הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52139

⸱

20 בינואר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

תקציר

Discs large (Dlg) הוא חבר משומר במשפחת גואנילט קינאז הקשור לממברנה, ומשמש כחלבון פיגומים עיקרי בצומת העצבי-שרירי של הזחל (NMJ) בדרוזופילה. מחקרים קודמים הראו כי ההתפלגות הפוסט-סינפטית של Dlg ב-NMJ הזחל חופפת לזו של Hu-li tai shao (Hts), הומולוג לאדוקינים של היונקים. בנוסף, Dlg ו-Hts נצפים כיוצרים קומפלקס זה עם זה בהתבסס על ניסויי קו-אימונו-משקעים הכוללים ליזטים של זבובים בוגרים שלמים. עם זאת, בשל אופי הניסויים הללו, לא היה ידוע אם קומפלקס זה קיים ספציפית ב-NMJ במהלך התפתחות הזחל.

בדיקת קשירת קרבה (PLA) היא טכניקה שפותחה לאחרונה המשמשת בעיקר בתרבית תאים ורקמות שיכולה לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן. בבדיקה זו, דגימות מודגרות עם נוגדנים ראשוניים כנגד שני החלבונים המעניינים באמצעות פרוצדורות אימונוהיסטוכימיות סטנדרטיות. הנוגדנים הראשוניים מתגלים לאחר מכן עם זוג נוגדנים משניים מצומדים לאוליגונוקלאוטידים שתוכננו במיוחד, הנקראים בדיקות PLA, שניתן להשתמש בהם כדי ליצור אות רק כאשר שתי הגשושיות נקשרו בסמיכות זו לזו. לפיכך, ניתן לדמיין חלבונים שנמצאים במתחם. כאן, מודגם כיצד ניתן להשתמש ב-PLA כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן ב-NMJ של זחל דרוזופילה. הטכניקה מבוצעת על הכנת שרירי דופן גוף הזחל כדי להראות כי קומפלקס בין Dlg ל-Hts אכן קיים באזור הפוסט-סינפטי של NMJs.

מבוא

תסיסנית דיסקים גדולים (DLG) הוא חבר של המשפחה שמורה kinase guanylate קרום הקשורים פיגומי חלבונים המסייעים לתזמר את ההרכבה של קומפלקסי חלבונים גדולים באתרים ספציפיים של קרום הפלזמה. זוהה במקור כחלבון מדכא סרטן, DLG משמש כגורם חשוב 1,2,3 קוטביות apicobasal אפיתל. DLG משמש גם כמודול פיגומים גדול בצומת העצבית-שהרירית (NMJ) של הנוירונים מוטוריים glutamatergic במהלך התפתחות זחל 4. DLG משחק תפקידים מגוונים בNMJ הזחל, וpleiotropism מסתמך על יכולתו לקשר עם חלבונים מרובים 5,6. חלבון אחד כזה הוא שאו הו-לי טאי (HTS), homologue לadducins היונקים שתוארו בעיקר בכל הקשור לתפקידם בויסות תקטין spectrin שלד תא 7. זה בעבר הוכח כי DLG וHTS יכולים ליצור קומפלקס אחד עם השני על בסיס במבחנה שיתוף immunoprecipitation ניסויים מעורבים lysates לטוס כל המבוגר 8. חסרון אחד של תוצאות אלה, עם זאת, הוא שהם לא מציינים היכן צורות מורכבות זו. עם השימוש באימונוהיסטוכימיה, ההפצות של DLG וHTS הם נצפו לחפיפה בקרום postsynaptic של NMJs זחל, אבל הם במתחם באזור זה 8? כפי שניתן לראות לאחרונה ומפורט יותר כאן, הקירבה קשירת Assay (PLA) משמש כדי לחפש בשיתוף אתרו בין DLG וHTS במיוחד בNMJ זחל 27.

