הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

14 באוקטובר 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

ניתן להתמיין בתאי גזע עובריים של עכבר לתאי T במבחנה באמצעות מערכת התרבות המשותפת OP9-DL1. הצלחה בהליך זה דורשת תשומת לב קפדנית לתחזוקת ריאגנט/תאים, ושלבים רגישים לטכניקה מרכזית. כאן אנו דנים בפרמטרים קריטיים אלה ומספקים פרוטוקול מפורט לעידוד אימוץ טכנולוגיה זו.

תקציר

מערכת התרבות המשותפת OP9/OP9-DL1 הפכה לשיטה מבוססת היטב להפקת סוגי תאי דם מובחנים מאבות עובריים והמטופויאטיים ממוצא עכברי ואנושי כאחד. כיום הוא משמש לטיפול במגוון הולך וגדל של שאלות גנטיות, תאיות ומולקולריות מורכבות הקשורות להמטופואיזה, והוא נמצא בחוד החנית של המאמצים לתרגם את הממצאים הבסיסיים הללו ליישומים טיפוליים. ההליכים פשוטים ומניבים באופן שגרתי תוצאות חזקות. עם זאת, השגת התמיינות המטופויאטית מוצלחת במבחנה דורשת תשומת לב מיוחדת לפרטים של תחזוקת ריאגנטים ותרביות תאים. יתר על כן, הפרוטוקול כולל צעדים רגישים לטכניקה שאמנם אינם קשים, אך דואגים ומתרגלים כדי לשלוט בהם. כאן אנו מתמקדים בהליכים להתמיינות של לימפוציטים מסוג T מתאי גזע עובריים של עכברים (mESC). אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם דיונים על השלבים והפרמטרים הקריטיים המאפשרים התמיינות תאית חזקה הניתנת לשחזור במבחנה. האינטרס של התחום הוא לשקול אימוץ רחב יותר של טכנולוגיה זו, מכיוון שיש לה פוטנציאל להפחית את השימוש בבעלי חיים, להוזיל את העלות ולקצר את לוחות הזמנים של ניסויים בסיסיים ותרגומיים כאחד.

מבוא

הוקמה מערכת תרבית תאים שבה תאי גזע עובריים של עכברים (mESC) מתמיינים לתאי T במבחנה.1 מערכת זו מנצלת את היכולת של איתות Notch כדי להניע התמיינות של תאי T. 2 קו התאים OP9-DL1 נוצר על ידי התמרת תאי OP9 שמקורם במח עצם3 עם ליגנד Notch, דמוי דלתא 1 (DL1). 4 הפעלת מפל איתות החריץ במבחנה מקלה על התפתחות תאי T ללא שושלות תאים אחרות. עם הכללת ציטוקינים מתאימים, מערכת זו מספקת "מיקרו-סביבה" של תרבית תאים התומכת בהתקדמות הרציפה של mESC לעבר שושלות תאי T המטופויאטיות ובסופו של דבר תאי T. מערכת זו תומכת בזיהוי זרימה ציטומטרי של תאי T בשלבי ההתפתחות השונים הנראים במהלך אונטוגניה תקינה של תאי T בתימוס. לחקירת שאלות נבחרות הנוגעות להתפתחות תאי T, הליך זה הפך לחלופה אטרקטיבית למודלים של עכברים שלמים in vivo 5 ושיטות תרבית איברים תימיים עובריים במבחנה המשמשות לעורר התפתחות תאי T מקודמנים המטופויאטיים שמקורם בתאי גזע עובריים של עכברים. 6 היתרון העיקרי של מערכת התרבות המשותפת של OP9 הוא שהיא מערבת טכניקות סטנדרטיות ופשוטות של תרבית תאים ואינה תלויה בשימוש מתמשך בחיות ניסוי.

