המנגנונים מובילים להתפתחות של היפרפלזיה אינטימה (IH) וכישלון שתל וריד עדיין לא נחקרו מספיק. מחקר זה מתאר מערכת ex vivo לינקב ורידי אדם תחת זרימה ולחץ מבוקרים. יתר על כן היעילות של חיזוק רשת חיצוני כדי להגביל את פיתוחה של י.ה. הוערך.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
נוהל saphenous אדם הוורידים Ex Vivo זלוף וחיצוני חיזוק
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
עמוד התווך של טיפולים עכשוויים למחלת עורקים אוטמת נרחבת הוא ורידים עוקפים שתל. עם זאת, עמידותו מאוימת על ידי היפרפלזיה אינטימה (IH) שסופו של דבר מוביל לחסימת כלי דם וכישלון שתל. כוחות מכאניים, מאמץ גזירה נמוך במיוחד וקיר מתח גבוה, הם חשבו ליזום ולקיים שינויים תאיים ומולקולריים אלה, אך תרומתם המדויקת עדיין לא נפרמה. כדי להעריך את התפקיד של לחץ ולחץ גזירה על הביולוגיה של IH סלקטיבי, לשעבר מערכת vivo זלוף (EVPS) נוצרה כדי תנקב מגזרים של ורידים אנושיים saphenous תחת משטר עורקים (מתח גבוה גזירה ולחץ גבוה). חידושים טכניים נוספים אפשרו לזלוף בו זמנית של שני קטעים מאותה הרוח, אחד מחוזק עם רשת חיצונית. ורידים נקצרו באמצעות טכניקה ללא מגע והועברו מייד למעבדה להרכבה בEVPS. קטע אחד של Isol הטריוריד ated לא perfused (שליטה, יום 0). שתיים אחרים המגזרים היו perfused עד 7 ימים, אחד שמוגן לחלוטין עם רשת 4 מ"מ (קוטר) חיצונית. הלחץ, מהירות זרימה, והדופק היו במעקב באופן רציף ומותאם ללחקות את התנאים ששררו בהמודינמית עורק הירך. עם השלמת זלוף, ורידים היו ירד מהסוס ומשמשים להיסטולוגית וניתוח מולקולרי. בתנאי vivo לשעבר, זלוף בלחץ הגבוה (עורקים, ממוצע = 100 מ"מ כספית) הוא מספיק כדי ליצור IH ושיפוץ של ורידים אנושיים. שינויים אלה הפחיתו בנוכחות רשת פוליאסטר חיצונית.
מבוא
מחלות לב וכלי דם הן הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה במדינות מערב 1. למרות התקדמות שנעשתה בטיפולי endovascular, ניתוח מעקפים נשאר עמוד התווך של טיפולים עכשוויים, ובכך יותר מהחצי מיליון שתלי וריד מבוצעים מדי שנה בארצות הברית. עם זאת, למרות עשרות שנים של מחקר, 30-60% משתלי וריד גפיים התחתונים נכשלים בתוך השנים הראשונות בשל היפרפלזיה אינטימה (IH) 2. כוחות מכאניים, מתח נמוך במיוחד גזירה (SS) וחומה גבוהה מתח, הם מרכזיים בייזום והפיתוח של תגובת hyperplastic זה 3,4. כדי לטפל בבעיה זו, מערכת ex vivo ורידי זלוף (EVPS) נוצרה כדי ללמוד, בתנאים מבוקרים בקפדנות המודינמית (לחץ ומאמץ גזירה), ההתנהגות של ורידי saphenous אדם. במחקר זה, הבא הכנסה לתוך מחזור הדם כמו עורקים-, בלחץ גבוה (ממוצע = 100 מ"מ כספית) היה מספיק כדי לעורר prolifפעולה ונדידה של תאי שריר חלק בשכבת אינטימה (IH) 5.
מחקרי יונקים הציעו את השימוש בחיזוקים חיצוניים כשיטת יעילה כדי לתמוך "וריד arterialized" ולנטרל את המודינמית החריף משנה את וריד פרצופים מושתל פעם אחת לסביבה העורק. הרשת מנעה יתר ההתנפחות, מאמץ גזירה מוגבר, והפחיתה את קיר מתח וכתוצאה מכך IH 6-10. עם זאת, המנגנונים ותחולתה לורידים אנושיים בשיפור העוקף patency לא היו מאופיינים במלואו. EVPS שלנו היה בשימוש כדי להשוות, במצב מחקת את שינויי וריד פרצופים מוכנס פעם אחת למשטר עורקים (מתח גבוה גזירה ולחץ), את התנהגותם של ורידי saphenous אדם בהיעדר והנוכחות של רשת צינורי פוליאסטר macroporous חיצונית. על ידי מניעת שיפוץ פתולוגי וIH, הרשת סיפקה ראיות ליעילות הקלינית את הפוטנציאל שלה 11 .
