טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש Vulgaris Phaseolus כדוגמה

Summary

פרוטוקול זה מפרט את המיצוי האופטימלי של נוזל כביסה אפופלסט מעלי צמחים, תוך שימוש בצמחי שעועית צרפתית (Phaseolus vulgaris) כדוגמה למודל.

Abstract

אפופלסט הוא תא תאי שונה ברקמות צמח שנמצאת מחוץ לקרום הפלזמה וכולל את דופן התא. תא apoplastic שלי צמחים הוא האתר של מספר תהליכים הביולוגיים חשובים, כולל קיר תא היווצרות, חומרים מזינים סלולריים ספיגת מים ויצוא, אינטראקציות הצמח-endophyte ותגובות הגנה לפתוגנים. שיטת החדירה-צנטריפוגה היא מבוססת היטב כטכניקה חזקה לניתוח הרכב אפופלסט המסיס של מיני צמחים שונים. הנוזל המתקבל בשיטה זו ידוע בכינויו אפופלסט נוזל כביסה (AWF). הפרוטוקול הבא מתאר שיטת חדירת האבק וצנטריפוגה מותאמת להפקת AWF מvulgaris Phaseolus קורות חיים (שעועית הצרפתית). Tendergreen עלים. המגבלות של שיטה זו ואופטימיזציה של הפרוטוקול למיני צמחים אחרים הם דנו. התאוששתי ניתן להשתמש AWF במגוון רחב של experimen במורד הזרםts המבקש לאפיין את ההרכב של אפופלסט וכיצד הוא משתנה בתגובה למינים צמחים וגנוטיפ, התפתחות צמח ותנאים סביבתיים, או כדי לקבוע כיצד מיקרואורגניזמים לגדול באפופלסט נוזל ולהגיב לשינויים בהרכבו.

Introduction

אפופלסט המפעל הוא החלל הבין-המקיף את תאי צמח. זוהי סביבה דינמית שבו תהליכים מטבוליים ותחבורה רבים יתקיימו. המרכיב המבני העיקרי של אפופלסט הוא קיר התא, שהתאסף ושונה על ידי אנזימים, חלבונים מבניים ומטבוליטים ממוקמים בתוך אפופלסט. בתאי צמח בריאים אפופלסט בדרך כלל נשמרים במצב חומצי המאפשר חומצות אמינו, סוכרים וחומרים מזינים אחרים כדי להיות מיובאים מאפופלסט אל הציטופלסמה על ידי H ⁺ symport ^1. במהלך הובלת סוכרוז, מהלכי סוכרוז ממקורות פוטוסינתזה באמצעות אפופלסט וכלי דם להשיפה; סוכרוז מועבר לאחר מכן על ידי פוטנציאל האוסמוטי מתוחזק על ידי invertases apoplastic ביקוע סוכרוז באיברי הכיור ^2. סוכרים וחומרים מזינים אחרים יכולים גם להיות מועברים כלפי מעלה ומצטברים בחללים הפיוניות דרך זרם דיות ^3.

"> אפופלסט גם מייצג נישה סביבתית שבו פתוגנים רבים להקים אורח החיים טפיל שלהם. יש לי פתוגנים מפעל בקטריאלי היכולת להתרבות לצפיפויות גבוהות באפופלסט, שבו הם לגשת דרך פתחים טבעיים כגון הפיוניות או דרך פצעים ^4. הריכוז של אמין חומצות ותרכובות חנקן אחרות בעגבניות אפופלסט הוכחו להיות מספיק כדי לתמוך בדרישות התזונתיות של חיידקים פתוגנים ופטריות ^5,6. תגובות הגנה ראשוניות לפתוגנים חיידקים להתרחש גם באפופלסט, כלומר הייצור של מיני חמצן מגיבים על ידי peroxidases תאי . וoxidases וחיזוק דופן התא דרך cross-linking וcallose תצהיר ⁷ דופן תא הצמח עשירה במטבוליטים משתיים בפעילות אנטי-מיקרוביאלי; הטבע ביוכימיים של מטבוליטים משניים אלה משתנה בין מיני ^8.

כתוצאה מהאמור לעיל, מוזכרed ותהליכים אחרים, נוזל apoplastic עלה מכילים מגוון של חלבונים, סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו, מטבוליטים שניוניים, מתכות וקטיונים אחרים (למשל, Mg ^{2 _+,} K ^+, Na ^{+, 2 +} Ca, Fe ^{2/3 +).} הריכוזים מומסים באפופלסט של יורה נשלטים במידה רבה על ידי האיזון של תהליכים המתרחשים בין תחבורת אפופלסט והעצה, והשיפה ציטופלסמה ^9. עם זאת, תגובות מטבוליות והתפתחותם של חיידקים גם לצרוך או לייצר מומסים apoplastic. הרכב אפופלסט ידוע שונה בין מיני צמחים וגנוטיפים ובתגובה לשינויים בתנאים סביבתיים כולל אור, תזונה ויוטיים ולחצי אביוטי ^9. על ידי לימוד בהרכב אפופלסט וכיצד הוא משתנה, כולל מאפיינים כגון חיזור ופוטנציאל האוסמוטי, pH, מזין / זמינות המטבוליט ופעילות האנזימטית, אחד יכול לקבל תובנות רומן לכיצד צמחים מחדשspond לסביבתם. הבנה או המאפיין את השינויים המולקולריים המתרחשים בפתרון אפופלסט מסובכת כי זה תא במרחב מובנה ודינמי שבו מטבוליטים ו / או יונים עשויים להיות תנודתי, חולפים או הקשורים לקיר התא וקרום פלזמה. יתר על כן, שיטות אנליטיות שונות נדרשות כדי לכסות את מגוון סוגים שונים כימיים של.