אנו פועלים לפי פרוטוקול מפורט שפורסם בעבר בניסויים שלנו בגישה זו. 7 השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לבחון את תוצרי ההתמיינות ההמטופויאטיים של שיבוטי mESC ללא מניפולציה, שיבוטי mESC באיכות גבוהה שנבחרו בקפידה ליצירת עוברים כימריים8 ושיבוטי ESC שעברו טרנספטציה יציבה המגיעים ישירות מבחירת התרופות. 9 ציינו כי הקינטיקה הזמנית של התמיינות ראשונית במבחנה מ-mESC למושבות דמויות מזודרם במודל זה יכולה להיות משתנה בין שיבוטים בודדים. ניתן להעריך חזותית את התרביות המשותפות mESC-OP9 להתקדמות למזודרם. בעוד שזה בדרך כלל יושלם עד היום החמישי של התרבות המשותפת, בקרב שיבוטים בודדים, ההשלמה יכולה להתעכב ליום או יומיים. יש להשיג היווצרות מזודרם כמותית (~80-90%) לפני ההעברה על מנת להשיג היווצרות אופטימלית של תאי אב המטופויאטיים (HPC) ולימפופואזיס חזק. לפיכך, כאשר עובדים עם שיבוטי mESC מרובים, עדיף לעכב את המעבר הזה של "יום 5" עד שכל השיבוטים ישלימו את המעבר למושבות דמויות מזודרם. זה מאפשר סנכרון של ההתפתחות הבאה בין השיבוטים לאחר העברתם לתנאי התמיינות המטופויאטיים. שלושה ימים לאחר המעבר של 80-90% תצורות מזודרמליות, HPCs נאספים מהחד-שכבות של OP9. ניתן לזרוע HPCs על תאי OP9 חדשים כדי לאפשר התמיינות של שושלות תאי מונוציטים, אריתרואידים ו-B. לחלופין, ניתן לזרוע HPCs על תאי OP9-DL1 ולהניע אותם לקראת התפתחות תאי T. כל תרביות ההתמיינות במבחנה מסופקות Flt-3L החל מהיום החמישי, עם תוספת נוספת של IL-7 החל מהיום השמיני. ניתוחי זרימה ציטומטרית המבוצעים בנקודות זמן שונות במהלך הניסוי מאפשרים מעקב אחר ההתקדמות בשלבים ובשושלות של התמיינות המטופויאטית והתפתחות תאי T. תאי T חיוביים כפולים (DP) CD4/CD8 מתחילים להופיע ביום ה-16 של התרבית המשותפת, ותאי DP ו-CD8 חיוביים יחידים (SP) נמצאים בשפע עד היום ה-20. התוצאה הכללית והחוסן של תרבות משותפת תלויים במידה רבה ביכולת לוודא חזותית את השלמת נקודות המפנה ההתפתחותיות המשמעותיות המתרחשות. פרוטוקול זה נועד להוות מדריך להכרה באבני דרך אלה, כמו גם בפרמטרים קריטיים אחרים, המהווים מפתח לבידול מוצלח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

