מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Summary

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

Abstract

דג הזברה הפכה אורגניזם מודל בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ביולוגיה התפתחותית ולמחקר של מחל מחלות של בני אדם בשל המידה הניכרת של שימור גנטי בבני אדם. גנטיקה כימית כרוכה בבדיקת ההשפעה שיש לי מולקולות קטנות בתהליך ביולוגי והופכת לשיטת מחקר translational פופולרית לזהות תרכובות טיפוליות. דג הזברה פונה באופן ספציפי לשימוש עבור גנטיקה כימית בגלל היכולת שלהם לייצר אחיזה גדולה של עוברים שקופים, שמופרים באופן חיצוני. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים להיות בקלות בסמים מטופלים על ידי התוספת הפשוטה של ​​מתחם לתקשורת העובר. שימוש בכל הר הכלאה באתר (רוצה), ביטוי mRNA ניתן בבירור דמיין בתוך עוברי דג הזברה. יחד, בעזרת גנטיקה כימית ומאחלים, דג הזברה הופכת הקשר האורגניזם שלם חזק בו כדי לקבוע את סלולארי ופיזיולוגיהשפעות של מולקולות קטנות. התקדמות חדשנית נעשתה בטכנולוגיות שעושות שימוש בהליכי מיון המבוסס על מכונה, אך למעבדות רבות אפשרויות כגון אינן נגישות או להישאר עלות אוסרני. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע מסך מדריך לתפוקה גבוהה כימי גנטי שדורש משאבים בסיסיים ויכולים להתבצע על ידי צוות בודד או קטן אחת בתקופה יעילה של זמן. כך, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה אפשרית שיכול להיות מיושמת על ידי קבוצות מחקר לבצע גנטיקה כימית בדג זברה, אשר יכולה להיות שימושית להשגת תובנות יסוד לתהליכים התפתחותיים, מנגנוני מחלה, ולזהות תרכובות חדשות ומסלולי איתות שיש לי יישומים רלוונטיים מבחינה רפואית .

Introduction

זיהוי של סמי מרפא יעילים לטיפול במחלה אנושית הוא סוף המשחק להרבה חוקרים ביו-רפואיים. בעוד זיהוי והאפיון של סוכנים תרופתיים פוטנציאל ליישומים קליניים יש ערך ברור לבריאות, היא נותרה אתגר משמעותי. סופו של דבר, את הפיתוח של תרכובות רבות טיפוליות מגיע מהידע של איך סוגי תאים מסוימים או לפתח או פונקציה. דג הזברה, Danio rerio, היא חוליות מים מתוקים של משפחת Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל הזרם המרכזי בביולוגיה התפתחותית ^1. דג הזברה הן גנטי חוליות צייתניות כי הם קל לשמור ולטפל במחקרים מדעיים ^2,3. עוברים דג הזברה הוא שקוף, מופרה חיצוני, ויכול להיות מיוצר על ידי מאות מזוג הזדווגות מבוגר יחיד בשבוע ^2,3 בלבד. יתר על כן, מערכות דג הזברה מניות עיקריות באיברים ויש ד גדולegree של דמיון גנטי ליונקים, כולל בני אדם ^4. באופן מפתיע, 70% מהגנים באדם יש orthologue דג הזברה ^4. בשל דמיון זה, דג הזברה הייתה מערכת ניסיונית רלוונטית ביותר לחקר המנגנונים של התפתחות חוליות ופיזיולוגיה, והיית מועסק לשחזר מספר רב של מחלות בבני אדם ^5-7. מסיבות אלה, בין השאר, הפכו את המועמד אידיאלי דג הזברה להמשך חקירות גנטיות והביאה לייסוף במגמת עלייה מתמדת לשירות של דג הזברה במחקר ביו-רפואי ^6,7.

במהלך העשורים האחרונים, שפע של כלים גנטיים פותחו בדג הזברה. הגנום דג הזברה ניתן לmutagenesis וtransgenesis ^3. עד כה, שפע של קדימה לאחור מחקרים גנטיים בוצעו, הוביל לדור של מעל 9,000 מוטציות ^3. יתר על כן, קווים מהונדסים רבים יש להיותen יצר, אשר איפשר התיוג ובידוד של סוגי תאים מסוימים ^3. היו מאמצים מתמשכים משמעותיים לרכז ולחלק את המשאבים הללו לקהילת המחקר, אשר נגישים למעבדות בעלות נמוכה למדי באמצעות מרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (Zirc) ^8. יתר על כן, מאגר נרחב של מידע ביולוגי וכלים מולקולריים, הנעים בין דפוסי ביטוי גנים לMorpholino רצפים ופרוטוקולים, כבר מבואר בהדרגה ברשת הזברה המידע (ZFIN) ^9-11. תשתיות מחקר דג הזברה אלה מתאפשרות באמצעות תמיכת NIH משמעותית וסנגור של מודל זה חי ^8. מטמון זה של מוטנטים דג הזברה, קווים מהונדסים, ומידע רלוונטי ממשיך להיות של ערך יוצא דופן לקהילת המחקר הביולוגית בכללותו. עם זאת, בזמן שדג זברה היא עכשיו אורגניזם מודל מבוסס היטב ומראש יחסנים, הם מייצגים להrgely מאגר שלא נוצל ללמוד ביולוגיה ומחלות התפתחותיות באמצעות השימוש במסכים גנטיים כימיים.

גנטיקה כימית היא השימוש במולקולות קטנות, כגון תרופות או חומרים אחרים, כדי להשפיע על תהליך ביולוגי בתוך מערכת חיים ^12. יכולה להיות מיושמת גנטיקה כימית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד גן, כגון לזהות סוכני הצלה שאו להחמיר פגם גנטי ספציפי ^12. יתר על כן, גנטיקה כימית מייצגת שדרת אחת גדולה בכדי לבצע מחקר translational ^12. בעוד מסכי גנטיים קדימה מסורתיים במודלים של בעלי חיים היו מאוד חזקים בקישור גנים ספציפיים למחלות, שאין להם ממד זמן, ולכן קשה או לפעמים אי אפשר לצפות פנוטיפים שיקומו לאחר עובר מוקדם. בנוסף, יתירות גן יכולה להפוך את התוצאות שנצפו מגנטיקה קדימה קשה לפרש. לחלופין, מסכי גנטיים כימייםלאפשר לשליטה זמנית בסדר ובו זמנית מספק נקודת התחלה רבת ערך לגילוי סמים ^12,13.

ניתן לבצע גנטיקה כימית באמצעות במערכות חוץ גופית (לדוגמא, שורות תאים, חלבונים) או באמצעות מערכת in vivo, כגון האורגניזם כולו. שימוש במערכת במבחנה לגנטיקה כימית יכולה להיות מועילה, כי זה פשוט יותר מאשר מערכת האורגניזם שלמה, קל יותר לעבוד עם בקנה מידה גדול, פחות יקר, ופחות זמן רב. כתוצאה מכך, במבחנה מערכות מאפשרות לשניהם תפוקה גבוהה הקרנה (HTS) וגבוהה הקרנת תוכן (HCS). יש מספר היתרונות לשימוש במערכת במבחנה שיש לשקול בעת התקרבות גנטיקה כימית, אלא גם מגבלות משמעותיות. מגבלה עיקרית אחת לשימוש בשורת תאים היא שמולקולות קטנות יכולות להיות יעילות ולא רעילים בשורת תאים ספציפית, עדיין להיות רעיל כאשר הציגו את האורגניזם כולו. כך, עיקרמהעניין הוא שבמבחנת מערכות אינן ממצות את ההקשר הרחב של האורגניזם ובשל כך אינן תמיד מסוגל לחקות במדויק את מה שקורה באורגניזם שלם. בעוד בדיקת מתחם בכל האורגניזמים יכולה לעקוף בעיות אלה, השימוש במודלי האורגניזם שלמים יונקים מציב מספר המגבלות פיזיות ומוסריות. לדוגמא, הקרנת סמים בעכבר מתעכבת מבחינה לוגיסטית על ידי המרחב וההוצאות הדרושים כדי לבדוק גודל מדגם הולם. בנוסף, שאלות התפתחותיות יכולות להיות קשות ללמוד, בשל העובדה שהיונקים להתפתח ברחם. לבסוף, בעוד שההתנהלות של מחקר הביו-רפואי יש ערך חברתי עצום, יש בכל זאת צרכי משמעותיים כדי להגן על רווחת בעלי חיים על ידי הגבלת לימודים אינטנסיביים והקלת הכאב וסבל של בעלי חיים המשמשים למחקר. דג הזברה תהווה תחליף בר-קיימא לעבודה עם חוליות גבוהות כמו יונקים, ויתר על כן, ניתן ללמוד נושאים רבים באמצעות גנטיקה כימית בהשלבים העובריים וזחל כאשר עיבוד נוירולוגיות נעדר או אופרטיבי ברמה נמוכה ^12,13.