מחקר זה 1) מציג מודל של זלוף ורידי saphenous אדם vivo לשעבר תחת לחץ מבוקר ומאמץ גזירה 2) מוכיח כי רשת פוליאסטר מאקרו נקבובי חיצונית מפחיתה IH ומספקת מידע חיוני ליישום הקליני את הפוטנציאל שלה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ועדת האתיקה של אוניברסיטת לוזאן אישרה את הניסויים, אשר הנן בהתאם לעקרונות שהותוו בהצהרת הלסינקי של 1975, כפי שעודכן בשינה 1983 לשימוש ברקמות אנושיות.
1 אדם גדול saphenous וריד קציר
- להשיג מגזרי עודף של ורידי saphenous אדם שאינן דליות מחולים שעברו נמוך יותר עוקף איבר ניתוח לאיסכמיה. בחדר הניתוח, לחטא את כל הרגל עם תמיסת יוד ולעטוף את המטופל לחשוף את הרגל מהמפשעה לכף הרגל.
- לעשות חתך חציון מהמפשעה עד הברך (שעזב את חלק העור נקטע).
- לקצור את וריד saphenous הגדול עם גבעול של רקמה הסובבת (ללא מגע בטכניקה). צד סניפים מאובטחים של הוורידים עם 4-0 עניבות משי. מייד לאחסן מינימאלי של 9 סנטימטר מקטע ארוך עודף של הווריד saphenous הגדול יותר, בקוטר חיצוני של 2.5-4 מ"מ על 4 מעלות צלזיוס בRPMI-1640 Gבינוני lutamax, בתוספת 12.5% עוברי עגל בסרום ולהביא אותו למעבדה.
.2 EVPS עיצוב
- להרכיב את הציוד הכללי שמוצג באיור 1. החיטוי כל הציוד ולשמור את כל הרכיבים בתנאים סטריליים. בנוסף, להבטיח כי המערכת אינה עמיד למים ולא דליפת כימיקלים לתוך המדיום. השתמש בתיל polymethacrylate (PMMA-GS) לכיסוי. פלדה (X5 Cr Ni 18 10) ופלסטיק פוליאוקסימתילן (POM) כתמיכת וריד.
- לעצב את חדר זלוף לגיאומטריה הרצויה כדי לאפשר המיקום של הווריד והקשר שלה. ודא עומק (או רדיוס אם באמצעות בנייה גלילית) הוא לפחות 2.5 סנטימטר, כך שהוא מאפשר לי מינימאלי כיפוף ורחבה של כלי יחד עם כיסוי קבוע על ידי התקשורת והתרבות (איור 1). איטום הוא נושא מרכזי והסיבה בניית PMMA-GS מלבני משמשת.
- לעצב את תמיכת הווריד לgeometr הרצויהy. כדי להימנע ממסתלסלים וריד או על התנפחות, מאפשר התאמת אורך על ידי דחיפה או משיכה (בורג לא יכול לשמש למטרה זו, כפי שהווריד יהיה מעוות יחד עם הבורג).
הערה: מוט פלדה מלא המחובר על ידי 2 הזזה חתיכות בצורת L, התומכות צילינדרי וריד 2 (בקוטר 5 מ"מ כדי להתאים את הכלי) והווריד (איור 1 ואיור 2) משמשת כאן. - לעצב את העמודה לחץ, כך ש" הלחץ נח "פנה למערכת הוא: p = 0-10 = HX ρ XG, שבו p = לחץ (N / m 2, Pa) h = גובה של עמודה נוזל (מ ') ρ = צפיפות נוזל (קילוגרם / מ 3) וגרמנו = קבוע הכבידה (9.81 מ '/ השנייה 2). צינורות חיבור עיצוב ארבעה, מלמעלה עד למטה: להפעיל לחץ, ליצוא (מהווריד), יבוא (לוריד) וכדי לאפשר שינוי בינוני.
- הכן את המדיום. בהתבסס על מחקרים קודמים 5,11-14, לבחור RPMI-1640, בתוספת Glutamax, 12.5% בסרום עוברי עגל, ו1% פתרון אנטיביוטיקה antimycotic (10,000 U פניצילין / מ"ל G, בתוספת 10 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין סולפט, בתוספת 25 מ"ג / B amphotericin מ"ל, בתוספת 0.5 מיקרוגרם / מ"ל: gentamycin). מאמץ גזירה (SS) ניתן על ידי SS Q = 4 μQ / π r * 3 הוא קצב הזרימה (מ"ל / sec), r הרדיוס (סנטימטר) של מגזר הווריד, וμ הוא הצמיגות של מדיום זלוף.