.1 הכנת תרבות מדיה, ציטוקינים וצלחות gelatinized

  1. הכן תקשורת בתאי גזע עובריים באמצעות השינוי של Dulbecco של בינוני של הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה ופירובט נתרן. להוסיף ESC 20% מוסמכים בסרום שור העוברי (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, 1% HEPES הצפת, 1% שאינם חיוניות חומצות אמינו, 0.1% גנטמיצין (50 מ"ג / מ"ל) ו0.1% ( 55 מיקרומטר) β-mercaptoethanol. לעקר תקשורת בתאי גזע עובריים על ידי סינון.
  2. הכן תקשורת OP9 על ידי הפיכת 1 ליטר של אלפא בינוני מינימום הכרחי (α-MEM) מאבקה על פי הוראות היצרן. הוסף 20% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. הפוך לערבב. לעקר על ידי סינון לשני 500 aliquots מ"ל.
    הערה: השימוש במדיה עשויים מאבקה מומלצת וצפוי להניב תחזוקת תא OP9 משופרת ובתוצאות בידול מבחנה. גישה זו הפכה ההליך הרגיל שלנו. עם זאת, אנחנו גם לציין that יש לנו בזמנים המשמשים נוזל שהוכן מראש, α-ממ עם הצלחה מספקת.
  3. הכן הקפאת תקשורת על ידי הוספת 10% דימתיל sulfoxide (DMSO) ל90% FBS. מערבולת בעדינות ולעקר על ידי סינון. חנות ב 4 ° C..
  4. הכן 2,000x יגנד Flt-3 (10 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי המסת Flt-3 יגנד רקומביננטי האנושי (Flt-3L) בתקשורת OP9 מלאה ל10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עקוב אחר ההמלצות של הספק בנוגע ליציבות ואחסון.
    הערה: היציבות של Flt-3L היא קצרה (1 חודש על 4 מעלות צלזיוס או 3 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס).
  5. הכן 1,000x IL-7 (1 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי שימוש בתקשורת OP9 מלאה. Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. עקבו אחר המלצותיו של הספק על יציבות ואחסון (IL-7 הוא יציב עד 12 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס).
  6. הכן 1,000x לוקמיה מעכב פקטור (LIF) (10 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי דילול 1:10 10 7 יחידות של i LIFn תקשורת בתאי גזע עובריים. aliquot החנות ב 4 ° C.. הקפד לשים לב לתאריך התפוגה הניתן על ידי היצרן בבקבוקוני aliquot.
    הערה: המוצר הוא יציב בצורה 18 חודשים לפחות מרוכזים או מדוללים ממועד הייצור.
  7. הכן 6 גם צלחות gelatinized ידי להוסיף 1.5 פתרון ג'לטין מ"ל של 0.1% לבאר כל צלחת 6 היטב. משאיר את הכלים בשכונה סטרילי בטמפרטורת חדר עם מכסים על, המאפשר לפחות 30 דקות לציפוי. המנות גם ניתן להשאיר בלילה חממת humidified. הסר את כל פתרון ג'לטין שאריות ממש לפני זריעת תאים. אל תתנו פתרון ג'לטין להתייבש לחלוטין בבאר.

2 הכנה ותחזוקה של תאים מזין ותאי עכבר גזע עובריים (המסקלין)

הערה: דגירה כל התאים ב37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2.