עד כה, מספר עצום של מסכי גנטיים כימיים בוצעו שימוש בעוברי דג הזברה בפרט, כמסירת מתחם יכולה להיות מושלמת על ידי שיקוע של עוברים בתקשורת המכילים את התרופה של העניין ^12-15. יתר על כן, הייתה התקדמות מדעית וטכנולוגית רבות כדי להפוך את המסך גנטי כימי אפשרי והניהול ^16-20. פיטרסון ועמיתיו היו הראשון שהשתמש בדג זברה במסך גנטי כימי בשנת 2000, ומאוחר יותר בשנת 2004 זוהה תרכובת שדוכאה מוטציה קוארקטציה של אב העורקים ^ב21,22 דג הזברה. מסכי כימיים מאז יושמו ללמוד כמה רקמות מתפתחות (לדוגמא, לב, דם, כלי) ^23-25, פונקציות פיסיולוגיות (למשל, בסיס הנוירולוגי להתנהגות) ^26, התחדשות מבוגרת ^27,28, וdiseas מודלים דואר (לדוגמא, מחלת ניוון שרירים וסרטן) ^29,30. מבין המסכים כימי דג הזברה אלה, הגילוי שפרוסטגלנדינים להסדיר בתאי גזע hematopoietic נלקח לניסויים קליניים בבני אדם, הממחיש את הכח לעבור מ" טנק למיטה ^"23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). לאחרונה, תרופות מועמד מבטיחים צמחו לאיברים מורכבים כמו הכליות, שתקנו פתולוגיה הסלולרית במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) ³⁴ וניזק כלייתי חריף ^27,35, אם כי אלה עדיין לא לעבור לניסויים קליניים. מסכי גנטיים הכימיים אלה באופן רחב להדגים את התועלת של בדיקת תרכובות קטנות של דג הזברה פיתוח והיכולת ליישם את גנטיקה כימית לחקור תפקוד רקמות בוגר. יתר על כן, יש רשימה הולכת וגדלה של אוספי פרמקולוגיה זמינים מסחרי הניתנים ללימודים אקדמיים ^19.

ove_content "> בשנים האחרונות, חל התקדמות בולטת בטכנולוגית סינון גנטית כימית, כוללים השימוש במערכות אוטומטיות של רובוטים מחלק סמים וטיפול, יחד עם מערכות הדמיה אוטומטיות ^36-38. מערכות כאלה מאפשרות לאפשרות של בדיקת אלפים רבים של תרכובות להשיג שני HTS וHCS ^36-38. למרבה הצער, ההתחייבות של מסכי גנטיים כימיים עם ארגונים רובוטית החדשניים אלה בדרך כלל דורשות משאבים רבים. משאבים אלו סוגי מכשול משמעותי למוסדות רבים שאין להן ההון כדי לרכוש , תתפעל, תתחזק ומכשור כזה. בזמן הקמת התשתית לטיפול רובוטית של ספריות כימיות, ובכלל זה העברת עוברים לערוכות צלחות, נשאר עלותו למעבדות רבות, הדמיה ממוחשבת, ובניתוח היא בדרך כלל נגישה יותר ^12. הקרנת תמונה אוטומטית מאפשרת כימות מחדש מהונדס ניאוןסבלים ומאפשרים ניתוח פנוטיפי הספציפי ^12,15.

למרות שמערכות אוטומטיות מייצגות התקדמות טכנולוגית שימושית, ניתן לטפל שאלות רבות על ידי מסכי מדריך לממוקדים יותר, כגון השאילתה של כמה אלף תרכובות פעילות ביולוגית על תהליך התפתחותי עם כל הר הכלאה באתר קריאה (רוצה) ^39. יתר על כן, בעוד שמספר הולך וגדל של מעבדות לגייס לעזרתם מסכי כימי דג הזברה לחקור שאלת מחקר, כמה הרוויה ונושאים רבים (אם בכלל) מאמצים הגיעו טרם נפרצו בעזרת גנטיקה כימית. ניתן לבצע מסכי כימיים באמצעות מושבה דג הזברה קטנה המכילה רק כמה סוג בר או טנקים מהונדסים. לכן, זה סוג של חקירה גנטית צריך להיות בר-השגה על ידי רוב קבוצות מחקר דג הזברה מעוניינת להרחיב / גיוון לזירה זו. ספריות כימיות בגדלים שונים יכולות להיות רכש ממפיץ ו / או col מסחרייםlaborators. מסיבות אלה, גנטיקה כימית יכולה להיות כדאי מבחינה כלכלית גם באקלים מימון קשה. עם זאת, ישנם מכשולים למתחילים מסך גנטיקה כימית, כגון איך לתכנן היבטים לוגיסטיים של המסך: למשל, באופן ידני דגימות תהליך של מצבת כוח האדם הדרוש למסך מוצלח, הקצאת הזמן הייעודי ולצרף יחד פרוטוקול פיזי מספר שממאה לכמה אלף. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעובר דג הזברה עם רצון כמו קריאה מתוך. שיטה זו כרוכה טיפול תרופתי של עוברי דג הזברה, ואחריו זיהוי riboprobe של תעתיקי mRNA. שימוש בפרוטוקול זה, צוות קטן או אפילו אדם אחד יכול להקרין באופן סביר ולנתח ספרייה כימית צנועה כ -600 תרכובות בפרק הזמן של 9 שבועות.

Protocol

הנהלים לעבודה עם דג הזברה שתוארה כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת נוטר-דאם. מדריך לעיצוב המחקר למסך זה במדריך קטן מולקולה בדג הזברה מסופק (איור 1). סקירה של השיטות שתוארו בפרוטוקול זה מסופקת כתרשים זרימה (איור 2). אנא עיין במערכת דוגמא התיוג (איור 3) לתכנן את צעדי עיבוד העובר מתוארים בחלקים 4-10. לאחסון הזמני של עוברים, עיין בסדרת בימוי דג הזברה ^40, ולהכנת riboprobes antisense משאלה בשימוש בחלקים 9-10, מתייחס לשיטות שפורסמו לאחרונה ^41.

1. הכנה של לשכות הזדווגות דג הזברה

1. הנח דג הזברה זכר בוגר ודג זברה נקבה בוגרת לתא הזדווגות, מופרד על ידי O תא המחיצה / N.
   הערה: הזדווגויות המוניות, כגוןזה קבוצות באמצעות אלה של 2-3 נקבות וזכרים 2-3 יכול ליצור עובר יותר בהשוואה להזדווגויות לזווג אחד, וניתן לבצע עם תאי הזדווגות בגודל המתאים.
2. חזור על שלב 1.1 כך שסך של 25 זוגות של דג הזברה היא הגדרה לכל צלחת גם 96 של מולקולות קטנות, שתעמוד למבחן.

2. אוסף של עוברי דג הזברה

1. למחרת, להסיר את המחיצה שמפרידה בין כל זוג דגים ואחרי שעה 1, לאסוף עוברים דג הזברה באמצעות מסננת עדינה ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה בינוני עובר E3 (ראה רשימת חומרים למתכון).
   הערה: עוברי איסוף לאחר שעה 1 מבטיחה שהם עוברים בשלבי התפתחות דומים.
2. השתמש פיפטה העברה פלסטיק כדי להסיר שאריות (למשל, מזון ופסולת מוצקה). לאחר מכן, השתמש סטראו להתבונן כל מצמד של עוברים ולהסיר כל ביצים מופרה.
3. למזוג תקשורת עובר E3 ולהחליף עם E3 הטרי, ואז למקם את כל dish של עוברים בC חממה 28.5 מעלות. לאחר 2 שעות להתבונן כל מצמד של עוברים באמצעות סטראו ולהסיר כל ביצים מופרה.
   הערה: ביצים מופרה יכולות להרעיל עוברים אחרים ותופענה להיות בשלב התא הבודד או אטום.
4. המשך לעקוב אחר ההתקדמות התפתחותית של עובר באמצעות סטראו עד שהם מגיעים 40% epiboly. שים לב לצורת הכדור של העובר שנראה כמורכב משתי שכבות נפרדות ב-40% שלב epiboly ^40.