- לווסת את SS על ידי התאמת הצמיגות באמצעות תוספת של 70 dextran kDa. למדוד את הצמיגות עם viscometer. כאן, להוסיף 8% dextran 70 kDa להגדיר SS ל9-15 DYN / 2 סנטימטר.
- הגדר את משאבת תשלובת לגרום אות cardioid pulsatile של 60 קטניות / min ומשרעת קבועה יצירת זרימה חד כיווני של 150 ± 15 מ"ל / דקה, עצמאית מהלחץ המופעל במערכת ונשלטים על ידי מחשב. ודא שתוכנת הנהיגה משלבת רכישה קבועה וניטור של לחצים, מהירות זרימה, דופק, ואות. אם תרצה, להשתמש במשאבה שנייה (שאינו מסונכרןhronized) כדי לייצר שאינה למינרית, זרימה טורבולנטית.
.3 עצרת EVPS (איור 1)
- לפני שמתחיל, לוודא שכל הציוד הוא סטרילי. לבצע את כל השלבים תחת asepsis הבאים בזרימה למינרית.
- הנח את הווריד בצלחת פטרי מלא בינוני. השתמש בלהב כירורגים ולחלק את הווריד ל -3 חלקים שווים.
- מייד לשטוף קטע אחד בPBS. לחלק את הקטע ב3 חלקים, לתקן אחד בפורמלין לmorphometry. להקפיא את השניים האחרים לניתוח תמליל כמותית (RT-PCR) וחלבון (כתם מערבי). שקול מקטעים אלו שליטה, וריד-perfused שאינו.
- השתמש ב2 המקטעים הנותרים לזלוף.
- מאוד בעדינות להזריק בינוני לווריד ולקבוע את כיוון הזרימה הנורמלי; בנוכחותם של שסתומי הווריד הוא הפוך.
- איטום הוורידים הוא בעל חשיבות עליונה להצלחת ניסוי. לבדוק אם קיים דליפה באמצעות בטחונות. לאבטח את כל דליפות עם 6-0 תפרי משי.
- חבר את קטע הווריד בין שני הצילינדרים מתכתיים, קצה אחד בכל פעם (2.3, איור 1). Secure הצילינדרים עם Ethibon 3-0 סביב החריצים (איור 1 א 'וב').
- הנח את קטע הוורידים כולו לתא זלוף מילא בעבר עם מדיום. חזור על אותו ההליך למגזר השני.
הערה: כשל בלאטום את הווריד כראוי לצילינדר יהיה מקור לדליפה, דורש reintervention, ולהגדיל את הסיכון לזיהום וכישלון ניסוי באופן משמעותי.
- הנח את קטע הוורידים כולו לתא זלוף מילא בעבר עם מדיום. חזור על אותו ההליך למגזר השני.
- כדי לחזק (רשת) במקטע השני, לשחרר את שני גלילים (עם הווריד המצורף) מהחתיכות (2.3 ואיור 1) בצורת L.
- להיות עדין ולא לגעת בוריד עם כל מכשירים. חלק את הרשת ראשונה בגליל ולאחר מכן לתוך הווריד. דחיפות דחיפה / משיכה תקבל הרשת בווריד.
- ברגע שהרשת מכסה את כל פני השטח של הווריד לאבטח את jוריד acketed לצילינדרים עם Ethibon 3-0.
- להרכיב מחדש את מתחם וריד / גליל לתמיכה בצורת L ולהעביר אותו לתא זלוף, מילא בעבר עם מדיום.
- לחבר כל צילינדר מתכתי (וביצוא) לY-מפצל באמצעות צינורות סיליקון שטופל חמצן עם קוטר פנימי של 3.2 מ"מ.
- חבר את מפצל יצוא לY-מפצל שני באמצעות אותו הסוג של צינור. מY-המפצל הזה, להשתמש בצינור אחד כדי למדוד את לחץ זלוף באמצעות שני הכלים. חבר את השני בחזרה לטור כדי ליצור מערכת לולאה סגורה (איור 2).
- בתוך האינקובטור, להשתמש בצינור (מטר אחד אורך) ארוך כדי לחבר את העמודה לחץ לראש המשאבה.
- השלם שהוקם על ידי המחבר את ראש המשאבה לY-מפצל זרם עם עוד צינור באורך ארוך (איור 1).