  1. הפשרת Fibroblasts העכבר עוברי (MEF)
    1. Quick-להפשיר בקבוקון קפוא (~ 5 x 10 6 תאים / בקבוקון) של MEFs mitomycin (או בדרך אחרת נעצר mitotically שטופל C) ולהעביר אותם לצינור 15 מ"ל.
    2. הוסף 8 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים לתאים המופשרים, בצורה טיפה חכמה כדי לדלל בהדרגה את DMSO ממדיום ההקפאה.
    3. תאי צנטריפוגה ב400 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים.
    4. הכן צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם 33 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים מראש חימם. מוסיף את 3 מ"ל של MEFs המושעה להביא את הנפח הסופי 36 מ"ל.
    5. הפץ 3 מ"ל של MEFs המושעה לכל טוב משני לוחות gelatinized 6 היטב. מקם את הצלחות לאינקובטור במשך לפחות שש שעות על מנת לאפשר לתאים לצרף ונפרשו לפני זריעת mESCs עליהם. שכבות מזין נעצרו mitotically אלה עשויות להיות שמישים במשך כמה ימים לאחר זריעה ראשונית, אם אמצעי התקשורת שלהם משתנה כל 2-3 ימים.
      הערה: יכול לשמש גם MEFs נעצר טרי.
    6. mESCs זריעה
      1. Quick-להפשיר בקבוקון עם שיבוט המסקלין קפוא באמבט המים 37 מעלות צלזיוס ולהכין תאים כפי שמתואר ב2.1.1-2.1.3.
        הערה: אנו להקפיא 2 בקבוקונים של המסקלין מבאר ומחוברות של צלחת 6 היטב.
      2. הסר את המדיה מהיטב אחד (מחיר לשיבוט המסקלין) של הצלחת 6 היטב עם monolayers MEF נעצר (מוכן בשלב 2.1.5) וזרעי 3 מ"ל של mESCs על גבי monolayer MEF. הוסף 3 μl של 1,000x LIF (מ"ל / 10 ng). חזור מנות לתוך החממה.
    7. תחזוקת תאי גזע עובריים והמעבר טריפסין תיווך
      הערה: המדיה שינוי יומי, או פיצול המבוסס על מפגש של המסקלין. בצורה אופטימלית, קציר ופיצול / מחדש צלחת תאים בכל יום אחר.
      1. הסר את המדיה בתאי גזע עובריים ולשטוף mESCs עם 2 מ"ל של PBS. הסר PBS. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.25% ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות.
      2. איסוף תאי trypsinized ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. במרץ pipet ההשעיה התא לפרק את הגושים של mESCs. הוסף 2 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים מלאה להשעית התא על מנת לנטרל את טריפסין.
      3. תאי ספין בx גרם 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ"ל תקשורת בתאי גזע עובריים.
      4. הסר את המדיה מ6 צלחות המכילות גם הכין monolayers MEF נעצר. להוסיף את הכמות המתאימה של ההשעיה התא (המבוססת על יחס הפיצול הרצוי) ב 3 מ"ל של תקשורת בתאי גזע עובריים לכל טוב שזרע. הוסף 3 μl של LIF 1,000x. מחוברות המסקלין לפצל גם 1: 6 תהיה מוכן למעבר ב2 ימים.
    8. OP9 / תחזוקת תא OP9-DL1
      1. להפשיר בקבוקון של תאי OP9 (בצע את השלבים 2.1.1-2.1.3 באמצעות מדיה OP9)
      2. הוסף מדיה OP9 7 מ"ל לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר. מוסיף את 3 מ"ל של תאי resuspended באופן טיפה חכמה, הפצת תאים בכל הצלחת. מניחים את תאי לילה בחממה.
      3. בדוק את נקודת המפגש של תאי OP9 למחרת. אם המנה מכילה הרבה תאים צפים מתים, רמוve התקשורת ולהוסיף 10 מ"ל של תקשורת OP9 הטרי. להחזיר את הצלחת לחממה אם מפגש כמעט מלא לא נצפה. פיצול (באמצעות טריפסין) 1: 4 monolayer OP9 המחוברות הקרוב.
        הערה: צלחות צריכה להגיע באותה רמת מפגש שוב בכ -2 ימים. יש להיזהר שלא לתת לתאי OP9 להיות מעל ומחוברות.
      4. להקפיא את הקטעים המוקדמים של תאי OP9 כמניות הרחבה.
        הערה: אנו להקפיא 2 בקבוקונים של תאי OP9 מאחד ליד מחוברות 10 צלחת סנטימטר. כל בקבוקון של מניית הרחבה יכול להיות מופץ נוסף כדי ליצור מניות עבודה שמאוחר יותר השתמשו בניסויי שיתוף תרבות המסקלין. שמור את כל מניות OP9 קפואות בחנקן נוזלי ולא ב-80 ° C המקפיא, מאז טמפרטורות משתנים באופן שלילי יכולות להשפיע על האיכות של קופא.