כדי לחקור את ההרכב של אפופלסט המסיס, נוזל בדרך כלל צריך להיות מופק מהרקמות. מספר שיטות קיימות כדי לחלץ אפופלסט נוזל מרקמות שונות, כולל שיטת רצועת מסנן מוצעת חדש ^10, אבל שיטת החילוץ שהוקמה ביותר לעלים היא חדירה-צנטריפוגה. טכניקה זו הוערכה בעבר ^11-13 וLohaus et al. 2,001 ¹⁴ לספק בדיקה יסודית של רבים מפרמטרים הטכניים של השיטה. כפי שמשתמע מהשם, החדירה-centrifuטכניקת gation היא שיטת שני שלבים שבעצם כרוכה החלפת המרחב האווירי apoplastic עם נוזל המימי הסתננות, שמתערבב עם נוזל apoplastic הילידים, ואחרי התאוששות של החדירה / תערובת נוזלי apoplastic ידי צנטריפוגה העדינה של העלים. כנוזל התאושש מדולל ואינו מכיל את כל התרכובות הנמצאות באפופלסט (ראה להלן), נוזל זה ידוע בכינויו אפופלסט נוזל כביסה (AWF), או נוזל כביסה לפעמים אינטר, ולא נוזל apoplastic. טכניקת החדירה-צנטריפוגה היא להרחבה בקלות ומאפשר דגימות AWF יחידים או משולבות של נפח מספיק כדי להיות שנוצרו ונתונים למגוון רחב של טכניקות ביוכימיים ואנליטיות במורד הזרם (לדוגמא, אלקטרופורזה חלבון, מדידת פעילות אנזים, NMR, סוגים רבים של כרומטוגרפיה ומסה ספקטרומטריית). עלה AWF שימושי גם כאפופלסט מחקת מדיום גידול ללימוד האינטראקציה של שנינות חיידקים מפעל התישבותh סביבתם ^5.

בפרוטוקולים הבאים אנו מתארים כיצד לבצע את טכניקת החדירה-צנטריפוגה באמצעות Phaseolus vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים, ולספק כמה דוגמאות לניתוחים במורד הזרם, עם דגש על metabolomics. חשוב לציין, שיטות להערכת האיכות של AWF מסופקות יחד עם עצות כדי לייעל את ההליך עבור סוגים שונים עלה.

Protocol

הערה: הבחירה של חומר מוצא עלה וסטנדרטיזציה של תנאי גידול צמחים היא קריטית כגורמים אלה יכולים להשפיע על האיכות, השתנות ותשואה של AWF (איור 1) באופן משמעותי. פרמטרים לשקול מוצגים בלוח 1 והם דנו בפירוט רב יותר בדיון.

פרמטר	standardizations דוגמא
	vulgaris Phaseolus	Solanum lycopersicum	thaliana ארבידופסיס
טיפוס עלה	עלים אמיתיים הראשונים, הרחיבו באופן מלא, בריא	עלים 2 nd ו-3 מתחילים מלמטה, 4 עלונים הגדולים ביותר שצולמו עלון הפסגה אינו משמש להפקת אפופלסט	עלים שושנה הרחיבו באופן מלא
גיל צמח	21 ימים	7-9 שבועות	7 שבועות
שעה ביום	אמצע תקופת אור (12:00)	אמצע תקופת אור (12:00)	אמצע תקופת אור (12:00)
הידרציה	כל הצמחים שהושקו 1 שעה לפני קציר גם	כל הצמחים שהושקו 1 שעה לפני קציר גם	כל הצמחים שהושקו 1 שעה לפני קציר גם
אור	16 שעות אור, 400 מ 'μmol -2 שניות -1	16 שעות אור, 400 מ 'μmol -2 שניות -1	10 שעות אור (יום קצר) משבוע 2, 400 מ 'μmol -2 שניות -1
לחות	70%	70%	70%
טמפרטורה	אור C ° 22, 18 ° C כהה	אור C ° 22, 18 ° C כהה	21 ° C

1. דוגמאות שולחן של parame הסטנדרטיters לעלים משמשים בעקירות AWF.

נוזל כביסה 1. יצירת אפופלסט

הערה: במהלך materila מסוכן פרוטוקול זה inculding פתוגנים חיידקים מעלים נגועים לא צריכה להיות נשטפת לביוב; יש להשתמש בנהלי רשות ולא ראויים.