.4 הוורידים זלוף
- לאחר ההרכבה EVPS הייתה שיתוףmpleted, למלא את העמודה עם מדיום (להישאר מתחת לצינור יצוא וריד כדי לאפשר מילוי). הוסף עוד מדיום לטור עד שהמערכת מלאה. להעביר את כל המערכת לתוך החממה נשמרת בC 37 ± 0.1 ° עם pH נשמר קבוע ב7.40 ± 0.01 (באמצעות אלגוריתם CO 2 / pH המבוסס על משוואת הנדרסון-Hasselbach).
- להביא את ראש משאבת ציוד מחוץ לחממה ולחבר אותו למרחק של משאבת הילוך. הברג את המוטות כדי לחזק את המערך.
- הפעל את כוח המשאבה, לוודא שהוא מופעל על תוכנת הנהיגה ולאפשר 5 דקות למדיום שיחולק באופן שווה בכל תא.
- כדי לפקח על הלחץ, להשתמש ניטור קווים עורקיים. חבר את יציאת לחץ EVPS (שהוא תואם לקטטר העורקים) למתמר הלחץ הצמוד למחשב.
- ודא הצינור מלא לחלוטין עם מדיום ואינו מכיל כל בועות. De-בועת מערכת התרבות באמצעות "li העורקיםצינור ne "(איור 2). שים לב לתצוגה ולחפש אות cardioid pulsatile של 60 קטניות / דקה של אמפליטודה קבועה. בשלב זה, הלחץ הממוצע הוא בין 0-10 מ"מ כספית. אם הלחץ הוא <0 והעמודה בהדרגה מתרוקנת לחפש דליפה (בטחונות וריד או חותם פסול בין הווריד והצינור).
- הגדר את הלחץ המינימלי עד 6 מ"מ כספית לבדיקת ורידים או ב90 מ"מ כספית לבדיקת עורקים. בתנאים אלה, מזרק אוויר חל לחץ הנדרש למערכת העמודה ו.
- לשנות את המדיום כל 2 ימים על ידי שימוש בצינור מחובר לעמודת הלחץ. כדי למנוע שינוי נזק לחץ, לפתוח את פקק העמודה ראשונה.
.5 השלמת זלוף
- לאחר 3 או 7 ימים של זלוף: לקחת EVPS מתוך האינקובטור ולבטל את טעינת הוורידים. מחק את הפרוקסימלי 5 מ"מ ווריד דיסטלי מסתיים מחובר לציוד. חותך רין מרכזי, 5 מ"מ עוביgs מהמגזר שנותר ולתקן בפורמלין (morphometry). להקפיא את השאריות ולהפחית לאבקה לניתוחים מולקולריים נוספים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
EVPS מספק כלי רב ערך כדי להעריך באופן עצמאי את הכוחות המודינמית בוריד saphenous אדם שתל שיפוץ וIH.
איור 1 מציג את תא זלוף ותמיכת הווריד. באיורי 1 א 'וב', תמיכת הווריד לפני (איור 1 א) וההרכבה לאחר (איור 1), בהתאמה, היא בתמונה. הוא מורכב (מהחלק העליון לתחתון) של צינור נירוסטה רגיל 1 מדידת 9 סנטימטר, המשמש כתמיכה ל2 חתיכות בצורת L שיכול בקלות להחליק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה חושף לשעבר מערכת vivo זלוף הווריד (EVPS) לבצע מחקרים המודינמית נרחבים בעורקי אדם. מערכת זו מאפשרת זלוף ורידי saphenous תחת פרמטרים המודינמית מוגדרים בהעדר גורמים דלקתיים וצמיחה מחמירות שפורסמו על ידי במחזור תאי in vivo. כך, הוא מספק הבנה טובה יותר של הנתיבים הבסיסיים המעורבים בשליטתה של י.ה. בשתלי ורידים אנושיים 5,11,12,15.