    .3 נוהל משותף תרבות OP9-DL1

    1. הכנות משותפת התרבות
      1. כשבוע לפני תחילת שיתוף תרבות, להפשיר MEFs, mESCs ואבני תא OP9 עובדיםcks. מאחר ותאי OP9-DL1 אין צורך עד שיום התרבות משותפת 8, להפשיר את תאי OP9-DL1 במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר תחילת שיתוף התרבות. לשמור או להקפיא את כל התאים בהתאם לצורך.
      2. לקבוע את המספר הראשוני של 10 צלחות סנטימטר עם monolayers תא OP9 מוכן להגיע 80 מפגש% על שיתוף תרבות יום 0 מבוססים על הסולם של הניסוי (למשל, מספר השיבוטים המסקלין להיות מובחן ומספר נקודות זמן שיתוף תרבות ל להיות מנותח). כדי להתכונן לשיתוף תרבות, לפצל ליד צלחת ומחוברות של OP9 תאים בין 1: 4 ו 1: 6 יומיים לפני כאשר יהיה צורך monolayers.
        הערה: אחת יצטרך צלחת אחת לפחות לשיבוט ESC. בדרך כלל, שיבוט ESC יחיד זורעים על צלחת אחת (כמפורט להלן) ביום 0 אמורים להניב מספיק תאי זרע שש צלחות במעבר יום 5. כל צלחת יום 5 תאפשר נקודת זמן ניתוח שלאחר מכן אחד.
      3. מאז monolayers OP9 יהיה צורך ללא הרף למעבר שיתוף התרבות, דואג לתמיד maintaבמספר מספק של צלחות תרבות OP9 נוספות במקביל לתרבות המשותפת.
    2. יום 0: ייזום של תרבות המשותפת
      1. לאסוף המסקלין כמו ב2.3.1-2.3.4. ספירת התאים.
      2. לכל שיבוט המסקלין להכין 5 x 10 4 המסקלין ב10 מ"ל של תקשורת OP9 לכל צלחת.
        הערה: למרות שאנו לא השתמשנו בו, נציין, כי מדיום אלטרנטיבי בהיקף של α-MEM, 10% FBS, ו5 x 10 -5 M β-mercaptoethanol דווח גם לשימוש בשיתוף תרבויות בידול 10.
      3. הסר את המדיה ישנה מOP9 מנות ולהוסיף 10 מ"ל של ההשעיה המסקלין את הכלים לטפל כדי להפיץ את התאים באופן שווה בכל הצלחת. מניחים את הכלים ב37 מעלות צלזיוס החממה.
    3. יום 3: שינוי מדיה
      1. הסר מנות מהחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ. מושבות צריכה להתחיל לאבד זוהר ונראה שטוח.
      2. הסר את המדיה ממנות ובעדינות להוסיף 10 מ"ל של OP9 הטריתקשורת.
      3. להחזיר את מנות שיתוף התרבות לחממה. מבחינה ויזואלית לעקוב אחר הקמת מושבה כמו המזודרם ביום ליידע את העיתוי של הכנת monolayer מזין OP9 למעבר הבא (יום 5), שלא צריכה להתבצע עד ~ 80-90% מהמושבות חזותי להציג מורפולוגיה כמו המזודרם-. דחייה המרבית של צעד העברת תא יום 5 היא 2 ימים.
    4. יום 5: מעבר בתיווך טריפסין עם טרום ציפוי.
      הערה: הכן מראש מספר מספיק של 10 מנות סנטימטר עם תאי OP9 בצורה אופטימלית ומחוברות. המשך בביצוע השלבים הבאים רק אם שיתוף התרבויות חזותית להציג את התכונות מתוארות בשלב 3.3.3 (ראה תוצאות גם נציג).
      1. הסר את המדיה ממנות התרבות המשותפת. הוסף 4 מ"ל PBS לשטוף. לערבל את PBS ולהסיר. הוסף 4 מ"ל של 0.25 טריפסין% ומקום הכלים בחממה ל~ 5 דקות.
      2. לשבש את השכבה של תאי trypsinized ידי pipetting הנמרץ, נזהר שלא להכניס בועות אוויר חריגות, עד שהשעיה הומוגנית, בעיקר תא בודד מושגת.
      3. הוסף 4 מ"ל של תקשורת OP9 המלאה ומערבבים על ידי pipetting. העברת תאים לתוך צלחת חדשה, ריקה 10 סנטימטר ומקום בחממה במשך 30 דקות, כדי לאפשר לתאי OP9 לדבוק בצלחת. זה צעד "טרום ציפוי" מפחית את מספר התאים OP9 הועברו לצעד הבא של התרבות המשותפת.