3. כימי דילול הכנה

1. הסר את צלחת הספרייה הכימית מאחסון ב -80 מעלות צלזיוס, לכסות אותו עם נייר אלומיניום ולהפשיר אותו בRT.
   הערה: ספריות שונות תהיה להפשיר בשיעורים שונים בהתאם בעיקר על הממס בשימוש. בדרך כלל, ספרייה כימית קפואה ב -80 מעלות צלזיוס תהיה מופשרת לחלוטין בכ 3 שעות ב RT. צלחת הפשרת חנות (ים) במקום בטוח עם תיוג חומרים מסוכן מתאים. תלבשמשקפי ppropriate, מעיל מעבדה, ושני סטים של כפפות בעת טיפול בכימיקלים.
2. השתמש בפיפטה רבה 8 ערוץ להוסיף 99 μl של E3 בטורים 2-12 של צלחת גם 96.
   הערה: מהניסיון שלנו, מגוון תרופה מתחיל מתאים הוא בין 10 מיקרומטר - 50 מיקרומטר, וגם כפי שמתואר בפרוטוקולים הנוכחיים ^39. כאן אנו מדגימים טיפול 10 מיקרומטר אם באמצעות צלחת מניית ספרייה כימית 1 מ"מ.
3. השתמש בפיפטה רבה 8 ערוץ להוסיף 1 μl של כל מתחם ולהתאמתה עם E3.
4. השתמש P10 פיפטה 1 μl של DMSO (או הממס המתאים) בטור השליטה (כאן, עמודת 12).
5. מכסה את צלחת הדילול הכימית ברדיד אלומיניום, כמו נייר האלומיניום יגן על כל תרכובות רגישות לאור בספרייה, ולהחזיר את צלחת הספרייה כימי המניה ל-80 ° C עבור אחסון.

4. עֲרִיכָה עוברי דג הזברה

1. בחר בצלחת פטריהמכיל עובר דג הזברה ב-40% שלב epiboly. בעזרת פיפטה העברה, בזהירות במקום כ -10 עוברים בתוך כל טוב של (1.1 מיליליטר) צלחת גם עמוקה 96. לוותר עוברים בטורים 2-12 של הצלחת גם העמוקה 96.
   הערה: החוקר צריך לבחור את נקודת הזמן של בנוסף תרופה שמותאמת הכי טוב לתהליך התפתחותי שהם רוצים לחקור. שימוש בpipet העברת פלסטיק יכול למזער את נזק עובר. מאז epiboly לפני 40% טיפול תרופתי יכול לגרום הקטלניות עובר גדלו, לפתח את העוברים לזמן רבים יותר לפני חשיפה לסמים, במיוחד כאשר תהליכים התפתחותיים מאוחר יותר נבדקים. הצבה של יותר מ15-20 עוברים בכל טוב יכול להוביל לעיכוב התפתחותי עקב צפיפות ויש להימנע. חשוב לציין כי הצלחת גם 96 העמוקה המכילה את העוברים שונה מהצלחת גם דילול הכימי 96.
2. השתמש פיפטה העברת זכוכית כדי להסיר E3 עודף מכל טוב, ולגרש את E3 העודף למיכל פסולת נוזלי.
   הערה: תהליך זה בדרך כלל לוקח 30 דקות עד 1 שעה כתלות במהירות של החוקר, כך הם עוברים בין 50% וepiboly 60% על ידי השלמה, המהווה את השלב ההתפתחותי היעד לתוספת של הדילול הכימי שתואר כאן. הצלחת יכולה להיות מוטה בזווית של 45 מעלות כדי לגרום לעוברים ליפול לתחתית הבאר, כך שקצה פיפטה ניתן נלחץ תחתית הבאר לצייר את E3 העודף.

5. תוספת של טיפולים כימיים

1. השתמש בפיפטה רבה 8 ערוץ להעברה 100 דילולים הכימיים μl לבארות שלהם בצלחת גם 96 העמוקה המכילה עובר דג הזברה ערוך.
   הערה: ודא שהמיקום גם המקורי של מתחם תוצאות עם המיקום טוב בצלחת המקבילה העמוקה 96 היטב (למשל, המיקום טוב B1 בצלחת הדילול הכימי pipetted למיקום גם B1 בעמוק96 צלחת גם).
2. להרטיב מגבת נייר ומניח אותו לתוך מיכל רגיש לאור גדול מספיק כדי להכיל צלחת גם 96.
   הערה: מגבת נייר הרטובה תעזור למנוע אידוי של הדילול הכימי.
3. לאחר מכן, השתמש מחצלת איטום לאטום את הצלחת גם 96 העמוקים, למקם אותו לתוך המכל רגיש לאור, ודגירה אותו על 28.5 מעלות צלזיוס.
   הערה: תן לעוברי דג הזברה מתפתחים עד למחרת בבוקר. לחלופין, לתת לעוברים להתפתח עד השלב ההתפתחותי המתאים לתהליך להיות מנותח.

6. ההסרה של כימיקלים

1. השתמש בפיפטה רבה 8 ערוץ להוסיף 300 μl של E3 לכל שורה של בארות התרופה שטופלה. צייר ותשאיר הדילול / כימי E3 מכל שורה של בארות. לשטוף את העוברים 3 פעמים עם 300 μl של E3.
   הערה: מחק תרופת פסולת במכל שכותרתו משמש רק למטרה זו. על מנת להקל על שטיפה, השתמש באגן זכוכית מלא בE3 רחב מספיק כדי להשתמש multפיפטה ichannel.

7. Pronase ותיקון עוברי דג הזברה

1. העבר את עוברי דג הזברה באמצעות פיפטה העברה פלסטיק לארבע 24 צלחות גם, הסר את כל עוברים מתים. לייבל 24 צלחות כל כך טובות שהם מתאימים למקומות גם תרופה המקוריים. הנח את פיפטה מול רקע כהה לאחר כל העברה גם לדמיין עוברים בפיפטה ולמנוע מוצלב גם עובר.
2. השתמש פיפטה העברה פלסטיק לצייר את E3 כך עובר בקושי שקועים בנוזל.
3. השתמש פיפטה זכוכית להוסיף 2 טיפות של מניית pronase (50 מ"ג / מיליליטר) זה טוב. בואו עוברי דגירה בpronase למשך 5 דקות ולאחר מכן להתסיס את הבארות כדי לגרום סיסית להתפרק. לחלופין, Pronase העוברים לפני שהם נמצאים בשלב ההתפתחותי הרצוי לניתוח.
4. השתמש פיפטה העברה פלסטיק כדי לשטוף את העוברים פעמיים עם E3.
5. ברגע שהם עובר בשלב הרצוי של הניתוח, completely לצייר ותשאיר E3 שנותר.
6. השתמש פיפטה העברה פלסטיק להוסיף טרי PFA 4% / PBS היטב כל אחד. דגירה עובר על 4 CO ° / N לתקן. השתמש מופשר טרי PFA בתחילה לתקן את העוברים.
   הערה: המשך לבצע assay מסך עניין שלך. מפורט כאן בסעיפים 8-10 הוא הליך לעבד צלחות מסך עם הרצון. ניתן להחליף שיטות אלטרנטיביות כרצוי, ולאחר מכן להמשיך לסעיף 11 ולהעריך את התוצאות.

