חזותי exocytosis ללא ממס של Neoformans קריפטוקוקוס מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

סיכום

אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.

תקציר

היבטים של הזיהום של מקרופאגים ידי neoformans קריפטוקוקוס רבים נחקרו רבים ומוגדרים היטב. עם זאת, אינטראקציה מסוימת שאינו מובנת באופן ברור הוא exocytosis לא אלים. בתהליך זה, תאי שמרים משתחררים למרחב החוץ תאי על ידי מנגנון הבין היטב שמשאיר את שני מקרופאג וCn קיימא. כאן, אנו מתארים כיצד לעקוב מספר גדול של מקרופאגים נגועים בנפרד לתקופה זיהום 24 שעות על ידי מיקרוסקופ-פקע זמן. מקרופאגים נגועים הם שוכנו בתא חימום עם CO ₂ אווירה מחוברת למיקרוסקופ המספק את אותם תנאים כמו חממת טכנולוגיה של תרבית התאים. מיקרוסקופיה דיגיטלית חי יכולה לספק מידע על האינטראקציות הדינמיות בין מארח ופתוגן שאינו זמין מתמונות סטטיות. יכולת לדמיין כל תא נגוע יכול לספק רמזים באשר לאופן מקרופאגים להתמודד זיהומים פטרייתיים, ולהיפך. אני טכניקה זוכלי רב עוצמה sa בלימוד הדינמיקה שנמצאות מאחורי תופעה מורכבת.

מבוא

השלבים של זיהום פטרייתי בין תאים ומקרופאגים cryptococcal מתועדים היטב ^1-3. לאחר תאי שמרים הם מעובדים על ידי מקרופאגים, מגוון רחב של אינטראקציות עלול להתרחש: מקרופאג עשוי lyse שחרור העומס פטרייתי שלה לתוך מרחב החוץ תאי, או שזה יכול לשלוט בזיהום על ידי שמירה על תאי שמרים בתוך גבולות קרום התא שלו ^4. עם זאת, לפני כמה שנות תוצאה חדשה שתוארה באופן עצמאי על ידי שתי קבוצות: exocytosis לא אלים, תהליך שבו מקרופאג נמחק כל תאי cryptococcal או לסביבה או תא השכן והן המארח והפתוגן להישאר קיימא ^{5 -8.} מספר מחקרים ניסו להבין את המנגנונים המולקולריים מאחורי אינטראקציה זו, אך עדיין אין לנו הבנה מלאה על מה שמניע את ....

פרוטוקול

כל העבודה של בעלי החיים שנעשתה בהתאם לתקנות והנחיות של המכון לבעלי חי לימודים אלברט איינשטיין המכללה לרפואה.

1 תנאי גידול של ג neoformans H99 (סרוטיפ)

1. לגדול ג פרט מושבות neoformans (CN) על צלחות אגר Sabouraud.
2. יום אחד לפני הניסוי, לבחור מושבה אחת ולחסן 10 מ"ל של מרק Sabouraud.
3. מאפשר לתרבות לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס רועדת במהירות של 250 סל"....

תוצאות

התמונות שטכניקה זו מייצרת ניתן לנתח במגוון רחב של דרכים לאיסוף מידע המקיף את מה שקורה אחרי התאים phagocytosed ג neoformans. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם כ 100 מקרופאגים שהם או נגועים או נגוע. כל אחד ממקרופאגים אלה מעניק לצופה הזדמנות ללמוד אינטראקציות מאכסן לפתוגן ברמה מאוד מיקרוסקופית. כאיורי 2 ו -3 מופע, יש תוצאות שונות שיכול להתרחש בין תא מקרופאג ושמרים, ואפילו בין מקרופאג-macrophage. יכולים להיות הבקיע המקרופאגים כעו.......

דיון

כאן יש לנו תארנו שיטה שבאמצעותה ניתן להקליט אינטראקציות פטרייתי-macrophage ומנותח בזמן אמת על פני תקופה 24 שעות. המעבדה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה כדי ללמוד רב של ההיבטים זמניים של exocytosis לא אלים ותמשיך להשתמש במיקרוסקופ בזמן אמת כדי לברר את הרכיבים מורפולוגיים המקיפים את התהליך הזה.

לטכניקה זו כדי להניב תוצאות אידיאליים, תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן לצעדים מסוימים בפרוטוקול. צפיפות התאים שמצופית בלילה שלפני חש.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
סרום עגל עוברי (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
חומצות אמינו לא חיוניות	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
צלחות פטרי תרבית רקמות רעילות 3003	פישר סיינטיפיק	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek כלי תרבות תחתון זכוכית	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
עכבר IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	נוגדן לא מסחרי המיוצר במעבדה
Axiovert 200M מיקרוסקופ עם תא דגירה	Zeiss

שלנו