איור 6Biii, v).
    6. לייצא את הגרף כקובץ .bmp.
    7. צפה מרחקי סדום וMahalinobis וp-ערכים תחת לשונית התוצאות (איור 6Bvi).
  5. ניתוחי morphometric נוספים כי הם שימושיים להערכת קבוצת טיפול יותר מפעם אחת
    1. צור רשת שינוי ניתוח המרכיבים ראשי. צורת המחשב משנה כרטיסייה מציגה את מפת הווקטור של שינויי צורה והיוו את שונות בתוך כל קבוצת מדגם. השתמש בתפריט המוקפץ במגרש בשטח כדי לכוון את התמונה כראוי ולהרכיב וקטורים על רשת שינוי. הגדר את גורם קנה המידהלערך על ציר x של גרף ציוני מחשב שמתאים למרכז המשוער של קבוצת הביקורת. לייצא את התמונה כקובץ .bmp.
    2. צור scatterplot CVA. בכרטיסיית ההשוואה בסרגל הכלים הראשיים, בחר Canonical משתנה ניתוח, ולהאיר את הסט משתנה מסווג שיובא בעבר (ראה סעיף 5.2.3). בחר 1,000 חזרות לבדיקות תמורה, ובחר הפעלה. בחר בכרטיסייה ציוני קורות חיים כדי להציג scatterplot CVA bivariate. זה מקודד לפי צבע המבוסס על מסווגים נטען. לשנות את ערכת צבעים על ידי הבאת את התפריט המוקפץ במרחב העלילה (ראה סעיף 5.3.3). יצוא כקובץ .bmp.
    3. צור רשת שינוי CVA. רשת שינוי של תוצאות CVA יכולה להיות שנוצרה בעת ההשוואה יותר משתי קבוצות. בכרטיסיית הגרפיקה, לבחור משנה את צורתו קורות חיים כדי לחזות את רשת השינוי של קואורדינטות נקודת הציון. להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה לשנותהכיוון של הווקטור, להרכיב תוצאות על רשת שינוי, ולציין את מספר קווי הרשת. לייצא את הגרף כקובץ .bmp.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, ניתוח כמותי של גודל orofacial וצורה הודגם להשוות עוברים שטופלו במעכב חומצה רטינואית קולט (מעכב RAR) לבקרה שלא טופלה. טופלו עוברים עם ריכוז 1 מיקרומטר של מעכב כימי זה משלב 24-30 (26-35 hpf), נשטף החוצה, וקבוע בשלב 42 (82 hpf). לאחר מכן הם עובדו ונותחו כמתואר בפרוטוקול. תוצאות הן הנתונים מקוריים, אך עולה בקנה אחד עם תצפיות בפרסומים קודמים 2,3. טופלו עובר בקרה עם הרכב, DMSO, והתפתחתי באופן נורמלי (איור 7Ai, ii). עוברים שטופלו בריכוז 1 מיקרומטר של מעכב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

laevis Xenopus הפך לכלי שימושי עבור לנתח מנגנוני התפתחות פיתוח orofacial בסיס; עם זאת, אין כיום פרוטוקולים מתארים גודל ובצורה של שינויים באזור זה בצפרדעים. השיטה המתוארת כאן תתרום באופן משמעותי לתחום של פיתוח orofacial כך שהוא מאפשר לכימות קפדני יותר של פנוטיפים orofacial בצפרדעים ובעלי חוליות אחרות.

ההיבט הראשון, הקריטי ביותר של ביצוע פרוטוקול זה כמו שצריך הוא היכולת למדוד ממדי פנים ולקבוע את מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

כספים סטארט-אפ לא דיקינסון מVCU תמכו בעבודה זו.

המחברים מבקשים להודות דן Nacu לכשרון האמנותי שלו ביצירת האיור סכמטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ ניתוחZeissמצויד במצלמת AxioCamICC1
Dumont #5 מלקחיים InoxFine Science Tools11251-10
אזמל סטרילי וחד פעמיSklar06-2015
צלחת 24 בארותFisher Scientific087721
פיפטות העברה חד פעמיות סטנדרטיותפישר סיינטיפיק13-711-7M
צלחות פטרי 150 מ"מ x 15 מ"מ
פלקוןמוגדר ל-15 מעלות; C או 20 מעלות; C
דוגמנות חימרPremo, או חימר דוגמנות לא רעיל אחרבשחור או לבן
חולץ מחט: P-97 חולץ מיקרופיפטה בוער/מפוצץ נימה: FB300Bעבור חוטים, השתמש בחוטי קופסה מרובעים של Sutter 3.00 מ"מ, ברוחב 3.0 מ"מ.
PipettemenGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CysteineSigma-Aldrich52-90-4
אבקת ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
מנות פטריFalcom353003, 351058קוטר 100 מ"מ וקוטר 150 מ"מ
100% אתנולVWR89125-170
אינקובטורים 351058 מחט התגרות ישרה Thermo Scientific 19010 צינורות נימיים (למחטים) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ ID/סיבים, 100 מ"מ כל אחד חולץ מחטים, דגם P-97 Sutter Instrument Co.

מקורות

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Xenopus
כימות Orofacial פנוטיפים ב צפרדעים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.