Permeabilization 8. העובר

1. השתמש פיפטה העברה פלסטיק לצייר פעמי PFA 4% / PBS מהעוברים ולשטוף את העוברים פעמיים עם 1x (פוספט שנאגרו מלוח עם Tween) PBST. מעביר את העוברים לתוך 48 צלחות גם, ולאחר מכן לצייר את PBST 1x מהעוברים. לייבל 48 צלחות גם כדי להתאים את מיקום הבארות המקוריות של הצלחת גם העמוקה 96.
2. לשטוף על ידי הוספת מתנול 100% לבארות באמצעות פיפטה העברה פלסטיק ולאחר מכן לצייר אותו ולהוסיף methano 100%l שוב לעוברים.
3. מניחים את העוברים ב -20 מעלות צלזיוס, ודגירה של לפחות 20 דקות. לחלופין, לשמור את העוברים במתנול 100% ב -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
4. הסר את מתנול 100% ולשטוף את העוברים עם 50% MeOH / 1x PBST, אז 30% MeOH / 1x PBST, ולבסוף פעמיים עם 1x PBST.
   הערה: עוברים מעל גיל 24 שעות לאחר הפריה (hpf) ניתן מולבנת בשלב זה כדי להסיר פיגמנטציה ^39.
5. הוסף 15 μl של proteinase המופשר מניית K (10 מ"ג / מיליליטר) 50 מיליליטר של 1x PBST להכין proteinase K פתרון עובד (5 מיקרוגרם / מיליליטר).
6. הסר את PBST 1x מהעוברים ולהוסיף את הפתרון עובד proteinase K. הסר את K proteinase אחרי 4 דקות.
   הערה: הנסיין צריך לעבוד במהירות במהלך שלב זה כדי למנוע השפלה עובר. ריכוז proteinase K ותקופת דגירה צריכה להיות מגוון בהתאם לגיל העוברים שטופל ^41. הפרמטרים שתוארו כאן נוגעים לעובריםכי הם 24 hpf.
7. לשטוף את העוברים עם 1x PBST, ולאחר מכן להוסיף PFA 4% / PBS קר כקרח. בואו עוברי דגירה PFA 4% / PBS במשך 20 דקות ב RT.

9. הסרת הכלאה וProbe

1. בעזרת פיפטה העברת זכוכית להסיר את PFA 4% / PBS ולשטוף את העוברים פעמיים עם 1x PBST. החלף את PBST 1x עם 500 μl של היב ⁺ דגירה עובר ל4 שעות על 70 מעלות צלזיוס.
   הערה: הכלאה מראש ניתן לבצע כמה כמו שעה 2, אבל 4 שעות היא אידיאלית. כמו כן, טמפרטורות הכלאה ולשטוף שונות עשויות להיות אידיאלית עבור בדיקות מסוימות, כמו 65 מעלות צלזיוס, אך יש לבדוק באופן פרטני.
2. צור riboprobes כותרת digoxygenin המתאימה לגן (ים) של עניין ^41.
3. להוסיף 16 מיקרוגרם של riboprobe 16 מיליליטר של היב ^+. טרום חם riboprobe / היב ⁺ פתרון על 70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות לפני השימוש. אם באמצעות בדיקות מרובות, להוסיף 16 מיקרוגרם של כל בדיקה לאותו H⁺ YB נפח (16 מיליליטר).
4. בעזרת פיפטה העברת זכוכית, להסיר את ⁺ היב ולהשתמש P1000 להוסיף על 200 μl של riboprobe / היב ⁺ התערובת. הפוך את riboprobe / היב ⁺ הקוקטייל רק לפני השימוש ופיפטה מעלה ומטה פעם אחת לפני שמוסיף את התערובת לתוך כל טוב. השתמש בעצות פיפטה המחסום להוסיף riboprobe / היב ⁺ פתרון, זה מונע אדי התערובת להיכנס לפיפטה.
5. דגירה עובר בriboprobe / היב ⁺ הקוקטייל ב 70 מעלות CO / N. השתמש בסרט דבק כדי לכסות את בארות הצלחת לO / הדגירה הבדיקה N וכל שטיפות חמות הבאות.
6. הכן 50 פוראמיד% / 2x SSCT, 2x SSCT, וSSCT 0.2X וטרום חם ב 70 מעלות CO / N.
7. באמצעות P1000, להסיר את riboprobe / היב ⁺ ולאחסן את התערובת ב -20 ° C. לחלופין, שימוש חוזר riboprobe / היב ⁺ תערובת עד שלוש פעמים. לפני כל שימוש חוזר, להוסיף 3 מיקרוגרם של riboprobe לribopr המקוריOBE / היב ⁺ תערובת.
8. בעזרת פיפטה העברת זכוכית, לשטוף עובר פעמיים עם 50% פוראמיד / 2x SSCT למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים פעם אחת עם 2x SSCT במשך 15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים פעמיים עם SSCT 0.2X למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. הסר את SSCT 0.2X ולשטוף את העוברים עם MABT פעמיים ב RT.

10. אנטי-digoxygenin נוגדני דגירה וזיהוי

1. השתמש פיפטה העברת זכוכית כדי להסיר MABT מכל טוב. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להוסיף פתרון לחסום טרי היטב כל אחד. בואו עוברי דגירה בבלוק במשך 4 שעות ב RT. הוסף 8 μl של נוגדן אנטי digoxygenin 40 מיליליטר של תמיסת בלוק (דילול של פי 5,000).
2. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להחליף את הפתרון לחסום את פתרון נוגדן / לחסום. הוסף פתרון נוגדן / לחסום מספיק כדי לכסות את העוברים לחלוטין.
3. מכסה את הצלחת גם 48 עם רדיד אלומיניום, כך שאין אור יכול לחדור דרך לעוברים. Incubate העוברים O / N ב 4 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה מזכוכית, להסיר את הנוגדן / הפתרון לחסום ולשטוף את העוברים 10 פעמים עם MABT 5-10 דקות כל אחד.
   הערה: ניתן לבצע שטיפות MABT ברציפות, כמו זה ייקח דקות החוקר 5-10 להסיר MABT מכל צלחת ולוותר MABT הטרי לתוך הבארות.
4. צור שני צינורות של 40 מיליליטר (80 מיליליטר סה"כ) של חיץ לפני צביעה. להוסיף 180 μl של NBT (50 מ"ג / מיליליטר) ו 140 μl של BCIP (50 מ"ג / מיליליטר) לאחד הצינורות מוכנים של חיץ לפני צביעה כדי ליצור את הפתרון מכתים.
   הערה: פתרון מכתים זה יפיק מצע בצבע סגול.
5. החלף את MABT עם מאגר של טרום-צביעה ולתת את העוברים לדגור על RT במשך 5 דקות.
6. החלף את כל המאגר של טרום-צביעה עם הפתרון מכתים ולהשאיר על RT. צג תגובת colorimetric כל 15 דקות באמצעות סטראו.
   הערה: תגובות מכתים יכולות לקחת מכמה דקות עד שעות רבות בהתאם לבדיקה.
7. נציגתחרה הפתרון מכתים עם 1x PBST לאחר התגובה המכתימה מלאה ולאחר מכן לשטוף את העוברים פעמיים עם 1x PBST במשך 5 דקות.
8. הסר את PBST 1x ולהוסיף PFA 4% / PBS לתקן את העוברים.
   הערה: לחלופין, לבצע משאלה כפולה כדי לזהות riboprobes שכותרתו עם נוגדן אנטי והעמסת. אם ביצוע כפול באתר, דלג על הוספה של 4% PFA / PBS (שלב 10.9) לאחר 1x PBST לשטוף (שלב 10.8) ולשטוף את העוברים פעמיים במשך 15 דקות עם 0.1 M גליצרול, פעמיים במשך 15 דקות עם שטיפות MABT, ולאחר מכן דגירה עובר למשך 30 דקות בבלוק. ואז להוסיף על הנוגדן הנכון O / N ולבצע צעדים 10.3-10.9 באמצעות הפתרון מכתים הנכון. כדי לזהות את riboprobe שכותרת fluoroscein, להכין פתרון מכתים עם BCIP וINT להתבונן מצע אדום (עיין בשלב 10.1).

11. ניקוד צלחות העובר המסך הכימי

1. בצע ניקוד חזותי של התוצאות באמצעות סטראו להעריך sampl העוברes בassay פנוטיפ.
2. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר את העוברים מ48 הצלחות גם 12 צלחות גם להדמיה אופטימלית. לייבל 12 צלחות כל כך טובות שהם מתאימים למקומות טובים מהצלחת גם המקורית 96 עמוקים. כאשר ההעברה תסתיים, להציג תחת סטראו.
   הערה: ניתן לבחור בין 12 צלחות גם עוברי נציג וצלמו בשקופיות זכוכית תחת כיסוי להחליק ^41.