PLA הוא טכניקה חדשה יחסית המשמשת בעיקר בתרבית תאים ורקמות שיכולות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון באתר 9. ב assay זה, נוגדנים עיקריים נגד שני החלבונים של עניין מזוהים עם זוג של נוגדנים משני מינים ספציפיים, המכונה בדיקות PLA, אשר מצומדת לoligonucleotides (איור 1 א ', ב'). אם שני החלבוניםים נמצא בסמיכות זה לזה (כלומר בתוך כמה עשרות ננומטרים), ניתן לגשר על המרחק בין בדיקות PLA המצורפות באמצעות הכלאה של שני oligonucleotides נוסף מחבר (איור 1 ג). בקונפורמציה זו, מסתיימת ללא oligonucleotides המחבר קרוב מספיק כדי ליצור קשר אחד עם השני, ומולקולת DNA מעגלית סגורה יכולה להיווצר עליו בקשירה באתרו (1D איור). מולקולת ה- DNA המעגלית משמשת כתבנית באתר הגברה המעגל מתגלגל, אשר ערוכה על ידי אחד מoligonucleotides המוצמד לבדיקות PLA (איור 1E). רצפים בתוך מוגבר מוצר ה- DNA וכתוצאה מכך, concatemeric אז יכולים להיות דמיינו עם, בדיקות שכותרתו fluorescently משלימות oligonucleotide (איור 1F). מאז DNA המוגבר נשאר מחובר לאחד מבדיקות PLA, לוקליזציה subcellular של withi האינטראקציה בין חלבוניםרקמת na אפשר ללמוד בקלות.

כמה שיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון כוללים בטכניקות חוץ גופית כגון שיתוף immunoprecipitation, הנפתח מבחני והקרנת שתי היברידית שמרים, ובטכניקות vivo כגון העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) וbimolecular פלואורסצנטי שלמה ( BiFC). מלכודת של הטכניקות במבחנה היא שהם אינם מזדהים בו האינטראקציה מתרחשת באופן אנדוגני, בעוד vivo טכניקות האמורות בלערב את הביטוי המלאכותי של חלבוני היתוך שעלול שלא לשקף התנהגות יליד עמיתי אנדוגני. אחד יתרונות עיקריים של PLA הוא שהוא מסוגל לקבוע בתוך רקמת לוקליזציה subcellular של interactors חלבון אנדוגני שנמצאים בסמיכות זה לזה, וסביר להניח להרכיב מורכב, עם מידת הקרבה הדרושה כדי ליצור אות להיות דומה לFRET וBiFC. PLA יכול לזהות אינטראקציות עם סגוליות גבוהות ורגישות בשל הצימוד של הכרת נוגדן והגברת DNA. לפיכך, assay יכול ליצור אותות בדידים, בהירים בצורה של puncta החושפות את עמדתה של האינטראקציה המדויקת. בנוסף, ניתן לאתר אנטיגנים בקושי נראים לעין. לבסוף, PLA הוא טכניקה פשוטה יחסית לביצוע, וזה לוקח לא יותר מהליך immunohistochemical סטנדרטי כדי להשלים. לכן, PLA מספק יתרון טכני על מבחני אינטראקציה אחרים חלבון-חלבון שלעתים קרובות נגועים בזמני הכנה ארוכים ופתרון בעיות נרחבות.

פרוטוקול זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני באתר. כאן, PLA מבוצע על הכנות שריר זחל קיר גוף שבו DLG וHTS מוצגים לאכן מתקיימים במתחם באזור postsynaptic של NMJs. PLA לא היה בשימוש בעבר כדי ללמוד את NMJ הזחל, ויש כיום רק קומץ של מאמרים שפורסמו שהשתמשו assay זה ברקמת דרוזופילה. יש לקוות כי חשיפה נוספת של PLA לקהילת תסיסנית תגרום שימוש ככלי נוסף הגדיל אותו כדי להשלים את מבחני אחרים, נפוצים יותר חלבונים אינטראקציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גוף וול הכנה

הערה: הכנת גוף זחל קירות instar השלישי (למחקר של NMJs שמעצבב את קיר שרירי גוף) בוצעה כפי שתואר בעבר ברנט ואח '10, או Ramachandran וBudnik 11,12, אבל עם כמה שינויים..