1. בחר מכשירים הבוסס על גודל עלה:
   1. לחדור עלים קטנים יותר (למשל, ארבידופסיס, שעועית) באמצעות מזרק מחטים. השתמש בבקבוק ואקום לחדור עלים כי הם גדולים מדי כדי להתאים במזרק. השתמש בשיטת בקבוק הוואקום לחדור עלים מרובים בו זמנית.
   2. חלק עלים כי הם גדולים מדי לשיטת החדירה זמינה לחלקים קטנים יותר באמצעות סכין גילוח. חלקי עלה לשטוף ביסודיות לחתוך במים מזוקקים לפני הסתננות להסרת מזהמי cytoplasmic שלהפריש מהתאים פגועים.
2. חדירה ליף באמצעות מזרק 60 מיליליטר:
   1. לנתק את העלה ממפעל בפטוטרת באמצעות סכין גילוח. לעלי מתחם כגון עגבניות, לנתק את העלונים בpetiolule.
   2. יש לשטוף את העלים טריים נכרת על ידי טבילה במים מזוקקים להסרת מזהמי משטח עלה. ייבש את העלים בעדינות על ידי סופג עם רקמה או נייר סופג.
   3. מדוד את המשקל עלה לפני החדירה.
   4. מגלגלים בזהירות ו / או לקפל את העלה לתוך מזרק 60 מ"ל ולמלא את המזרק עם מים מזוקקים (ניתן להשתמש בנוזלי חדירה אחרים, ראו דיון). הוצא את כל אוויר שבתוך המזרק תוך הפחתת הבוכנה לכ סימן 40 מיליליטר.
   5. מכסה את קצה המזרק עם או אצבע עטויה בכפפה או חתיכת Parafilm, ולאחר מכן ליצור לחץ שלילי בתוך המזרק ידי משיכת הבוכנה כלפי חוץ כדי סימן 60 מיליליטר. לאט לאט לשחרר את הבוכנה.
      הערה: מהירות שחרור הלחץ עלול לגרום לתמוגה תא וזיהום cytoplasmic.
   6. נתק את קצה המזרק ולהוציא את כל אוויר, אז replug הקצה והעיתונותמטה נוסף על הבוכנה כדי ליצור סכום צנוע של לחץ חיובי.
   7. חזור על שלבים 1.2.5 - 1.2.6 עד העלה הוא שחדר באופן מלא, כפי שניתן לראות בצבע הכהה של האזורים שחדר.
   8. הסר את העלים מהמזרק. בעדינות אך ביסודיות למחוק את העלה עם נייר סופג כדי להסיר נוזל פני השטח.
   9. מדוד את המשקל של העלה שחדר. חשב את ההבדל במשקל לפני ואחרי החדירה שמדמה את חדירת הנפח מקרוב.
3. עלה חדירת בקבוק ואקום:
   1. לנתק את העלה מהמפעל בפטוטרת באמצעות סכין גילוח.
   2. יש לשטוף את העלים טריים נכרת על ידי טבילה במים מזוקקים להסרת מזהמי משטח עלה. ייבש את העלים בעדינות על ידי סופג בנייר סופג.
   3. מדוד את המשקל עלה לפני החדירה.
   4. מניחים את העלה (או משאיר אם חדירת עלים מרובים) בשיתוף בקבוק זרוע 250 מיליליטר או גדולים יותר בצדntaining מים מזוקקים (ניתן להשתמש בנוזלי חדירה אחרים, ראו דיון). באופן מלא לכסות את העלים עם הנוזל.
   5. החלת ואקום לבקבוק. בעדינות להתסיס כדי לשחרר את בועות האוויר מהעלים. לאט ובזהירות לשחרר את הוואקום.
      הערה: מהירות שחרור הוואקום עלולה לגרום תמוגה תא וזיהום cytoplasmic.
   6. חזור על שלב 1.3.5 עד העלה הוא שחדר באופן מלא, כפי שניתן לראות בצבע הכהה של האזורים שחדר.
   7. הסר את העלים מהבקבוק. בעדינות אך ביסודיות למחוק את העלה עם נייר סופג כדי להסיר נוזל פני השטח.
   8. מדוד את המשקל של העלה שחדר. חשב את ההבדל במשקל לפני ואחרי החדירה שמדמה את חדירת הנפח מקרוב.
4. שחזור של AWF ידי צנטריפוגה:
   1. מניחים את העלה על פיסת 4 אינץ '(10 סנטימטרים) Parafilm הרחב. באמצעות קצה פיפטה 5 מיליליטר (או אובייקט בגודל דומה),להפשיל את העלה בתוך Parafilm.
   2. הכנס את העלה מגולגל עם קצה פיפטה לתוך מזרק 20 מיליליטר. מקם כל קצות עלים חתוכים כלפי מעלה. הכנס את המזרק לתוך צינור פוליאתילן או פוליקרבונט 50 מיליליטר נקי.
   3. צנטריפוגה המזרק בתוך הצינור למשך 10 דקות XG ב 1000 בהרוטור דלי מתנדנד על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בדיקה חזותית של העלים הבאים צנטריפוגה צריכה לחשוף כי הרוב המכריע של נוזל החדירה כבר גורש. כתמים ירוקים כהים מצביעים על כך שנדרש זמן נוסף צנטריפוגה.
   4. פיפטה AWF התאושש לתוך צינורות 1.5 מיליליטר טריים.
      הערה: הנפח של AWF צריך כ להתאים את חדירת הנפח לעלה ש; אם הנפח הוא פחות זמן צנטריפוגה נוסף או נדרשת מהירות צנטריפוגה.
   5. צנטריפוגה דגימות AWF ב 15,000 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את כל תאים או חלקיקים. לחלופין, להעביר את AWF דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לרםve תאים וחומר חלקיקים.
   6. פיפטה supernatant לתוך צינור טרי. שמור על דגימות קרח עד אחסון.
   7. אחסן את דגימות AWF ב -80 ° C.