      4. הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם מסננות תא 40 מיקרומטר.
      5. איסוף תאים שאינם חסיד מהצלחת מצופה מראש ולהעביר אותם דרך מסננת התא לתוך הצינור. שטוף את הצלחת בעדינות עם 6 מ"ל של PBS ולהעביר אותו דרך אותו המסננת, ומשאיר את תאי OP9 המצורפים מאחורי.
      6. תאי צנטריפוגה בדקות 5 גרם 400 x ב 4 ° C.. הסר supernatant ו resuspend תאי pelleted ב3 מ"ל של תקשורת OP9 המלאה. ספירת התאים.
      7. הסר את המדיה מ10 צלחות סנטימטר עם תאי OP9 בצורה אופטימלית ומחוברות.
      8. עבור כל נקודת זמן ניתוח, זרע 5 x 10 5 תאים במונו OP9שכבה ב10 נפח סופי מ"ל.
      9. הוסף 5 ng / Flt-3L רקומביננטי האנושי מ"ל ולמקם את הכלים בחממה.
    5. אוסף נייד אבות היווצרות דם (HPC): יום 8
      הערה: הכן מראש מספר מספיק של 6 צלחות גם עם monolayers OP9 או OP9-DL1 תא, כך שהם יהיו ~ 80% ומחוברות בזמן לצעד זה.
      1. הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם 40 מיקרומטר מסננות.
      2. הסר את המנות מהחממה ולבחון תחת מיקרוסקופ. אשכולות מבריקים של HPCs צריכים להיות מחוברים באופן רופף לmonolayer OP9. לאסוף כמה שיותר תאים אלה ככל האפשר על ידי שטיפה (אך לא יתר על מידת שיבוש) monolayer OP9 עם טפטפת והמדיה הקיימת בצלחת. כדי למנוע הקצפה, תמיד להשאיר לפחות 1 מ"ל של התקשורת בקצה pipet במהלך איסוף HPC / צעד זה כביסה.
      3. להעביר את התאים דרך מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור. הוסף 8 מ"ל PBS לאותה הצלחת ולבדוק תחת מיקרוסקופ אם כל HPCsמחדש שנאסף. חזור על שלב כביסה / אוסף עם PBS ו( במידת צורך) עם כביסה תקיפה יותר. מסננים את התאים לתוך הצינור כבר מכיל את התאים מאותה הצלחת.
      4. תאי צנטריפוגה ב g x 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C..
      5. הכן תערובת הורים של 3 מ"ל (לכל צלחת נזרעה ביום 5) של תקשורת OP9 עם 5 ng / ml Flt-3L ו1 ננוגרם / מ"ל ​​IL-7.
      6. הסר supernatant וגלול גלולים בתקשורת OP9 עם Flt-3L תמהיל הורים + IL-7 (3 מ"ל לכל מנה 10 סנטימטר מעובד). להעביר את התאים שנאספו מכל צלחת ולאחת מצלחת 6 היטב עם תאי OP9.
        1. על מנת לנהוג תאים כלפי monocytic, תא B או שושלות erythroid, זרע התאים שנאספו על תאי OP9. לגזור תאי T, זרע התאים על גבי monolayers תא OP9-DL1.
      7. מניחים את 6 גם הצלחות לאינקובטור.
    6. יום 10: שינוי מדיה
      1. הכן צינור צנטריפוגות 15 מ"ל לכל קומבינה המסקלין ברורה שיבוט-מזין סוג התאtion בשיתוף התרבות.
      2. הכן תערובת הורים של תקשורת OP9 עם 5 / מ"ל ​​ng של Flt-3L ו1 / מ"ל ​​ng של IL-7. הכן 3 מ"ל לכל טוב.
      3. בעדינות לאסוף מדיה מכל טוב של הצלחת 6 היטב שילוב מדיה מבארות מרובות המכילות את אותו שילוב סוג תא שיבוט-מזין ESC.
      4. הוסף 2 מ"ל של תערובת אב תקשורת OP9 (ראה 3.6.2) לתוך כל אחד.
      5. צנטריפוגה התקשורת שנאסף בx גרם 400 למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו resuspend כל גלולה (קטנה מאוד, אם גלוי) ב 1 מ"ל של תערובת אב תקשורת OP9 (ראה 3.6.2) לכל טוב שנאסף במקור בשלב 3.6.3.
      6. הפץ 1 מ"ל של תאים בחזרה לכל באר שממנה מדיה נאספה במקור מביאה את עוצמת הקול בכל טוב ל3 מ"ל. להחזיר את המנות לחממה.