  1. Dissection
    1. להעלות מניות לטוס וצלבים על 25 מעלות צלזיוס במשך 5-6 ימים באמצעות נהלים סטנדרטיים 13.
    2. בחר זוחל זחלי instar שלישיים מבקבוקונים או בקבוקים באמצעות מלקחיים בסדר.
    3. שטוף את הזחלים בצלחת פטרי קטנה המכילה פוספט הצפת מלוח (PBS) כדי להסיר כל חלקיקי מזון.
    4. הנח זחל יחיד על גבי דיסק sylgard ולטבול אותו בכמה טיפות של PBS קר כקרח. באמצעות PBS קר כקרח יעזור לי המם את הזחל שהופך אותו קל יותר לתמרן. לאורך לנתיחה, להבטיח כי ההכנה היא תמיד שקועה בPBS כדי למנוע את זה מהתייבשות.
    5. מקם את laRvA עם צד הגב שלה פונה כלפי מעלה, כך ששני קטעים לקנה הנשימה נראים תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 2 א). שימוש במלקחיים כדי לתפוס סיכת minutien, להצמיד את הזחל בקצה האחורי ליד spiracles (איור 2). עם סיכה אחרת, לחדור מבעד לציפורן בקצה הקדמי ליד הפה הווים. בעדינות למתוח את הזחל מתוך אורך, אז להצמיד אותו (איור 2).
    6. בעזרת המספריים microdissection, לצבוט את הקצה האחורי ליד הסיכה כדי ליצור פתח קטן. החתך צריך להיות שטחי מספיק רק לעבור לציפורן.
    7. הצבת קצה הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך, לחתוך לאורך כל אורכו של קו האמצע הגב בין שני קטעים לקנה הנשימה (איור 2 ג). כוון את להבי מספריים מעט כלפי מעלה בעת החיתוך כדי למנוע נזק לשרירי קיר גוף הגחון.
    8. לעשות חתך אופקי קטן מעט קדמי לתפקידסיכת eriorly-הציבה (איור 2 ג). לעשות עוד חתך דומה מעט אחורי לפין anteriorly-הציב (איור 2 ג). החתכים צריכים רק לעבור לציפורן.
      הערה: שלושה חתכים מצעדים 1.1.7 ו1.1.8 בשילוב צריך להיות דומה " figure-protocol-1 "כשסיים, כלומר, שמאל ויד ימין דש בצד הגב של גוף הזחל צריך להיות מיוצר.
    9. לנקות את זהירות את האיברים הפנימיים עם המלקחיים. הוספה כמה טיפות בכוח של PBS תעזור לתפוס את האיברים מחוץ לגוף הזחל, וכך קל יותר כדי להסיר אותם. הימנע תוקע גוף הזחל כפי שיגרום נזק לקיר שרירי גוף.
    10. לפרוש גוף הזחל פתוח ולהצמיד את הפינות כלפי מטה (איור 2 ד). כאשר מצמיד, למתוח את קיר הגוף אופקי ואנכי כדי ליצור מלבן באופן שווה-מתוח (seדואר איור 2G לצורה), מטפל שלא לקרוע את קיר שרירי גוף בתהליך.
    11. לסיים הסרת כל איברים שנותרו פנימיים (איור 2E).
  2. קיבעון וpermeabilization
    1. לטבול את גוף הקירות תלו בכמה טיפות של התמיסה של Bouin. דגירה במשך 15 דקות על קרח. לחלופין, להשתמש paraformaldehyde 4% (PFA) כמקבע חלופי; דגירה למשך 30 דקות.
    2. לשטוף שלוש פעמים עם פוספט הצפת מלוח עם טריטון (PBT).
    3. בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר בזהירות את הסיכות ולהעביר את גוף הקירות בפינות שלהם לתוך צינור microcentrifuge siliconized 0.65 מיליליטר.
    4. אחסן את גוף הקירות בPBT ב 4 ° C עד מוכן לPLA. לקבלת תוצאות אופטימליות, להתחיל immunostaining גוף הקירות בתוך יום או ימים של נתיחה.
      הערה: כדי לחסוך בחומרים כימיים ועל מנת להבטיח כי הם התייחסו לכל הגוף באופן שווה במהלך קירות assay, ניתן להציב גנוטיפים שונים ליחידצינור. ניתן להבחין גנוטיפים על ידי חיתוך הפינות של קירות הגוף שונה (ראה תרשים 2F לדוגמאות).