2. מבחני לcytoplasmic זיהום

1. שמור את דגימות AWF על קרח כדי למזער את התגובות אנזימטיות (למשל, proteolysis) ולבצע את מבחני מייד לאחר צעדי צנטריפוגה הם מוחלט.
   הערה: למבחני המטבוליט, דגימות יכולות להיות קפוא מייד לאחר חילוץ ומאוחסנות ב -80 ° C עד שימוש.
2. לdehydrogenase malate סטנדרטי (MDH) פרוטוקול assay לראות ^15; אחרת השתמש בערכת assay MDH זמינה מסחרי.
3. לdehydrogenase גלוקוז-6-פוספט הסטנדרטי (G6PDH) פרוטוקול assay לראות ^16; אחרת השתמש בערכת assay G6PDH זמינה מסחרי.
4. לכימות של מטבוליטים cytoplasmic כגון גלוקוז-6-פוספט (G-6-P) להשתמש GC-MS כפי שתואר בשלב 5 . אחרת, השתמש בערכה זמינה מסחרי עבור assay הישיר של G-6-P.

3. חישוב אפופלסט דילול פקטור

1. הכן שני כרכים של נוזל החדירה בשימוש מעל בשלב 1.2.4 או 1.3.4 (למשל מים מזוקקים,). להוסיף אבקה ארגמן אינדיגו לפתרון אחד לריכוז סופי של 50 מיקרומטר, תוסיף דבר לאחרים.
2. מדוד את הספיגה ב 610 ננומטר (OD ₆₁₀₎ של 200 μl של פתרון החדירה ארגמן אינדיגו עם קורא צלחת. תקן ערך זה על ידי הפחתת OD ₆₁₀ של 200 μl של פתרון חדירה ללא ארגמן אינדיגו. להחליף ערך תיקן את זה כOD _{610infiltrate} למשוואה להלן.
3. לבצע לפחות שלוש חדירות עלה לשכפל כאמור לעיל (שלב 1.2 או 1.3) עם פתרונות החדירה שניהם (עם ובלי ארגמן אינדיגו).
4. לאחר החדירה, rinse העלים במים מזוקקים כדי להסיר כל נוכחים ארגמן אינדיגו שנותרו על המשטחים החיצוניים.
5. להמשיך בצנטריפוגה כאמור לעיל (שלב 1.4).
6. לקבוע את OD הממוצע ₆₁₀ של 200 μl של עקירות AWF ארגמן אינדיגו. תקן ערך זה על ידי הפחתת OD ₆₁₀ הערך הממוצע של 200 μl של AWF החופשי ארגמן אינדיגו. להחליף ערך תיקן את זה כOD _610AWF למשוואה להלן.
7. לחשב את הגורם לדילול (כלומר, לקפל דילול) מערכי הספיגה תיקנו כ:
   גורם לדילול אפופלסט = OD _{610infiltrate} / _{(610infiltrate} OD - OD _610AWF)
8. ערכי ריכוז או פעילות כפל מAWF על ידי גורם הדילול להעריך את הריכוז / פעילות בנוזל apoplastic בPlanta.

4. ריכוז של AWF לחוזק מלא על ידי ייבוש בהקפאה

1. הפעל את ההקפאה-היבש וllow זה להתייצב בטמפרטורה ובלחץ העבודה.
2. בריכה את הכמות הרצויה של דגימות AWF טריות או מאוחסנות.
3. להפיץ את הדגימות באופן שווה בין 2 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
4. לקבוע את הכינון מחדש נפח:
   הכינון מחדש נפח = נפח לפני גורם לדילול ייבוש בהקפאה / אפופלסט
5. עם המכסים סגורים, להקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי.
6. העברת הצינורות קפואים לכלי הקפאת ייבוש מצוננים אחד או יותר. בעת העברת הצינורות, להחליף את המכסה עם אחד שכבר נקב באמצעות חפצים חדים כדי לאפשר חילוף גזים.
7. צרף את כלי להקפאה-היבש וLyophilize הדגימות לחלוטין.
8. הסר את הדגימות מהמכונה ולגבש מחדש את AWF על ידי הוספת הכמות המחושבת של מים מזוקקים.
9. החזר את מכסה unpierced ולאחסן הדגימות ב -80 ° C.

5. המטבוליט ניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסת ¹⁷

1. 200 μl פיפטה של ​​AWF לתוך צינור 1.5 מיליליטר
2. להוסיף 700 μl של מתנול המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר ribitol כסטנדרט פנימי.
3. חום על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 11,000 x ז.
5. העבר את 700 μl של supernatant לצינור 1.5 מיליליטר טרי.
6. להוסיף 375 μl של כלורופורם ומערבולת קרים במשך 10 שניות.
7. הוסף 500 μl של DH ₂ O ו מערבולת למשך 10 שניות.
8. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 2200 x גרם.
9. העבר את 150 μl של השכבה העליונה המימית לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש, ולאחר מכן לייבש את הדגימות לחלוטין ברכז ואקום ללא חום.
10. ממיסים את הדגימות ב -30 μl של פירידין המכילות 20 מ"ג / מיליליטר hydrochloride methoxyamine.
11. לדגור על 70 מעלות צלזיוס בזמן טלטול נמרץ לשעה 2.
12. הוסף 50 μl של MSTFA (trifluoroacetamide N-methyl-N- (trimethylsilyl)).
13. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בזמן הרעד במשך 30 דקות.
14. העברת דגימות לGC-MS compצלוחיות זכוכית atible.
15. לבצע ניתוח GC-MS של הדגימות. עיין Lisec et al. 2009 ^17, לפרטים על התקנת ציוד GC-MS וביצועים.