Results

הגישה הידנית המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה לנהל תפוקה גבוהה גנטיקה כימית מולקולה קטנה מסך באמצעות מודל דג הזברה עובר (איור 1). באמצעות שיטה זו, זה מעשי לאדם אחד לבצע מסך גנטיקה כימית, כך שבמשך 9 שבועות אדם אחד (מחויב לשבוע עבודה של 40 שעות) יכול לבצע את סקר של כ -600 תרכובות (איור 1) . כך, בפעם הספסל של אדם אחד יכולה לעקוף את הצורך בציוד בדרישה גבוה משאבים, מערכות אוטומטיות כמו. Trade-off הוא שמסך ידני דורש מספר שבועות של מאמץ ייעודי. בניגוד לכך, השימוש במערכות אוטומטיות יכול לדחוס את הזמן הכרוך ב1-2 שבועות של זמן רובוטית, ועלולים להיות כרוכה במאמץ חוקר יחסית מינימאלי כוללת. אחת דרכים להגדיל את היעילות ו / או היקף מסך במדריך היא לגייס 2-3 חוקרים בסך הכל, שתאפשר הקרנה מ 'תרכובות עפרות, ריכוז תרכובת שונה, ו / או הקרנה על פני תקופה קצרה של זמן.

מעורבים בפרוטוקול כדי להשלים מסך גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם קריאת משאלת הצעדים העיקריים מומחשים כתרשים זרימה (איור 2). ניתן לחלק את משימות הניסוי לשני סוגים של שבועות עבודה: (1) חשיפה לכימיקלים ותיוג עובר, ו- (2) ניתוח והדמיה. בשבוע עבודת חשיפה לכימיקלים, צעדים אלה כוללים הקמת מבוגרים דג הזברה (יום 1), אוסף עובר, עובר עֲרִיכָה וטיפול תרופתי (יום 2), הכנת עוברים לכלאה באתר (יום 3), וכלאה באתר (יום 4 -6). בשבוע ניתוח / הדמיה, חוקר מנתח ביטוי mRNA להבקיע עוברים ולהיטי תמונה (יום 7-11).

חלק קריטי בביצוע מסך גנטיקה כימית הוא לתייג גם באופן עקבי ומדויק במקומות. כp מסך גנטיקה הכימיתrocess מפורט כאן כרוך בהעברת קבוצות של עוברים מהיטב בצלחת אחת לגם בצלחת שונה מספר פעמים, את הצורך בתיוג מדויק וברור הוא בעל חשיבות עליונה, כך שכאשר להיט כימי הוא הבקיע זה יכול להיות ליניארי ובקלות נעוצים לזהותה בתוך הספרייה הכימית (איור 3). דרך קלה כדי לוודא שזה היא תווית הצלחות בצורה כזאת, כי בכל עת את המיקום גם עבור קבוצה של עוברים שטופלו על ידי תרכובת ישירות מתאים למיקום הכימי ספריית צלחת תרופה גם של המתחם משמש לטיפול בעוברים אלה (איור 3). כאן, מערכת כפולה של תוויות צבע קידוד ומספריים היא מנוצלת כדי לארגן את הדגימות, שנוספו לצלחות המסך באמצעות סמנים קבע (איור 3).

כאשר מנתחים את התוצאות של מסך תפוקה גבוהה, יש צורך קריטי לפתח שיטה לארגן בצורה נכונה, ביאורים, ולנתח את המולקולה קטנה פוטנציאליתלהיטים. לכן, מסך גנטיקה כימית חייב להיות מערכת לדירוג יסודית וברורה שתוכננה בקפידה וציית באופן קפדני ל. מערכת כזו צריכה בקלות ובאופן מוחלט להעביר את הדינמיקה החשובה של מתחם ולספק דרך תמציתית להציג את התוצאות של המסך המוגמר. אחת דרכים לבנות מערכת כזו היא עוברי כיתה באמצעות מערכת כיתה, מה שמסביר את החומרה מורפולוגיים כוללת וביטחון של להיט. יתר על כן, הקטגוריות המעמדיות יכולות להיות בשילוב עם ⁽⁺⁾ או ^(-), כדי לתאר השפעה מרחיבה או מצמצמת באזור (ים) של עניין. כאן, עוברי דג הזברה היו נתונים לתרכובות בודדות מספרייה ביו (אנזו כימיקלים) מepiboly 50% ל- 24 hpf, ולאחר מכן assayed ידי משאלה באמצעות קוקטייל של שלוש riboprobes לזהות פלחי נפרון (איור 4 א). כמערכת לדירוג דוגמא, גם שמכיל קבוצה של עוברים שהיו לי convolu הפרוקסימלי מוגדל באופן דרמטיאבובית טד (PCT) של כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה העוברית דג הזברה, תגרום למתחם המשמש לטיפול שכן להיות מסווג כ( Class I), אשר במקרה זה היה לייצג את המעמד הקשורות לפגם החמור ביותר וברמה הגבוהה ביותר של אמון בפנוטיפ נצפה (איור 4). המתחם היה אז להיות מבואר ב( PCT) ו( ^+), להיות סימון המלא (Class I - ⁺ PCT) (איור 4). תפיסה זו של סיווג מספקת דרך פשוטה ומהירה כדי לתאר מידע רב הנוגע למולקולה קטנה של עניין, ובכלל זה את חומרת השפעת התרכובות על האורגניזם, האזור שמושפע מהסמים ואת האופן שבי האזור מושפע (איור 4).

איור 1. & #160;. אסטרטגית מסך כימי עובר דג הזברה ידנית חוקר יתכן יכול לבדוק צלחת גם 96 של כימיקלים על עוברי דג הזברה ולבצע עיבוד המשאלה הבא במהלך שבוע אחד. ביצוע שבועיים של בדיקות כימיות (שבוע 1 (יום 1-6) ושבוע 2 (יום 7-12)) ניתן לשייך שבוע המוקדש ללדגום ניתוח שלישי. כ יכולות להיות הבקיע שתי צלחות 96 שווה של דגימות מסך וצלמו שבוע 3 (יום 13-17). תרחיש זה מסתכם בהקרנה של כ -200 תרכובות בתקופת זמן 3 שבוע, שהשוותה ל ספרייה קטנה של כ -600 תרכובות הוקרנו לחלוטין על ידי 9 שבועות. אסטרטגית מדריך זה יכול להיות שונה בהתאם למשאבים הזמינים. לדוגמא, שלושה חוקרים יכולים להפחית את הזמן כדי להשלים את המסך של כ -600 תרכובות עד 3 שבועות בהשוואה ל 9 השבועות זה ייקח עם חוקר אחד. ניתן להתאים אסטרטגיות סקירה על ידי הקצאת חוקרים להיבטים ספציפיים של המסך, כגון טיפול תרופתיment וכלאה באתר או מכוונים את החוקרים לבצע באופן עצמאי את תהליך המיון כולו בחלקים נפרדים של הספרייה הכימית.

תרשים זרימה 2. איור:. פירוט העבודה מסך 6 ימים תהליך המיון הכימי יכול להיות שבור למטה דיסקרטית ל -6 ימים. יום 1 מורכב של הקמת זוגות הזדווגות דג הזברה (= /> 25) לספק עובר לכל צלחת גם 96 שיוקרה. היום 2 כרוך באיסוף עובר מן תאי ההזדווגות ועֲרִיכָה בצלחת גם עמוקה 96, ואחריו טיפול תרופתי. ביום 3, עובר מוכנים לתרצה, כולל dechorionation, קיבעון רקמות, והתייבשות עובר. לבסוף, רצון הוא מבוצע בעוברים דרך יום 4-6. אנא שים לב כי נהלי צביעה חלופיים על דגימות קבועות יכול להיות בקלות שלubstituted למשאלה.