הפרעות המודינמית לשחזור וכימות מוגבלות i...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מSNF [31003A-138,528], אוקטב ומרסלה בוטנר הקרן, קרן נוברטיס ואמה Muschamp הקרן. אנו מודים מרטין Lambelet, וJean-Christophe Stehle לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 - Glutamax | Life Technologies | 61870-010 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין/פונגיזור | ביוקונספט | 4-02F00-H | |
| דקסטרן מלוקונוסטוק spp. 500 גרם | סיגמא-אולדריץ' | 31390 | |
| טמפון PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 ליטר | מעבדה וגרוס אפוטקה ד"ר ג. ביכסל AG | 100 0 324 00 | |
| מדיום הטבעה בהקפאה - Tissue-Tek OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| צינורות סיליקון (מי חמצן) L/S 16 (96400-16) - 7.5 מ' | Idex Health & מדע GMBH | MF0037ST | |
| מפצל Y | Idex בריאות & מדע GMBH | Y-connector | |
| 35 מ"מ צלחת תרבית | סיגמא-אולדריץ' | CLS430165-100EA | |
| 15 מ"ל שפופרת בז | BD Bioscence | 352096 | |
| 50 מ"ל שפופרת בז | BD Bioscence | 352098 | |
| משאבת הילוכים - Reglo-Z | Idex Health & מדע GMBH | SM 895 | App-Nr 03736-00194 |
| ראש משאבה | Idex Health & מדע GMBH | MI0008 | |
| ערכת ניטור TRANSPAC IV | icumedical | 011-0J736-01 | |
| מזרקים 20 מ"ל | B. Braun Medical SA | 4612041-02 | |
| Etibon 3-0 FS-2 | Ethicon- Johnson& ג'ונסון | EH7346H | |
| Mesh ProVena 6-8 מ"מ | B. Braun Medical SA | 1105012-14 | |
| NaCl: תמיסת נתרן כלורי זלוף 0.9% (100 מ"ל) | B. Braun Medical SA | 534534 | |
| Masterflex L/S Standard Drive | Cole-Parmer Instrument Co | 7521-10 | |
| כרטיס רכישה | National Instruments | PCI-6024 E | |
| מד זרימה מודול | Transonic Systems Inc. | TS410 ו- T402 | |
| Stopcock עם 3 כיוונים | BD Connexta Luerlock | 394600 | |
| Millex מסנן | Milian | SE2M229I04 |
מקורות
- Sal Go, A., et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association. Circulation. 129, 399-410 (2014).
- Sal Conte, M., et al. Results of PREVENT III: a multicenter, randomized trial of edifoligide for the prevention of vein graft failure in lower extremity bypass surgery. Journal of Vascular Surgery. 43, 742-751 (2006).
- Yu, P., Nguyen, B. T., Tao, M., Bai, Y., Ozaki, C. K. Mouse vein graft hemodynamic manipulations to enhance experimental utility. The American Journal of Pathology. 178, 2910-2919 (2011).
- Davies, M. G., Hagen, P. O. Reprinted article "Pathophysiology of vein graft failure: a review". European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 42, Suppl 1. S19-S29 (2011).
- Berard, X., et al. Role of hemodynamic forces in the ex vivo arterialization of human saphenous veins. Journal of Vascular Surgery. 57, 1371-1382 (2013).
- Vijayan, V., et al. Long-term reduction of medial and intimal thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable external sheath. Journal of Vascular Surgery. 40, 1011-1019 (2004).
- Jeremy, J. Y., et al. On the biology of saphenous vein grafts fitted with external synthetic sheaths and stents. Biomaterials. 28, 895-908 (2007).
- Zilla, P., et al. Constrictive external nitinol meshes inhibit vein graft intimal hyperplasia in nonhuman primates. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, 717-725 (2008).
- Zilla, P., et al. Utilization of shape memory in external vein-graft meshes allows extreme diameter constriction for suppressing intimal hyperplasia: a non-human primate study. Journal of Vascular Surgery. 49, 1532-1542 (2009).
- Yeoman, M. S., et al. A constitutive model for the warp-weft coupled non-linear behavior of knitted biomedical textiles. Biomaterials. 31, 8484-8493 (2010).
- Longchamp, A., et al. The use of external mesh reinforcement to reduce intimal hyperplasia and preserve the structure of human saphenous veins. Biomaterials. 35, 2588-2599 (2014).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 45, 50-59 (2010).
- Dubuis, C., et al. Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins. The Journal of pharmacology and experimental. 347, 574-581 (2013).
- Deglise, S., et al. Increased connexin43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia. Journal of Vascular Surgery. 41, 1043-1052 (2005).
- Muto, A., Model, L., Ziegler, K., Eghbalieh, S. D., Dardik, A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circulation Journal : Official Journal of the Japanese Circulation Society. 74, 1501-1512 (2010).
- Tao, M., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. The American Journal of Pathology. 182, 277-287 (2013).
- Berard, X., et al. Salvage treatment for venous aneurysm complicating vascular access arteriovenous fistula: use of an exoprosthesis to reinforce the vein after aneurysmorrhaphy. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery : the Official Journal of the European Society for Vascular Surgery. 40, 100-106 (2010).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