Results

תוצאות אופייניות לעקירות AWF בוצעו על פ '3 בשבוע הישן הבריא vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים, שימוש במים מזוקקים כמו נוזל החדירה מוצגים בטבלה 2. הצעיר P. העלים vulgaris נוחות לחדירה, ובמהירות צנטריפוגה משמשת כאן (1000 XG) הסרת הרוב של חדירת נוזלים על ידי צנטריפוגה ניתן לראות באופן ישיר כעלים לחזור לצבע הירוק המקורי שלהם. P. משקל טרי עלה vulgaris היה על XG 1.1 הממוצע לפני החדירה והניב 0.5 מיליליטר של AWF למשקל טרי גרם. ריכוז החלבון של AWF היה נחוש להיות 0.18 ± 0.08 מ"ג / מיליליטר באמצעות שיטה ברדפורד סטנדרטית. הגורם לדילול לעלים אלו המחושבים על ידי מדידת דילול ארגמן אינדיגו, היה 2.3 ± 0.3 קיפול. הערכים הנ"ל יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מינים וניסויים פיילוט נדרשים על מנת לקבוע את התשואה של AWF לנו טרי עלה גרםight, כמו גם את ריכוז AWF חלבון וגורם לדילול שניתן לצפות לסוג עלה נתון.

נזק לשלמות התאים יכול להתרחש גם במהלך שלב החדירה, אם השינויים בלחץ הם מהירים מדי, ובמהלך שלב צנטריפוגה אם הכוח הצנטריפוגלי הוא גבוה מדי. לכן, יש לassay דגימות AWF לסמנים של זיהום cytoplasmic; באופן אידיאלי, מבחני עצמאיים רבים מבוצעים. כאן, התוצאות משלושה מבחני אפשריים מדווחות בטבלה 2. בעקירות מבוצעות היטב של P. vulgaris AWF, G6PDH היה ​​בלתי ניתן לגילוי על ידי assay אנזים סטנדרטי. זה עולה בקנה אחד עם דיווחים אחרים שבו פעילות G6PDH הופכת לגילוי רק מעל כוח הצנטריפוגלי סף ^12. בניגוד לכך, רמה בסיסית של פעילות malate dehydrogenase (2.5 U / ml) הייתה להבחין בכל P. דגימות vulgaris AWF באמצעות assay חילוף חומרים סטנדרטי. הגדלת צנטריפוגלי לce מעל סף של 1,000 XG הביא פעילויות MDH מוגברות (תוצאות לא מוצגות). כאפופלסט ממינים אחרים ידוע מכיל פעילות MDH אנדוגני ^18, הסכום שזוהה כאן נחשב פעילות apoplastic אמיתית ועליות משמעותיות מעל רמת בסיס זה הוא מעיד על זיהום. מטבוליטים שנחשבים בעיקר cytoplasmic, כגון hexose-6-פוספטים, יכולים לשמש גם כדי להעריך את הזיהום של AWF. כאן, ניתוח GC-MS זוהה אפס או עקבות רמות של G-6-P בעקירות AWF. לעומת זאת, בסעיפי שורש תירס לחתוך, G-6-P אותר לאחר מיצוי AWF בכל מהירויות צנטריפוגה וגדל בריכוז במהירויות גבוהות יותר, המצביע על זיהום cytoplasmic ^10.

ניתוח המטבוליט ידי GC-MS של פ vulgaris עלה AWF בדרך כלל תשואות 40-60 מטבוליטים לזיהוי ומספר שווה של תרכובות בלתי מזוהות (איור 2). אוחומצות-אורגניות, סוכרים פשוטים, וחומצות אמינו מייצגים את חלק הארי של מטבוליטים לזיהוי, לעומת זאת, מטבוליטים שניוניים צמח גם זוהו ולכמת מ ^-11 AWF. כמה פסגות דוגמא משיעורי מולקולה השונות אלה מסומנות באיור 2 שיטות אנליטיות במורד הזרם נוספות החלות על דגימות AWF אלה לכמת מולקולות שונות, לדוגמא:. ICP-MS, NMR, HPLC, ספקטרום בליעה אטומי, ספקטרומטר מסת חלבון.

מרכיב החלבון של אפופלסט מיוצג גם בAWF כפי שמוצג בג'ל צבעי קומסי SDS-PAGE המוכתם באיור 3. בין תפקידים אחרים, אנזימי apoplastic אחראים לסינתזה של דופן התא ויצירת תגובה תאית מיני חמצן. מחקרי proteomic של AWF ממינים שונים זיהו עשרות חלבונים בודדים והראו כי מרכיב החלבון של אפופלסט מגיב לEnviroלחץ nmental ^13,19. באופן אידיאלי תמצית AWF צריכה להיות חופשית מזיהום על ידי חלבוני cytoplasmic כגון Rubisco; עם זאת בפרקטיקה זו היא קשה להשגה. הנוכחות של להקת חלבון Rubisco ב ~ 53 kDa הבא SDS-PAGE מספקת assay איכותי נוסף ליושרה של דגימות AWF. לדוגמא, המדגם הטעון במסלול 2 באיור 3 מכיל כמות גדולה יותר של זיהום Rubisco זה של מסלול 1.