סכמטית איור 3. פלייט תיוג העברה. עוברי דג הזברה מפוזרים וסמים שטופלו בצלחת גם 96 ולאחר מכן עברה לצלחת גם 24 להסרת פסולת וחשיפת pronase. אז העוברים עברו 48 צלחות גם להכנת עובר, תרצה, וקיבוע רקמה. בשלב הבא, עוברים מועברים 12 צלחות גם לניקוד, הדמיה, ואחסון. עֲרִיכָה המדויקת של עוברים מושגת על ידי השימוש בשיטת קוד-צבעים, המאפשרת לחוקר לעקוב אחר כימי ממוצא עבור כל מדגם בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מערכת איור 4. דוגמא לדירוג:. assay פילוח כליות ניסוי מאחלים מאפשר לחוקר להכתים סוגי תאים ספציפיים המבוססים על הזהות של הבדיקות שנבחרו, ומאפשר ההערכה של שינויים בפנוטיפים עובר בהתאם לשינויים במיקום שעתוק mRNA ו / או רמות. כדוגמא, שלושה מגזרים של הכליה העוברית דג הזברה, כִּליַת רֵאשִׁית, תויגו באמצעות מיקס מסך 1. מערבבים מסך 1 הוא קוקטייל של בדיקות מורכבות של wt1b, אשר דווקא localizes בpodocytes (P), slc20a1a אשר מסמן את הפרוקסימלי מפותל אבובית (PCT), וslc12a1 אשר תוויות המגזר המוקדם דיסטלי (DE) ^47. סמל ⁽⁺⁾ לצד תווית אזור משמש כדי להוסיף הערות על ההתרחבות או שינוי חיובי של האזור, ואילו ^(-) שימוש בסמל למכתיב את ההתמעטות של אזור. הנה, אותםיש לי bryos סמים מטופלים עם RA 13-cis אבובית הפרוקסימלי מפותל מוגדלת והפסד של המגזר המוקדם דיסטלי ללא השפעה נראית לעין על podocytes מלא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

גנטיקה כימית בדג הזברה יכולה לעשות השפעה קריטית על ההתקדמות של גילוי תרופות. פרוטוקול זה מספק שיטת תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם רצון לקריאה החוצה, בצורה יעילה ומאפשר צוות בודד או קטן לנהל מסך מולקולה קטן. שיטה המינימלית של משאביי-זה מרחיבה את הכדאיות של גנטיקה כימית לקבוצות מחקר רבות. באופן ספציפי, אסטרטגית מסך זה מספקת אלטרנטיבה חשובה לשימוש במכשור רובוטי, כמו מערכות כאלה הן לא רחבה נגישות בכל מחלקות מחקר. מסך במדריך זה מאפשר לו אדם אחד כדי לבדוק את הצלחת גם אחד 96 של תרכובות עם קריאה רוצה בשבוע עבודה בן 6 ימים. מאז דג הזברה הם מֵטִיל בֵּיצִים, עם העוברים מתפתחים מחוץ להורה, ואת העוברים הם גדולים מספיק כדי לראות בעין בלתי מזוינת (בין 1-3 מ"מ), הם נוחים לטיפול ידני במכשירים פשוטים והחוקר יכול דגימות מערך בצלחות רבות גם ללא שימוש במיקרוסקופ. יתר על כן, מאז דג הזברה מתפתחת במהירות, חשיפת מולקולה קטנה יכולה להיות יעילה בטיפול יחיד של מתחם, ולא במינונים חוזרים ונשנים, אשר ממזער עיבוד ידני נוסף. עוברי דג הזברה בקלות מתורבתים כי החלמון שלהם מספק מקור תזונה עד 5-6 ימים לאחר הפריה, אשר מבטלת את הסיבוך של דגיגי האכלה. בנוסף, הרוב המכריע של איברי הזחל פיתח והפך פונקציונלי בתקופה זו, המספקת ההזדמנות ללמוד מגוון רחב של שאלות מחקר. בנוסף הפשוט של מולקולות קטנות לתקשורת הדגירה העובר אינו פולשני ומאפשר לחוקר (ים) כדי לבחור למנת תרופה, זמן של בנוסף, ומשך זמן של מתן שליטה הדוקה על משתנים רבים ומאפשרת לתהליכים התפתחותיים ספציפיים ובכך-חשיפה של ריבית ששאל. כפי שתואר כאן, הפרודוקטיביות מחקר משמעותית יכולה להיות מושגת בtimefr קצרהame שימוש במתודולוגיה מסך במדריך זה. מניסיוננו, יש תשואה גבוהה על המאמץ שהושקע, שיכול להיות מודגשת על ידי שימוש בספרייה כימית ביו ידוע לנתח תהליך של עניין, כגון פילוח נפרון במהלך פיתוח כליות (איור 4; Poureetezadi וWingert, לא פורסם).

המסך כימי הוראות שמתואר כאן הוא תכליתי במיוחד משום שהיא כוללת assay על דגימות דג הזברה קבועות. לדוגמא, אסטרטגיה זו יכולה להיות מתוקנת כדי לבדוק כמה צלחות של תרכובות בשבוע אחד ולאחר מכן להבקיע עוברים בשבוע הבא. מבחני חלופיים על דגימות דג הזברה קבועות, כגון הכנות אימונוהיסטוכימיה או צביעת רקמות אחרת, יכולים גם להיות תחליף לרצון קריאה החוצה. אסטרטגיות ניסיוניות לביצוע מבחני סלולריים בדג הזברה הם ישימים בשל הבהירות והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות מוקדמים. יתר על כן, חוקרים יכולים לעכב פיגמנטציה בSTA מאוחר יותרGES שימוש בכימיקלים או להימנע מהסיבוך של פיתוח פיגמנט לגמרי באמצעות השימוש בקווים גנטיים פיגמנט-פחות כמו קספר או דג הזברה מוחלט ^13. זה אפשרי לנהל באופן ידני מולקולות קטנות, לעבד את הכתם (ים) של עניין, ולהבקיע באופן ידני עובר באמצעות סטראו פשוט. עם זאת, חשוב לזכור כי ניתוח תמונה אוטומטי יכול להתבצע, ועשוי למעשה להיות נדרשים לניתוח פנוטיפ ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זה יכול להיות עדיף על מערכת ניתוח תמונה אוטומטית עם assay ישיר, שותף כגון כתב מהונדס, כמו זה מייעל את העיבוד הידני של דגימות, מכמת הבדלים לא בקלות ניתן להבחין בעין בלתי מזוינת, ומבטל הטיה חוקר ^15. למרבה המזל, כמה מערכות הדמיה אוטומטיות שניהם ידידותי למשתמש וחסכוני במונחים של עלויות תוכנת ^15. השימוש והיכולות של מערכות אוטומטיות אחרות במהירות התפתחו ויכוליםלהיות בשימוש לאורגניזמים אוריינט, לנהל טיפולים תרופתיים, ואפילו להעתיק את מקום מגורי אורגניזמים ^12,15. מערכות אוטומטיות אלה בישרו עידן טכנולוגי חדש של מחקר וספקו פתרונות חדשניים כדי לתפעל כמויות גדולות של נבדקים ובכך לבצע HTS וHCS גישות באורגניזמים שלמים ^12,15. בעוד מכונות כאלה הן ללא ספק כלים שימושיים, הם גם מאוד יקרים ונמצאים מחוץ להישג ידם של רבים מעבדות מחקר בסיסיות. ללא גישה ליכולות האוטומטיות אלה זה אולי נראה כי מסכי כימיים אינם אפשריים. עם זאת, פרוטוקול זה מתאר מדריך לכיצד לנהל מסך במדריך, שניתן להשתמש כדי להשלים את מסך גנטיקה כימית באופן מעשי על פרק זמן סביר.