    7. יום 12: אין מעבר טריפסין
      הערה: הכן מראש מספר מספק של מנות 6 גם עם תאי OP9 או OP9-DL1, כך שהם יהיו מחוברים בצורה אופטימלית בזמן לזה זהTEP. יום 12 הוא אידיאלי עבור cytometry זרימת ניתוחים של erythroid פיתוח, monocytic, ותאי T שלב מוקדם.
      1. להכין תערובת שני (3 מ"ל לכל טוב שימשיך בשיתוף התרבות) של תקשורת OP9 עם 5 / מ"ל ​​ng של Flt-3L ו1 / מ"ל ​​ng של IL-7.
      2. הכן 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה עם 40 מיקרומטר מסננות (אחד לכל צירוף סוג תא שיבוט-מזין ESC בשיתוף התרבות).
      3. במרץ פיפטה המדיה הקיימת בכל אחד גם לdisaggregate כל התאים (כולל monolayer) בבאר. המשך עם pipetting הכוחני עד מדינה שמזכירה השעיה תא בודדת מושגת.
      4. להעביר את התאים שנאספו דרך המסננת לתוך הצינור. הוסף 3 מ"ל של PBS לתוך זה גם לשטוף ולאסוף את כל התאים הנותרים. עובר תאים דרך אותה המסננת. שלב את התאים מבארות מרובות המכילות את אותו שילוב סוג תא שיבוט-מזין ESC.
      5. מחק את מסננת התא משמשת ולהסיר שווה ערך aliquot לטוב אחד (~ 6 מ"ל) לכל רצויcytometry זרימה (או אחרים) מנתחת להתבצע באותו יום. אחסן aliquots אלה על קרח לפני השימוש.
      6. תאי צנטריפוגה ב g x 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant. Resuspend גלולה מ50 צינורות מ"ל צנטריפוגות ב3 מ"ל של תערובת אב לכל גם להיות מחדש זרע. הוסף 3 מ"ל לכל טוב של כל השעיה תא לסוג תא המזין המתאים ולמקם את הכלים בחממה.
    8. יום 14: שינוי מדיה
      1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.6.
    9. יום 16: אין מעבר טריפסין
      הערה: הכן מראש מנות 6 גם של תאי OP9 או OP9-DL1 בצורה אופטימלית ומחוברות לצעד זה.
      הערה: יום 16 הוא אידיאלי עבור cytometry זרימת הניתוחים של לימפוציטים מסוג B ותאי T שלב אמצע.
      1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.7.
    10. יום 18: שינוי מדיה
      1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.6.
    11. יום 20: אין מעבר טריפסין
      הערה: יום 20 iאידיאלי עבור cytometry זרימת ניתוחים של האמצע עד השלב מאוחר בפיתוח תאי T.
      1. בצע את הצעדים המפורטים בסעיף 3.7. אם ארצה בכך, לשאת הבחנה תאי תקשורת לשנות לסירוגין עבר יום 20 ולא טריפסין מעברים בכל יומיים, עם ניטור יומיומי של קצב התפשטות הלימפוציטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר גדל על MEFs בנוכחות LIF, יכול להישמר mESCs במדינה שלא עברה התמיינות. בתנאים אידיאליים, הם מופיעים כמושבות קומפקטיות של תאים מוקפים בהילה נוצצת במיקרוסקופ לעומת שלב (איור 1). תרבויות אלה חייבים להיות במעקב יומי. בהתאם לנקודת המפגש של התאים, ניתן לשנות תקשורת או ניתן לפצל תאים. מושבות המסקלין שכנים לא צריכה להגיע לנקודת מגע זו עם זו. תרבות נורמלית, בריאה של mESCs מובחן היא נקודת התחלה חיונית במבחנת התמיינות תאי T. על ייזום שיתוף התרבות, מומלץ שהתאים לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת שיתוף תרבות OP9-DL1 נוצלה כדי ללמוד את התפקיד של מוצרי גנים שונים במהלך הפיתוח של סוגי תאי דם מתאי גזע. 8,12,13 זה הוכח גם מודל יעיל כדי ללמוד את הפונקציה