	Phaseolus vulgaris AWF
נפח של AWF (ז -1 FW עלה מיליליטר)	0.49 ± 0.09
קונצרט כלשהו חלבון. (מ"ג מיליליטר -1)	0.18 ± 0.08
גורם לדילול	2.3 ± 0.3
פעילות G6PDH (U מיליליטר -1)
Glc-6-P (מ"ג מיליליטר -1)	אף זוהו
פעילות MDH (U מיליליטר -1)	2.5 ± 0.9

תוצאות אופייניות טבלה 2. לעקירות AWF מפ vulgaris קורות חיים. Tendergreen עלים.

איור 1. זרימת עבודה חילוץ אפופלסט תקן. המספרים מתייחסים לצעדים בפרוטוקול.

איור 2. דוגמא chromatogram GC-MS של P. Vulgaris קורות חיים. . Tendergreen AWF פסגות דוגמא המטבוליט הממוספר הן: 1-malonate, 2-פוספט, 3-succinate, 4-ידוע, 5-malate, 6-asparagine, 7-ribitol (st הפנימיandard), 8-ציטראט, 9-גלוקוז, 10-אינוסיטול, חומצת 11-caffeic, 12-סוכרוז.

איור 3. דוגמא SDS-PAGE Coomassie מוכתם ג'ל של P. Vulgaris תמציות עלה AWF. ג'ל זה מספק השוואה בין מרכיבי החלבון של שתי עקירות AWF שונים בסך של זיהום cytoplasmic על ידי אנזים plastidial שפע Rubisco. לאחר מיצוי AWF שני הדגימות היו נתונים למשקעי חלבון אצטון בעודף של פי 4 (V / V) של אצטון הקר וresolubilized במים בעשירית הנפח המקורי. נתיבים 1 ו -2 מכילים 40 מיקרוגרם של חלבון. הלהקה המתאימה לרשת הגדולה Rubisco (~ 53 KDA) מצויינים על ידי חץ. _r M: חלבון סמני משקל מולקולרי.

Discussion

אופטימיזציה של מקור רקמות הצמח

וריאציה ביולוגית וטכנית יכולה להיות גדולה בעת ביצוע אפופלסט עקירות, ובכך זרימת עבודה סטנדרטית מאוד מועילה להגדיל המשכיות בניסויים (איור 1). חשוב לציין, המקור של רקמות צמח חייב להיות אחיד, כולל טיפוס עלה, גיל עלה, צמיחה / תנאים סביבתיים ושעה ביום (טבלת 1). הבדלים גדולים קיימים בקלות שבה עלים שונים הסתננו וAWF התאושש לאחר מכן על ידי צנטריפוגה; הבדלים אלה מתואמים עם מספר הפיוניות, גודל צמצם והתנגדות mesophyll ^12,14. גם בקרב זנים שונים של פ vulgaris יש הבדלים גדולים בקלות ובתשואה של הליך מיצוי AWF; לעלי דוגמא למגוון Tendergreen משמש כאן הם נוחים יותר למיצוי AWF שימוש בשיטה זו מוונדר הזן הקנדי. בתוךפ vulgaris העלים האמיתיים הראשונים הם הגדולים ביותר והקלה ביותר לחדור, מה שהופך אותם הבחירה הברורה עבור עקירות apoplastic. Apoplastic האוויר ומים בנפח הוכח להשתנות עם גיל עלה בכמה מינים שמובילות להבדלים בextractability AWF ^12,14. בפ vulgaris, העלים מבוגרים הפכו באופן משמעותי יותר קשה לחדור ותניב פחות AWF על צנטריפוגה; לכן עלים נקצרו כאשר הם הגיעו לרחבה מלאה. עלים שקשה לחדור לאחר מכן דורשים מהירויות גבוהות יותר צנטריפוגה להתאושש AWF. אחד ולכן צריך להקרין כמה סוגי עלים שונים וזנים בזהירות לפני שתחליט על מקור רקמה לעקירות AWF בקנה מידה גדולה.

תנאי גידול צמחים גם חייבים להיות אחידים ככל האפשר במסגרת הניסוי. השימוש בארונות צמיחה עדיף מאחר שהם מאפשרים לחות עולה בקנה אחד, טמפרטורה וניהול תאורהגדודי עוצמת t להישמר. הקציר של עלים תמיד צריך להתרחש באותו הזמן של יום, כי הריכוזים של מטבוליטים, אנזימים, וכו 'משתנים לאורך המחזור ¹⁴ היומי. לבסוף, על מנת להבטיח כי המפעל משאיר לכולם יש לחץ turgor דומה, צריכים להשקות את הצמחים לפני זמן קצר (~ שעה 1) הקציר.