חסרונות לשתי הגנטיקה הקרנה וכימית המדריך באופן כללי קיימים, וצריכים להישמר בחשבון כאשר שוקלים מסך כימי. בפרט, השיטה הפגינה כאן מחייבת מידה מתונהשל מיומנות פיזית. חשש זה הוא מצומצם או בטל לגמרי דרך חזרה, כמו מיומנות תשפר עם תרגול. בנוסף, יש מקום מינימאלי לשגיאה גסה, שכן יש רק 10 עובר לכל גם לניתוח. מולקולות קטנות יכולות להשתנות בחדירות של פנוטיפ שנגרם, כך משטר ניקוד סביר לזהות תרכובות של עניין יש לדבוק. זה חיוני כי חוקרי ניצול פרוטוקול זה להמציא קריטריונים קפדניים כראוי למה שהם ישקלו להיט. כמו כן, חשוב לזכור שהטבע של צורה זו של מסך יהיה ככל הנראה להניב חלק מסוים של תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיות שמסומן באמצעות עבודה-עד כימית נוספת. יתר על כן, זה קריטי לשלב עוברים מדויקים ולאסוף מצמדים להקרנה זמן קצר לאחר הפריה, כמו פיתוח אסינכרוני יכול להוביל לסיבוכים באופן מדויק להעריך את ההשפעה של טיפולים תרופתיים. יתר על כן, בכל הקשור להקרנה כימית לשעבראסטרטגית perimental, יש שורה של מגבלות. מסיסות ורעילות של מולקולות נושאת מתחם (לדוגמא, sulfoxide דימתיל (DMSO)) יכולים גם להציג נושא ויכולים להיות מונע בבדיקת מולקולות רבות. סיסית יכול לשמש גם מחסום לחשיפה לסמים. לבסוף, למרות שדג זברה היא מודל רב עוצמה וtranslational לגנטיקה כימית, טיפול צריך תמיד לקחת בקביעה האם אסטרטגית מסך כימית חלופית, למשל, שימוש במערכת במבחנה כגון שורת תאים, ניתן להחליף לשימוש בכל בעלי חיים. עם זאת, טיפול כימי במערכת דג הזברה השלמה נחשב עדיף על ניהול גישות דומות ביונקים, כפי שהיא מספקת את היתרון של איסוף ההשפעות המערכתיות של התרכובות ויכולה לאפשר לחוקרים למיין את רשימת התרכובות להיבדק במודל של יונקים.

עד כה, מסכי כימיים דג הזברה סיפקו לא כלי ניסיוני חזקo להתוות המנגנונים של פיתוח ולוודא סוכנים תרופתיים מועמד לשימוש ברפואה, כגון זיהוי של מולקולות מסוגלת למנוע פתולוגיות מחלה. לדוגמא, מחקר על ידי ברנס ועמיתיו פיתח assay מיקרו-ואוטומטי לקצב לב לשימוש בעוברי דג הזברה מהונדסים שהביעו GFP בשריר הלב ^42. הם השתמשו בקו מהונדס זה כדי לנתח את קצב לב בפיתוח וכיצד הוא הושפע על טיפול תרופתי ^42. מחקר אחר, על ידי בדיקת צפיפות האוכלוסייה של תאי גזע hematopoietic בעובר דג הזברה, זיהה שE2 פרוסטגלנדין מסדיר את הנישה HSC ^23. ממצא זה קבל תוקף בעכבר, ולאחר מכן בוצע לבדיקה קלינית בהשתלות טבורי אנושיות ^23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). באמצעות מספר מחקרים שנעשה לאחרונה, גנטיקה כימית הוכיחה להיות שימושי בלימוד מחלת כליות באמצעות דג הזברה 43. כליות דג הזברה מספקת פרדיגמה מצוינת ללמוד nephrogenesis או התחדשות של נפרון, היחידה התפקודית המרכיבות את הכליות במהלך פציעת פיתוח וכליות חריפות ^43. מבנה נפרון הוא שמור ביותר בין הכליה עוברית דג הזברה והמבוגרת בכליות יונקים ^44-50. מספר מחקרים שבחנו את הכליה העוברית דג הזברה להדגים בבירור את פוטנציאל translational הטבוע בו כאשר יחד עם גנטיקה כימית. מסך גנטיקה כימית בוצע בשני מוטנטים דג הזברה שמופו לpkd2 גנים וift172, אשר ידוע להיות שחקני מפתח במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) ^34. המסך הביא זיהוי deacetylase פאן-היסטון (HDAC) מעכב trichostatin (TSA) כמולקולה קטנה שיכול לבטל את הפגמים מורפולוגיים נראים בדרך כלל בעוברי המוטציה. גישה שונה ננקטה על ידי דה Groh ועמיתים הוקרנה תרכובות הinducבצקת ed בעוברי דג הזברה wild-type, דבר המצביעים הפרעה בתפקוד כליות ^35. לאחר זיהוי PTBA כלהיט, הם הבחינו כי בנוסף לגרימת בצקת, PTBA גם הגדיל את הביטוי של pax2a, סמן לאבות כליות. חשוב לציין, נגזר ממוטב של PTBA אז הראה ירידת התמותה אחוזים של דג הזברה מבוגרת שעברה נזק לכליות הנגרם גנטמיצין ויתר על כן, האיץ את ההתאוששות של עכברים שסבלו מנזק כלייתי ^27. יחדיו, תרומות אלה מגנטיקה כימית דג הזברה להציג הסוגים של תגליות שיכולים להתבצע תוך שימוש בשיטה שתוארה בפרוטוקול זה.

למרות שמחקרי גנטיקה כימית נושאים הכשרון ניכר, זה לא בלי אתגרים מסוימים. אך ורק תוך שימוש בגישה גנטיקה כימית יכול לעשות את זה מסובך כדי לקבוע את הגן הספציפי או גנים המושפעים מתחם. גם אם יעד (ים) נמצא, siפער gnificant יכול להישאר בין הזדהות מתחם והבנת המנגנון (ים) של פעולה שבה המולקולה הקטנה מתנהגת. לדוגמא, זה יכול להיות קשה לקבוע את המנגנון שבו מולקולה קטנה פועלת כי מתחם אחד מסוגל לנהל מגוון של אפקטים שונים בתוך האורגניזם. עם זאת, עם כניסתו של טכנולוגיה חדשה והמסכים גנטיים כימיים יותר הושלמה בדג זברה, הבעיה של קביעת מנגנון מתכווצת. שיטה אחת כדי לקבוע את ההשפעות מולקולריות של תרכובות שזוהו היא לבחור ספריית תרופות של bioactives הידוע להקרנה, שבו מנגנונים ניתן להסיק שעלולה להיות מהנתונים מבואר בעבר. בנוסף, אלגוריתמי chemoinformatic, כמו שער גילוי, זמינים לשימוש שיכול להשוות דמיון מבני של מתחם מול מסד נתונים של תרכובות עם מנגנונים מיוחסים ^14. דרך נוספת על מנת להבהיר את המנגנון של מתחם תהיה ליצור MICRoarray פרופיל לאחר טיפול ולאחר מכן לבצע שאילתא פרופיל זה באוסף של פרופילי תרופת microarray, כגון קישוריות מפה, מחפשת תרכובות מוגדרות באופן מכניסטי שתעוררנה אפקט דומה ^14. גם גישה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות גנטיות שיש לו השפעה דומה לזו של תרכובת של עניין. מציאת קשר בין מתחם ומוטציה יכולה להציע שהמתחם פועל במעלה הזרם או במורד הזרם מולקולריים של הגן קשור, אשר יכול להיות שמסומן על ידי טיפול במוטציות עם המתחם וmorpholinos. אפשרות נוספת תהיה ספקטרומטריה, שממשיכה להיות אופטימלי יותר לדג זברה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להתוות שינויים ספציפיים חלבון או שלאחר translational שינויים לאחר טיפול תרופתי. לבסוף, מולקולות קטנות או אפילו ספריות שלמות הן לפעמים מסוגלים להיות מתויג לנפתח של שותפים המחייבים. זה גם ראוי לציין, כי בעוד שהמנגנון של איך פונקציות מולקולה קטנות אנישל יבוא משמעותי, יש תרופות שאושרו ע"י ה- FDA שלמנגנונים אינם ידועים.

