חזותי exocytosis ללא ממס של Neoformans קריפטוקוקוס מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Summary

אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.

Abstract

היבטים של הזיהום של מקרופאגים ידי neoformans קריפטוקוקוס רבים נחקרו רבים ומוגדרים היטב. עם זאת, אינטראקציה מסוימת שאינו מובנת באופן ברור הוא exocytosis לא אלים. בתהליך זה, תאי שמרים משתחררים למרחב החוץ תאי על ידי מנגנון הבין היטב שמשאיר את שני מקרופאג וCn קיימא. כאן, אנו מתארים כיצד לעקוב מספר גדול של מקרופאגים נגועים בנפרד לתקופה זיהום 24 שעות על ידי מיקרוסקופ-פקע זמן. מקרופאגים נגועים הם שוכנו בתא חימום עם CO ₂ אווירה מחוברת למיקרוסקופ המספק את אותם תנאים כמו חממת טכנולוגיה של תרבית התאים. מיקרוסקופיה דיגיטלית חי יכולה לספק מידע על האינטראקציות הדינמיות בין מארח ופתוגן שאינו זמין מתמונות סטטיות. יכולת לדמיין כל תא נגוע יכול לספק רמזים באשר לאופן מקרופאגים להתמודד זיהומים פטרייתיים, ולהיפך. אני טכניקה זוכלי רב עוצמה sa בלימוד הדינמיקה שנמצאות מאחורי תופעה מורכבת.

Introduction

השלבים של זיהום פטרייתי בין תאים ומקרופאגים cryptococcal מתועדים היטב ^1-3. לאחר תאי שמרים הם מעובדים על ידי מקרופאגים, מגוון רחב של אינטראקציות עלול להתרחש: מקרופאג עשוי lyse שחרור העומס פטרייתי שלה לתוך מרחב החוץ תאי, או שזה יכול לשלוט בזיהום על ידי שמירה על תאי שמרים בתוך גבולות קרום התא שלו ^4. עם זאת, לפני כמה שנות תוצאה חדשה שתוארה באופן עצמאי על ידי שתי קבוצות: exocytosis לא אלים, תהליך שבו מקרופאג נמחק כל תאי cryptococcal או לסביבה או תא השכן והן המארח והפתוגן להישאר קיימא ^{5 -8.} מספר מחקרים ניסו להבין את המנגנונים המולקולריים מאחורי אינטראקציה זו, אך עדיין אין לנו הבנה מלאה על מה שמניע את התופעה הזאת.

היכולת ללכוד תמונות בזמן אמת ולאחר מכן לאחר מכן לנתח להדביק מרובהעורך מקרופאגים מאפשר לענות על שאלות רבות על התכונות הפיזיות המקיפות exocytosis לא אלים בכל הקשור לעיתוי, יכולת מרחבית, שינוי במורפולוגיה ואפילו לחץ של מקרופאגים בזיהום פטרייתי. ידי מתן אפשרות לתאים להיות שוכנו בסביבה שדומה לזו של חממה, אנו יכולים להציץ באופי הדינמי של אינטראקציות תא מקרופאג פטרייתי. חוקרים השתמשו בטכניקה זו כדי ללמוד מרכיבים שונים של תהליך זה. התפקיד של phagosome בתהליך זה נעשה לכאורה באמצעות מכתים הניאון ויקטינו סוכני חסימה ^9, בעוד שקבוצה אחרת השתמשה בשיטה זו כדי להראות שexocytosis לא אלים נחסם בתאים שהיו WASH nucleating תחומים חלבון נמחק ^10. ההשפעה של איתות ציטוקינים גם הובררה באמצעות מיקרוסקופ בזמן אמת ^11. תהליך זה אינו מוגבל לג neoformans כפי שגם נצפה עם קנדידה אלביקנס, another פתוגן פטרייתי שיש לו את היכולת להדביק מקרופאגים ^12. ממצאים אלה הם דוגמאות לאופן ששיטה זו יכולה לספק שפע של מידע לאזור שאנחנו יודעים כל כך מעט על.

Protocol

כל העבודה של בעלי החיים שנעשתה בהתאם לתקנות והנחיות של המכון לבעלי חי לימודים אלברט איינשטיין המכללה לרפואה.

1 תנאי גידול של ג neoformans H99 (סרוטיפ)

1. לגדול ג פרט מושבות neoformans (CN) על צלחות אגר Sabouraud.
2. יום אחד לפני הניסוי, לבחור מושבה אחת ולחסן 10 מ"ל של מרק Sabouraud.
3. מאפשר לתרבות לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס רועדת במהירות של 250 סל"ד.