אופטימיזציה של חדירת העלה וצנטריפוגה

זיהום cytoplasmic לא רצוי של AWF בשל תמוגה תא חלקית יגרום אם הלחץ המכני שבם נתקל התאים גבוה מדי במהלך שלבי חדירה או צנטריפוגה. לכן, את ההליך לסוג עלה נתון צריך להיות trade-off בין מותאם למקסם את התשואה ולהקטין את זיהום cytoplasmic של AWF. בכל המקרים, יש להשתמש במהירות צנטריפוגה הנמוכה ביותר בה ניתן לשחזר AWF כדי למנוע הפרעה מכאנית אפשרית של תאי העלה. אופטימיזציה של centrifuמהירות gation צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל סוג עלה ידי ניטור הנפח התאושש ואפופלסט זיהום על פני טווח של מהירויות צנטריפוגה. זה נצפה כי פעילות אנזים סמן, כגון MDH, G6PDH ואיזומראז גלוקוז-פוספט, יישאר נמוך עד כוח צנטריפוגלי סף היא עלתה, ומעליו הפעילויות אלה יגדלו במהירות, ככל הנראה עקב דליפת cytoplasmic ^9,12,14. השימוש בParafilm לתמיכה במהלך שלב צנטריפוגה, כפי שציין בייקר et al. 2012 ^11, יכול לשפר את היעילות של מיצוי AWF ועשוי למזער את הנזק מכאני ללהב העלה שנגרם על ידי קיפול ודחיסה מוגזמים. יתר על כן, השימוש בParafilm משפר הדמיה של העלה לאחר צנטריפוגה כאשר יש לבחון את העלה לנזק ושלמות של חילוץ AWF.

¹² Nouchi לתאר אופטימיזציה של התאוששות AWF מחלקי עלה אורז קיצוץ, שהם דifficult לחדור ודורש מהירויות צנטריפוגה גבוהות כדי לאסוף AWF בגלל הפתחים הפיוניות הקטנים שלהם. השתפר הרטבה של פני השטח העלה האורז, או על ידי presoaking את העלים במים מזוקקים או התוספת של חומרים פעילי שטח לנוזל ההסתננות, אפשר את תהליך החדירה. מהירות גבוהה יותר צנטריפוגה (6000 XG) שימשה גם תוך ניטור לזיהום apoplastic ^12. בעת שימוש בחלקי עלה לחתוך תמיד יש את הסיכון שזיהום cytoplasmic יהיה נפוץ יותר אפילו עם כביסה נרחבת של אתרי הפצע; ולכן צריכים לשמש רק עלים לחתוך במידת צורך.

למחקרים רבים במים מזוקקים משמש כנוזל הסתננות ^11. עם זאת, תרכובות ניתן להוסיף הנוזל החדירה, כגון מלחים או מאגרים, על מנת לשפר את המיצוי של תרכובות apoplastic מסוימות, במיוחד חלבונים ^{13. 14} Lohaus העריך את ההשפעה של כוח יוני והאוסמוטי on הרכב AWF התאושש ומצא אותם להיות זניח. שינויים ב- pH של מדיום ההסתננות, לעומת זאת, עשויים להשפיע על הרכב AWF ^14.

טיפול ואחסון נכון של נוזל apoplastic חילוץ הוא חשוב. AWF הוכח מכיל שפע של פרוטאזות ואנזימים אחרים ^13,20, כמו גם תרכובות אורגניות נדיפות. לכן, כדי להפחית את השינויים בהרכב של AWF לאחר ההחלמה מומלץ לשמור על דגימות קרח או מאוחסן אחר ב -80 ° C. יתר על כן, מבחני האנזימטית של AWF צריכים להתבצע בהקדם האפשרי לאחר החילוץ להגביל איון אנזים בשל proteolysis, דילול ממושך או להקפיא הפשרה.

התהליך של חדירה מדלל את נוזל apoplastic וזה לעתים קרובות יש צורך לקבוע את מידת דילול זה. צעד צנטריפוגה יכול גם לדלל את AWF עם מים מתאים תאיים. גורם לדילול הוא זקוקed להעריך in vivo אפופלסט ריכוזים כימיים כאשר מדידות נערכת בAWF. גורם לדילול נחוץ גם להתרכז AWF חזרה לכוח מלא כאשר הוא בשימוש כאפופלסט מחקת מדיום גידול לחיידקים - ובכך התאמה בריכוזי המטבוליט vivo בצורה מדויקת ככל האפשר. כמה וריאציות קיימות בשיטה המתוארת בשלב 4 לקביעת הגורם לדילול AWF על ידי מדידת הדילול של מתחם סמן נוסף לנוזל ההסתננות. לכל שיטות חישוב דילול AWF מניח שנוזל החדירה לא ניכר נספג או מדולל על ידי תאי העלה במהלך תהליך ההחלמה AWF. הנחה זו אומתה בעבר לצעד הסתננות ¹⁴ אבל הוא לא מאומתת לצעד צנטריפוגה. מתחם הסמן חייב גם לא ייקלט, מועבר או שונה ואילו באפופלסט. ארגמן Indigo הוא נפוץ ביותר ונבדק ביסודיות של צבעים בשימושלחישובי דילול AWF. ארגמן Indigo מציג הספיגה נמוכה לשרף חילוף קטיון וקירות תא מבודדים והוצג להיות מתאים לחישובי AWF בnapus Brassica, Pisum sativum, Solanum lycopersicum וגליצין מקסימום ^11,21,22. עם זאת, בכמה סוגי עלים, למשל, אורז ומלפפון, ארגמן אינדיגו הופיע לא התאושש באופן מלא לאחר חדירה, מה שיוביל להערכה חסרה של הגורם לדילול AWF ^12,21. חוסר ההתאוששות של ארגמן אינדיגו יכול להיות בגלל הרגישות שלו למחשוף לsulfonate isatin ידי סופראוקסיד ^23, אשר ידוע להיות מיוצר באפופלסט, במיוחד תחת לחץ ^24. מחשוף של ארגמן אינדיגו לsulfonate isatin יגרום להפסד של 610 ננומטר הספיגה ב ועלייה ב 245 ננומטר. אם תגובה זו מתרחשת למידה ניכרת באפופלסט, או אם תגובה זו יכולה להיות מעוכבת על ידי התוספת של אוכלי נבלות סופראוקסיד לinfiltratיון נוזל לא נחקר עד כה. dextran הכחול כבר בשימוש במקום ארגמן אינדיגו לכימות של הגורם לדילול AWF באורז משאיר ^12, אם כי לא דווחו על יציבותה והתאוששות בAWF. לחלופין, ניתן להשתמש בתרכובות radiolabelled כגון סורביטול ^[14 C] או סטנדרטים פנימיים לכימות אחרות במקום צבעים והירידה ברדיואקטיביות או ריכוז שנמדד ומשמש לחישוב הגורם לדילול בדרך דומה ^11,14,25.