למרות שדג זברה תערוכת קווי דמיון רב ליונקים שני גנטית ופיסיולוגי, יש עדיין בעיה של מוצלב התרופה ^14. מחקר בדק את היכולת המוצלב של הלהיטים ממסך למעכבי מחזור התא בעוברי דג הזברה ^50. המסך גרם לזיהויו של 14 להיטים שלא היו ידועים קודם לכן לבעלי פעילות מחזור התא. מתוך 14 תרכובות אלו, 6 נמצאו כבעלי פעילות מחזור תא בשני מבחני תרבית תאים אנושיים ודג זברה, 3 הוצגו להיות סרום מומת במבחני תרבית תאים, 1 היה פעיל רק בתאי דג הזברה, ו- 4 לא היו פעילות בכל אחד מ דג הזברה או מבחני תרבית תאי אדם, אבל רק בכל אורגניזם דג הזברה. יש לציין, 4 תרכובות שרק פעילות בדג הזברה מראות כי יש הבדלים בין דג הזברה ויונקים שעשויים prohiנשך את פוטנציאל translational של תרכובות מסוימות. זהו שיקול חשוב להיות מודע ל, עם זאת יש דוגמאות של מולקולות קטנות, כמו PGE ₂ שמגביר את היכולת של HSCs לנקלט במקבלים אנושיים וPTBA נגזרים המשפרים את קצב התאוששות כליות אצל יונקים, ובכך לספק ההוכחה עיקרון מוצלב שאפשר ^23,31-33.

ללא קשר למלכודות הללו, גנטיקה כימית וגישה מינימאלי-משאב זה יש הרבה מה להציע לקהילת המחקר. גנטיקה כימית שימושית במיוחד בדג הזברה ותמשיך לשחק תפקיד קריטי בחקירת מסלול מולקולרית וגילוי סמים. מסכי כימיים המבוססים על מטרות מולקולריות בדידות שהיו בשיעור כישלון גבוה מבחינה היסטורית בשל מה שמכונה קבוצת הכוכבים של ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ומאפיינים טוקסיקולוגית (ADMET) ^51. מסכי כימיים ניצול דג הזברה ללהתמקד בתהליך, ולא יעד דיסקרטי, יכול לעקוף כמה בעיות ADMET ולזהות תרכובות שנמצאות יעילים בהקשר של האורגניזם כולו. עם הבריכה הולכת וגדל של משאבים זמינים למחקר דג הזברה, כוללים זנים מוטנטים הנוכחיים ואת היכולת להשתמש בעריכת הגנום ליצור מוטציות גנטיות ממוקדות וtransgenics, יש כמעט מספר בלתי מוגבל של מסכים גנטי כימי פוטנציאלי באמצעות דג הזברה. ספריות כימיות רבות כבר אצרו, ואוספי תוחלת עם bioactives הידוע, תרכובות רומן, מבחינה מבנית מגוונות ומבני דומות. ריאגנטים אלה מספקים שפע של הזדמנויות עבור שילובי מסך שכרגע זמינים וצפויים לגדול עוד יותר בשנים הקרובות. עם אפשרויות אלה ביד, פרוטוקול ידני ותפוקה גבוהה זה מספק דרך מעשית וידידותי למשתמש כדי להגדיל את היכולת של קבוצות מחקר לבצע מסכי גנטיים כימיים באמצעות דג הזברה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 - 10 & #956; l טיפים טבעיים לפיפט	ארה"ב סיינטיפיק	1111-3800
1x E3			צור באמצעות 50x E3 ו-DI מים.
1x PBST			צור 0.1% Tween-20 ב-1x PBS.
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
צלחת צביעה 12 בארות	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
צלחת 24 בארות	BD-Falcon	35-3226
4% PFA / 1x PBS			צור 4% PFA (w/v) ב-1x PBS - מרתיחים ואז מקפיאים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
48 צלחת	באר CytoOne	CC7672-7548
50x E3			מייצרים 16.5 מ"מ CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl ו-8.5 mM KCl במי DI.
96 צלחת באר עמוקה	VWR	100-11-940
96 מחצלת איטום צלחת באר	VWR	10011-946
נוגדן נגד דיגוקסיגנין	Roche	11-093-274-910	שמור על -20 מעלות צלזיוס.
מלאי BCIP	Sigma	B8503	לייצר 50 מ"ג/מ"ל באמצעות 100% DMF - להקפיא ואז לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
תמיסת			צור 50 מ"ל באמצעות 10 מ"ל BSA (10%), 5 מ"ל FCS ו-35 מ"ל MABT. (הפשרה של BSA ו-FCS ב-37 מעלות צלזיוס.)
מלאי BSA (אלבומין סרום בקר)	AB00448 ביואנליטי אמריקאי		לייצר 10% BSA על ידי ערבוב פתיתי BSA ב-MAB בטמפרטורת החדר ואז להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
DIG/FLU שכותרתו ריבופרוב ריאגנטים לתגובת שעתוק במבחנה	Roche	11175025910; 11685619910	התייעץ עם נוהל היצרן.
DMF (דימתילפורמלדהיד)			ביואנליטי אמריקאי
, 10x DNase 1 מאגר Roche		4716728001
צלחת דגירה עוברית	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
אתנול (EtOH)	Sigma	E7023	לייצר 50 מ"ל של 70% EtOH בדרגה מולקולרית H2O ו-100% EtOH ואז לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מלאי FCS (סרום עגל עוברי)	Invitrogen	16140089	לשמור על -20 מעלות צלזיוס.
יחידת עיקור מסנן	קורנינג	430516	0.45 & # 956; m CA / 1 ליטר נפח
מלקחיים עדינים	Roboz	RS-1050
צינור מיקרוצנטריפוגה תחתון שטוח	VWR	87003-300; 87003-298
פורממיד	AB00600 ביואנליטי אמריקאי		לשמור על -20 מעלות צלזיוס.
כיור זכוכית 90 x 50	Kimax Kimble	23000
פיפטת זכוכית	VWR	14673-010
בקבוקון זכוכית	Wheaton	225012
גליצרול	Sigma	G7893
גליצין	Sigma	G8898
גליקוגן	Roche	10901393001
HYB+			לייצר 50% פורממיד, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 מ"ג/מ"ל RNA טורולה שמרים, ו-50 μ l/μ l מלאי הפרין
INT	Sigma	I8377	לייצר 55 מ"ג/מ"ל באמצעות 70% DMF ו-30% H2O - להקפיא ואז לאחסן ב-20&0C.
MAB			Generate על ידי הוספת 55.0 גרם בסיס Trisma, 8 מ"ל של 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 גרם חומצה מאלית ו-17.5 גרם NaCl ל-1.5 ליטר של H2O נטול יונים. לאחר מכן מלאו ב-H2O נטול יונים עד 2 ליטר וחיטוי.
MABT			לייצר 0.1% Tween-20 במסננת תה רשת MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
	תה אנגלית	מק"ט #ASTR_KEN, MPN#1705
מים מזוקקים בדרגה מולקולרית	Mediatech	25-055-CM
פיפטה רב 8 ערוצים 0.5 - 10 & #956; l	Eppendorf	3122000.019
פיפטה רב 8 ערוצים 30 - 300 & # 956; l	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
מלאי NBT	Sigma	N6876	לייצר 50 מ"ג/מ"ל באמצעות 70% DMF ו-20% H2O - להקפיא ואז לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית	paraformaldehyde	19210
דבק PCR-Film	Eppendorf	30127.48
מיכל צלחת (קופסת עיפרון)	סטריליט	1722
מאגר			צור 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl ו-100 mM Tris pH 9.5. (הכינו טרי לשימוש בכל פעם.)
Pronase	Roche	11459643001	לייצר 50 מ"ג/מ"ל באמצעות E3, להקפיא ואז לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
פרוטאינאז K	רוש	03-115-879-001	לייצר 10 מ"ג/מ"ל במי DI ואז להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מעכב RNase 1		Roche
	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
תמיסת צביעה-סגול	N/A	N/A	צור באמצעות 45 & #956; l של NBT ו-35 μ l של BCIP לכל 10 מ"ל הדרושים במאגר לפני צביעה.
תמיסת מכתים-אדום			צור באמצעות 31.5 & #956; l של INT ו-35 μ l של BCIP לכל 10 מ"ל הדרושים במאגר לפני צביעה.
סטריאומיקרוסקופ	ניקון	SMZ645, SMZ1000
T3 RNA פולימראז	רוש	11031171001
T7 RNA פולימראז	רוש	10881775001
צינור העברה	Samco	202, 204
מלאי Tween-20 אמריקאי	ביואנליטי	AB02038
אמבט מים	תרמו	51221073	( דגם # 2831)