.2 בידוד והכנת יסודי עצם המקרופאגים מC57 / עכברים BL6

1. להרדים עכברים ידי הצבת בעלי חיים בתא CO ₂ עד אין נשימה ארוכה יותר. כצעד שני, cervically לנקוע את הצוואר לפני תחילת נתיחה. לעקר את כל גוף עם 70% אתיל אלכוהול.
2. הסר את שני עצמות הירך ועצמות שוקה והמקום בDMEM סטרילי.
3. הסרת רקמה עודפת ושרירים באמצעות דהlicate מגבונים עד עצמות הן נקיות לחלוטין.
4. מניחים את עצמות רק בשלמותה בצלחת פטרי המכילה 70% אתיל אלכוהול ודגירה במשך 3 דקות כדי להרוג מיקרואורגניזמים הקשורים. הסר עצמות ומניחים בצלחת פטרי עם DMEM סטרילי.
5. לחתוך בזהירות קצות עצמות. החזק עצם מעל צינור חרוטי 50 מ"ל ריק מונח על קרח ובזהירות סומק 10 מ"ל של DMEM הקר באמצעות מחט G 25 דרך כל עצם.
   הערה: כל עכבר יניב 4 עצמות (2 עצמות ירך, 2 tibias). לכן עכבר אחד אמור להניב כ 40 מ"ל של השעיה תא.
6. השעיה תא צנטריפוגה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 650 x גרם.
7. במהלך צנטריפוגה זו, להכין ומסנן לעקר מקרופאג מח עצם האכלת תקשורת אשר מורכבת מDMEM בתוספת 20% L929, 10% עוברי עגל בסרום, 10% NCTC-109, 1% העט סטרפטוקוקוס, 1% HEPES, 1% L-גלוטמין , 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1% 2-mercaptoethanol.
8. גלולה וכתוצאה Resuspend עם 10 מ"ל של האכלת תקשורת. Pass suspens תאיון דרך מסננת 70 מיקרומטר תא לשבש גושי תאים ולהסיר חלקי לכלוך גדול.
9. צלחת 1 מ"ל של השעיה תא לתוך 10 מ"ל של תקשורת האכלה בצלחות פטרי שצוינו לשימוש בתרבית רקמה (עבור הסכום כולל של 10 צלחות).
10. לאפשר לתאים לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עם 10% CO _2. הוסף 5 מ"ל של תקשורת האכלה טריות ביום 3 ביום 7, להחליף לחלוטין את תקשורת ההאכלה ומקרופאגים הם מוכנים לשימוש.
11. היום לפני הניסוי, לנתק מקרופאגים מצלחת על ידי הסרת תקשורת האכלה ולהוסיף 5 מ"ל של תא עדין הפשטה מגיב לצלחת.
12. דגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס ולהסיר מקרופאגים עם pipetting העדין.
13. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב650 XG עבור 10 דקות.
14. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של האכלת תקשורת. באמצעות דילול 1:20, לחשב את הריכוז של מקרופאגים ידי pipetting 10 μl של השעיה תא על haemocytometer.
15. שימוש בזכוכית מ"מ 14 תחתית צלחות פטרי, צלחתריכוז של 1 x 10 ⁵ מקרופאגים ישירות על גבי היטב הפנימיים המחזיק מרבי של 200 μl, כך לקחת בזהירות כך שלא יחרוג כרך זה, כפי שמוצג באיור 4.
16. אפשר התאים לדבוק בצלחת פטרי הזכוכית על ידי הצבת את הכלים ב37 מעלות צלזיוס חממה במשך שעה 1.
17. להוסיף 1-2 מ"ל של האכלת תקשורת בתוספת LPS ב1 מ"ג / מ"ל ​​וIFNg ב500 u / ml ולאפשר לתאי דגירה לילה.