מגבלות של הטכניקה

כמה אזהרות קיימות לשיטת בידוד AWF ההסתננות-צנטריפוגה. ראשית, הדילול של אפופלסט במהלך החדירה עלול לעורר תגובה מהמפעל. אם תאי העלה סביב לזהות ריכוז מופחת עבור רכיבים מסוימים של נוזל apoplastic, הם עשויים להגיב במפרישים מטבוליטים נוספים, מעוותים את הפרשנות של ריכוזי המטבוליט. בהערכה של בעיה זו זה היה ציין כי לא הזמן ובין החדירה וצנטריפוגה ולא הבדלים מתונים בחוזק היוני של נוזל החדירה השפיע על הרכב של AWF חילוץ ^14,22. לכן, כל חפצים וכתוצאה מאפופלסט דילול הם חשבו להיות מינימאליים.

חסרון שני הוא שפוטנציאל elution של AWF ידי צנטריפוגה לא ללכוד את כל המולקולות הנמצאות באפופלסט מכמה סיבות. תרכובות מסוימות, בקטיונים וחלבונים מסוימים עשויות להיות קשורים באופן הדוק עם דופן תא מטען השלילי ולא elute עם AWF ^13. מולקולות אחרות כגון חלבונים עשויות להיות גדולות מדי לelute ביעילות מתוך אפופלסט במהירויות צנטריפוגה משמשות ^14. מיני חמצן תגובתי הם מעמד חשוב של מתחם מיוצר באפופלסט, אבל בשל האופי קצר מועד של תרכובות אלה, ודרישות שלא פורטו לייצור שלהם, יחסי הציבור שלהםesence לא נתפס היטב על ידי מיצוי AWF. זה לא ידוע כמה במדויק AWF מייצג את הרכב בvivo של נוזל אפופלסט ועשוי להשתנות בין מינים.

כמה מבחני קיימים כדי לקבוע זיהום cytoplasmic, למרות שאף אחד מתקבל באופן אוניוורסלי. מבחני של אנזימים בעיקר cytoplasmic (למשל, G6PDH, איזומראז פוספט hexose, MDH) יש את היתרון של להיות קל לביצוע אבל לא יכול לתאם גם עם דליפת cytoplasmic ^14,18. ההערכה של מטבוליטים cytoplasmic (למשל, פוספטים hexose, כלורופיל) היא אולי מעיד יותר אך פחות הוקמה ¹¹ גם. עם זאת, גם סוג של assay יכול להיות שימושי עבור כימות יחסי של זיהום apoplastic בין דגימות. באופן אידיאלי, יש להשתמש במדידות עצמאיות רבות כדי לאמת את שלמות מדגם AWF.

תוך ההכרה במגבלותיו, החדירה-centrifugatiבטכניקה המתוארת כאן נשאר טכניקה פשוטה וחזקה בחקר חלבוני apoplastic, מטבוליטים ראשוניים ומשניים ויונים אורגניים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות מיקרוצנטריפוגה אפנדורף	22364111
סכין גילוח	Eppendorf פישר	12-640
מזרק 60 מ"ל	בקטון דיקינסון	300865
20 מ"ל מזרק	בקטון דיקינסון	300613
4 אינץ' פרפילם	Bemis	PM-996
בקבוק זרוע צד	SciLabware
צנטריפוגה	בקמן קולטר	392932
רוטור דלי מתנדנד	בקמן קולטר	369702
אינדיגו קרמין	סיגמא	I8130
קורא מיקרופלייט	Tecan	Infinite 200
96 צלחות באר	בקטון דיקינסון	353072
להקפיא מייבש	SciQuip	Christ אלפא 2-4 LD
מיקרוצנטריפוגה	biorad	166-0612EDU
חומצה אוקסלואצטית	Sigma	O4126
D-גלוקוז-6-פוספט	Sigma	G7250
NADH	Roche	10128023001
ערכת בדיקת MDH	Biovision	K654-100
G6PDH ערכת בדיקה	Sigma	MAK015-1KT
ערכת בדיקת G-6-P	Biovision	K657-100
ריביטול	סיגמא	A5502
מתנול	סיגמא	650471
כלורופורם	סיגמא	472476
רכז ואקום	Thermor Scientific	SC250EXP
מתוקסיאמין הידרוכלוריד	סיגמא	226904
N-מתיל-N-(טרימתילסיליל) טריפלואורואצטמיד	סיגמא	394866