שתי שיטות מבוססות זרימה ציטומטרית - בדיקת תחול תאי T במבחנה וצביעה ציטוקינים תוך תאית שימשו למדידת יכולת הצגת אנטיגן של תאים דנדריטיים ותגובות תאי T ספציפיים לאנטיגן לזיהום מוטנטי בנגיף מערב הנילוס בעכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant
במאמר זה
סיכום
תקציר
וירוס מוחלש הנילוס המערבי (WNV), (NS) 4B-P38G מוטציה nonstructural, מושרה ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T מסוג wild-WNV בעכברים. לאחרונה, גורם בידול מיאלואידית 88 איתות (MyD88) הוצגה להיות חשוב ליחול תא T ראשוני ופיתוח תא T הזיכרון במהלך זיהום המוטציה WNV NS4B-P38G. במחקר זה, שני לזרום שיטות מבוססות cytometry - במבחנה assay תא T תחול ומכתים ציטוקינים תאיים (ICS) - נוצלו כדי להעריך תאים דנדריטים (DCS) ופונקציות תא T. בתא T תחול assay, התפשטות תאים נותחה על ידי זרימת cytometry הבא שיתוף התרבות של DCs משני הקבוצות של עכברים עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) - שכותרתו תאי CD4 + T של עכברים הטרנסגניים OTII. גישה זו סיפקה קביעה מדויקת של שיעור מתרבים תאי CD4 + T עם שיפור ברגישות לכללית מאשר המסורת באופן משמעותיאל מבחנים עם ריאגנטים רדיואקטיביים. מערכת צינור microcentrifuge הייתה בשימוש בשני הליכי תרבית התאים ומכתים ציטוקינים של פרוטוקול ICS. בהשוואה למערכת מבוססת צלחת תרבית רקמה המסורתית, הליך שינוי זה היה קל יותר לביצוע ברמת בטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים. יתר על כן, טופלו תאים נגועים WNV- עם paraformaldehyde בשני מבחני, שאפשרו ניתוח נוסף מחוץ מתקני BL3. בסך הכל, ניתן להשתמש במבחנה מבחני אימונולוגיים אלה כדי להעריך ביעילות מערכת חיסונית בתיווך תא במהלך זיהום WNV.
מבוא
וירוס הנילוס המערבי (WNV), neurotropic, בתוספת חש-flavivirus, הוא איום על בריאות ציבור מתעורר. נכון לעכשיו, אין חיסונים אושרו לשימוש בבני אדם 1. זן WNV מוחלש, שבו יש תחלופה P38G בחלבון 4B nonstructural (NS), ידוע לגרום לא קטלני בעכברים אבל ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T בעכברים מאשר wild-type WNV NY99 זן 2. עכברים שחוסנו עם המוטציה NS4B-P38G היו מוגנים מפני כל אתגר המשני עם wild-type הקטלני WNV. הדבר מצביע על כך שיש המוטציה NS4B-P38G תכונות מתאימות למועמד אידיאלי חיסון. המנגנונים שבאמצעותם המוטציה NS4B-P38G גורמת חסינות אדפטיבית מגן גבוהה לא ברור הם הבינו עדיין. קולטנים כמו אגרה (TLRs), אשר מכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טקסס רפואית הסניף.
1. בידוד של DCs מעכברים נגועים ללא ונגוע WNV
- התאמה לגיל ושיסוד פעילות המינית 6-10 בן שבוע, wild-type C57BL / 6 (B6) וMyD88 - / - עכברים. לחסן intraperitoneally (IP) עם 500 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) של המוטציה WNV NS4B- P38G. ביום 3 לאחר פגיעה, להרדים MyD88 B6 ו-- / - עכברים עם CO 2. השתמש בעכברים שאינם נגועים בשתי הקבוצות שולטת. השתמש בשלושה עכברים מכל קבוצה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בassay תא T תחול, תאי CD4 + T CFSE שכותרתו היו בתרבית עם DCs מטוהר מנגוע המוטציה wild-type NS4B-P38G וMyD88 - / - עכברים בנוכחותו או היעדריו של פפטידים OVA. תאי T שכותרתו בתרבית לבד עם או בלי OVA במשך 5 ימים שמשו כקבוצת ביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 1 א, הכולל תאי T היו סגור לניתוח של עוצמת הקרינה בערוץ FL1. הסמן הוקם על בסיס תאי CD4 + T שכותרתו הטרי ביום 0 כדי לקבוע את קצב ההתפשטות ללא שיתוף התרבות של DCs. הייתה רמה נמוכה ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
WNV הוא פתוגן BL3. בשל תקנות בטיחות, מבחני אימונולוגיים עם דגימות נגועות WNV לעתים קרובות מוגבלים על ידי הזמינות של ציוד במתקנים BL3 או יותר ארוכים ומייגע לבצע. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו בשתי שיטות מבוססות cytometry זרימה ללמוד תגובות חיסוני בתיווך תא במהלך זיהום WNV 5. בשני מבחני, טופלו תאים נגועים בWNV עם 1-2% PFA ישירות או עם פתרון הקיבעון / permeabilization המכיל 4% PFA. זה ידוע כי 1% קיבעון PFA של תאים נגועים בנגיף ביעילות יכול להפחית את מספרם של חלקיקים מזהמים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH ל-T.W. (R01AI072060 ו-R01AI099123). G. Xie נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של מרכז Sealy לפיתוח חיסונים. אנו מודים לד"ר ריצ'רד פלאוול (המכון הרפואי הווארד יוז, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל, ניו הייבן) ולד"ר שיזואו אקירה (אוניברסיטת אוסקה, יפן) על אספקת עכברי MyD88–/– ולד"ר Y Cong (UTMB, גלווסטון) על אספקת עכברים טרנסגניים OTII.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | מתחמם ב-37 מעלות; C |
| Anti-CD11c חרוזים מגנטיים | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | עוקבים אחר היצרן הוראות |
| חרוזים מגנטיים נגד CD4 | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | עקוב אחר היצרן' s הוראות |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| שאריות OVA 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| פפטידים | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A תמיסה | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| CD4 | מצומד APCe-Bioscience | 17-0041-81 | |
| CD8 מצומד FITC | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| פתרון קיבוע/פרמביליזציה | BD-Bioscience | 554722 | |
| מאגר פרמיביליזציה/שטיפה | BD-Bioscience | 554723 | |
| אנטי-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| ציטומטר זרימה | Accuri BD מדע ביולוגי |
מקורות
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