2. אימונוהיסטוכימיה

הערה: Immunostaining של גוף זחל קירות instar השלישי בוצע כפי שתואר בעבר ברנט ואח '14 וRamachandran ו -11 Budnik, אבל עם כמה שינויים 11,14..
הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת חדר ועם תסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת.

  1. חסימה
    1. שטוף את גוף קירות עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
    2. לחסום עם 1% אלבומין סרום שור (BSA) במשך שעה 1.
  2. Immunostaining
    1. דגירה גוף הקירות עם נוגדני עכבר ועיקריים ארנב נגד שני החלבונים של עניין (בדילול מלא 1% BSA) לשעה 2 בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. במקרה זה, להשתמש בעכבר 01:10 אנטי-DLG ו -1: 250 ארנבNTI-HtsM 15,16. נוגדנים כנגד סמנים שאינם נעשו בעכבר או ארנבת יכולים להיכלל גם - למשל, להשתמש 1: 200 עיזים אנטי-Hrp להתוות ממברנות עצביות.
    2. לשטוף עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
    3. דגירה עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות כדי לזהות הסמנים (בדילול מלא BSA 1%) לשעה 2 בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. כאות PLA מאוחר יותר דמיין עם fluorophore אדום, fluorophore אחר יש להשתמש כדי לזהות את הסמן - למשל, להשתמש 1: 200 אנטי-עז FITC- מצומדות כדי לזהות את הנוגדן אנטי Hrp העז. בשל השימוש בחומרים כימיים רגיש לאור, לשמור על הצינורות בחושך מנקודה זו ואילך.
      הערה: הערכה המשמשת מאפשרת לPLA להתבצע בין נוגדנים העיקריים שהועלו בעכבר וארנב, עם האות דמיין בערוץ האדום תחת מיקרוסקופ confocal. אם תרצה, ערכות אחרות זמינות המאפשרות assay להיעשות עם פרימהנוגדני ר"י גדלו במינים אחרים, ואת האות דמיין בערוצים אחרים.

3. סמיכות קשירת Assay

הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת חדר ועם תסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת.