.3 Co-דגירה של ראשוניים Murine המקרופאגים וג neoformans

1. ביום של ניסוי, להסיר 1 מ"ל של תאי תרבות ושמרי גלולה מחוסן לילה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב420 x גרם.
2. שטוף תאים 3 פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר תקשורת ומוצרי cryptococcal תאיים כמו glucuronoxylomannan פוליסכריד (GXM) במהירות ובזמן שהוזכר לעיל.
3. גלולה תא הגלולה ב 1 מ"ל של PBS סטרילי ולעשות דילול 1: 100. פיפטה 10 μl של tהוא הדילול על haemocytometer ולספור תאים. הוספת תאי שמרים במשרד פנים של 1: 5. לדוגמא, אם יש 1 x 10 ⁵ מקרופאגים / טוב, להפוך את ההשעיה תא של 5 x 10 ⁶ / מ"ל של Cn ולהוסיף של פתרון זה 100 μl לסכום כולל של 5 x 10 ⁵ Cn.
4. הוספת נפח מחושב של השעיה תא cryptococcal עד 1 מ"ל של תקשורת האכלה עם נוגדן מב 18B7 בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה השעיה תא בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
5. הסירו תקשורת האכלה מזכוכית עם תחתית צלחת פטרי ולשטוף 1x עם PBS סטרילי. הוסף 100 μl של Cn opsonized ישירות לטוב.
6. לאפשר לתאי דגירה לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם 10% CO _2.
7. לאחר שיתוף דגירה, לבדוק על ידי מיקרוסקופ שמקרופאגים הפנימו Cn. כדי להיחשב הפנים, צריכים לראות בבירור תאי cryptococcal בתחומי מקרופאג.
8. 3x צלחת פטרי לשטוף עם PBS סטרילי כדי להסיר כל וכל extracellular Cn.
9. להוסיף 1-2 מ"ל של האכלת תקשורת ללא התוספת של מב 18B7, ומיקרוסקופ להגדיר.

Exocytosis .4 חזותי לא אלים בזמן אמת ניצול דיגיטלי אור מיקרוסקופית

הערה: כדי לבצע ניסויים אלה, מיקרוסקופ שמגיע עם תא דוגרים מצורף הכולל CO משלוח ₂ והסקה נדרש.

1. לפני הניסוי, מראש לחמם את החדר דוגרים במשך דקות לפחות 30 ל37 מעלות צלזיוס. ודא שיחידת CO ₂ קוראת 5% בתחילת הניסוי.
2. זכוכית מקום תחתית צלחת פטרי על פלטפורמת מיקרוסקופ, לכסות עם CO ₂ מכסה, ולסגור את כל הדלתות כדי להבטיח שאין בריחות חום.
3. באמצעות מטרת 10X עם מיקרוסקופ בניגוד שלב, להתמקד בתחום ברור של מקרופאגים הנגועים. בהתבסס על הניסוי, לקבוע את המטרה בשימוש על ידי כמה מקרופאגים צריכים להיחקר.
4. הגדרת תוכנת מיקרוסקופ כדי taKe תמונה כל 4 דקות לתקופה 24 שעות.
5. לאחר 24 שעות, הניסוי הגיע להשלמת פרויקט וכן סך של 361 תמונות יהיה כבר נאסף. לייצא את התמונות האלה כ.jpegs בדחיסת 5%. שימוש בתוכנת J תמונה, להציג תמונות כסטאק חזותי ב5 פריימים לשנייה. אם הסרט צריך להיות שנצפו לפרסום או הצגה, לשמור אותו כאחד .avi או .mov קובץ תלוי באיזה פורמט עובד הכי טוב עבור הצופה.

Results

התמונות שטכניקה זו מייצרת ניתן לנתח במגוון רחב של דרכים לאיסוף מידע המקיף את מה שקורה אחרי התאים phagocytosed ג neoformans. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם כ 100 מקרופאגים שהם או נגועים או נגוע. כל אחד ממקרופאגים אלה מעניק לצופה הזדמנות ללמוד אינטראקציות מאכסן לפתוגן ברמה מאוד מיקרוסקופית. כאיורי 2 ו -3 מופע, יש תוצאות שונות שיכול להתרחש בין תא מקרופאג ושמרים, ואפילו בין מקרופאג-macrophage. יכולים להיות הבקיע המקרופאגים כעו...

Discussion

כאן יש לנו תארנו שיטה שבאמצעותה ניתן להקליט אינטראקציות פטרייתי-macrophage ומנותח בזמן אמת על פני תקופה 24 שעות. המעבדה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה כדי ללמוד רב של ההיבטים זמניים של exocytosis לא אלים ותמשיך להשתמש במיקרוסקופ בזמן אמת כדי לברר את הרכיבים מורפולוגיים המקיפים את התהליך הזה.

לטכניקה זו כדי להניב תוצאות אידיאליים, תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן לצעדים מסוימים בפרוטוקול. צפיפות התאים שמצופית בלילה שלפני חש...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
סרום עגל עוברי (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
חומצות אמינו לא חיוניות	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
צלחות פטרי תרבית רקמות רעילות 3003	פישר סיינטיפיק	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek כלי תרבות תחתון זכוכית	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
עכבר IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	נוגדן לא מסחרי המיוצר במעבדה
Axiovert 200M מיקרוסקופ עם תא דגירה	Zeiss