של DNA הרגולציה הגן במהלך התמיינות תאים. 9,14 שימוש בגישה זו כחלופה למודלים של עכברים כל יכול להניב חיסכון משמעותי בזמן ועלויות של ניסויים העוסקים בשאלות רבות בסיסיות בhematopoiesis. עם זאת, עיבוד של פרוטוקול זה למטרות אלה מחייב ידיעה של השתנות פוטנציאל בין השיבוטים המסקלין שישמשו בהליכים אלה. ציר הזמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לג'ון קים על הסיוע המומחה בזרימה ציטומטרית. המחקר במעבדות המחברים נתמך על ידי תוכנית SCORE של המכונים הלאומיים לבריאות (מענק SC1-GM095402 ל-B.D.O) והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (ל-J.C.Z.P). J.C.Z.P. נתמך על ידי קתדרת מחקר קנדית באימונולוגיה התפתחותית. תשתית המחקר הביו-רפואי של מכללת האנטר נתמכת בחלקה על ידי תוכנית מרכזי המחקר של NIH במוסדות מיעוטים (RCMI) באמצעות MD007599 מענקים. אנו מודים גם לתוכנית מדעי תאי הגזע של מדינת ניו יורק (NYSTEM) על תמיכתה בהתחלת מחקר תאי גזע בהאנטר קולג' באמצעות C023048 מענקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMCorning15-013-CV
תאי גזע מוסמכים FBSGemini100-125
פניצילין/סטרפטומיציןקורנינג30-002-CI
L-alanyl L-גלוטמיןקורנינג25-015-CI
מאגר HEPES MilliporeTMS-003-C
חומצות אמינו לא חיוניותThermoScientificSH30853.01
תמיסת ריג'נט ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)Life Technologies 15750-060
&בטא;-מרקפטואתנול (55 מ"מ) ב-DPBSLife Technologies 21985-023
יחידת סינוןMilliporeSCGPU05RE0.22 μ m PES ממברנה
תרבית תאים כיתהקורנינג25-055-CM
α-MEM טכנולוגיות חיים 12000-022אבקה, להרכיב מחדש לפי המלצת ייצור
נתרן ביקרבונט SigmaS5761-500G
FBS ThermoScientificSH 30396.03בדיקה של מנות בודדות נדרשות 
דימתיל סולפוקסיד SigmaD2650
רקומביננטי Human Flt-3 ליגנדמו"פ D Systems308-FK
עכברים רקומביננטיים IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
מי Utrapure עם 0.1% ג'לטיןMilliporeES-006-B
MEFs מיטומיצין C מטופלMilliporePMEF-CFניתן להשתמש בכל MEFs שנעצר מיטוטית
DPBSCorning21-031-CV
מסננת תאים (40 μ מ)פישר22363547
צלחת תרבית רקמות 100 x 20 מ"מBD Falcon353003
Multiwell 6 בארותBD Falcon353046
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהUSA Scientific1615-5500
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהBD Falcon352096
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהBD Falcon352070
5 מ"ל צינור פוליסטירן תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים352235 BD Falconעבור FACS 
תאי ES R1ATCCSCRC-1011
תאיניתן להשיג תאים ממאגר תאי המעבדה Riken (יפן).
תאי OP9-DL1       ניתן לבקש תאים מה-Zú ñ iga-Pflü מעבדת קר.
תוכנת FlowJo ניתוח נתונים של TreeStar
Flow CytometerBDFACScan, FACSCalibur ו-FACSVantage שימשו במעבדה שלנו
מומת בחום מים צינורות OP9 FACS,

מקורות

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דיפרנציאציה של תאי Tמערכת שיתוף-תרבית OP9תאי אב המטופואטייםאנליזת פלוו-ציטומטריהתחזוקת תרביות תאיםשכבה אחת של תאי סטרומההתפתחות לימפוציטים Tמודל in vitroCD4 CD8 כפולי חיוביים
גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.