  1. בדיקות PLA
    1. שטוף את גוף קירות עם PBT שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
    2. דגירה עם בדיקות PLA (1: 5 דילול כל אחד בBSA 1%) לשעה 2 ב 37 ° C. במקרה זה, להשתמש 40 μl של מינוס אנטי עכבר הבדיקה PLA, 40 μl של PLUS נגד ארנב הבדיקה PLA ו -120 μl של BSA 1% על מנת להבטיח את הטבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות. עד דילול 01:25 של בדיקות PLA עדיין יכול לגרום ליחס הולם אות לרעש (כלומר, עבור ניסוי זה).
  2. קשירה
    1. שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד.
    2. דגירה עם פתרון קשירת (01:40 דילול של אנזים במאגר קשירת) לשעה 1C ° 37 t. במקרה זה, להשתמש 5 μl של אנזים, 40 μl של חיץ 5 קשירת וμl 155 של מים טוהר גבוהים כדי להבטיח טבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות.
  3. הגברה
    1. שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף פעמיים עבור 2 דקות כל אחד.
    2. דגירה עם פתרון ההגברה (1:80 דילול של פולימראז במאגר הגברה) לשעה 2 ב 37 ° C. במקרה זה, להשתמש 2.5 μl של פולימראז, 40 μl של 5 חיץ הגברה ו157.5 μl מים טוהר גבוהים על מנת להבטיח את הטבילה וערבוב הנכונים של 5-10 גוף קירות.
  4. הכנה להדמיה
    1. שטוף את גוף קירות עם הצפת לשטוף B פעמיים במשך 10 דקות כל אחד.
    2. לשטוף עם 0.01x הצפת לשטוף B פעם 1 דקות.
    3. לאזן בכמה טיפות של תמיסת הרכבה לפחות 30 דקות לפני ההרכבה, או לאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. באמצעות מלקחיים עדינים, להעביר בזהירות את קירות גוף לשקופית פלטפורמת wה- i הציפורניים שלהם פונות כלפי מטה. מקם את גוף הקירות בשורות ובאותו הכיוון בתוך טיפה או שתיים של mountant. מניחים coverslip x 40 מ"מ 22 מ"מ מעל מטפל הכנה לא ליצור בועות אוויר, ואז לאטום את השקופית עם לק ברור.
    5. אחסן את השקופיות בחושך ב -20 ° C עד מוכן להדמית confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בNMJs זחל instar השלישי wild-type, DLG נמצא ברובה בקרום postsynaptic של boutons glutamatergic אני סוג, עם רמות immunoreactivity DLG להיות בולטות יותר בboutons Ib סוג מהסוג האם boutons (איור 3 א) 4. HTS נוכח לאורך כל השרירים, אבל מתרכז באזור postsynaptic עם רמות immunoreactivity HTS מופיעות זהות בשני סוגים אני boutons, והוא נמצא גם Presynaptically (איור 3 א ') 8,17. שים לב שההפצות של DLG וHTS החופפים במידה רבה באזור postsynapt...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דו"ח זה מדגים כיצד ניתן ליישם PLA לתסיסנית הזחל NMJ. Assay מבוצע על הכנות שריר קיר גוף זחל לצורך איתור אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני נוכחים בNMJ. בעזרת טכניקה זו, DLG וHTS מוצגים להיות בסמיכות זה לזה, ובכך קיימים במתחם, במיוחד באזור postsynaptic 27. בתמיכה של תוצאה זו, מחקר קודם סיפק עדות לקשר שלהם עם הנתונים הבאים: 1) הפצות immunoreactive של DLG וHTS חפיפה באזור postsynaptic של NMJs זחל, 2) DLG וHTS צורה מורכבת המבוססים על שיתוף ניסויי immunoprecipitati...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים לתסיסנית מרכז Stock Bloomington למתן מניות זבוב. אנו מודים גם לבנק התפתחותית המחקרים Hybridoma וד"ר לין קולי (אוניברסיטת ייל) למתן נוגדנים. תודה מיוחדת לAhHyun Yoo על עזרתה בכתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (קריגר), ויליאם ועדה איזבל פלדת הקרן (קריגר), והמכון הקנדי לחקר בריאות (הרדן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלקחיים (בסדר #5)AlmedicA10-704
Sylgard DiscWorld Precision InstrumentsSYLG184מערבבים בסיס אלסטומר וחומר ריפוי ביחס של 10:1. מוגדר למשך 30 דקות. יוצקים לתבנית (למשל השתמשו בצלחת תרבית תאים עם 12 בארות). יש להניח לריפוי למשך 24 שעות לפחות. היצמדו למכסה של מכסה צלחת פטרי בגודל 60X15 מ"מ בעת הניתוח.
סיכות זעירות (0.0125  קוטר קצה מ"מ)Fine Science Tools26002-10
מספריים מיקרו-דיסקציה (עדינים במיוחד)Fine Science Tools15200-00
שקופיותהדבק שני כיסויים בגודל 22 x 22 מ"מ2 מחליק על שקופית מיקרוסקופ עם לק שקוף, ומשאיר < מרווח של 20 מ"מ ביניהם להרכבת מדגם.
w1118Bloomington Drosophila Stock Center3605
hts01103Bloomington Drosophila Stock Center10989המלאי אוזן מחדש על גבי מאזן GFP כך שניתן יהיה לבחור מוטציות הומוזיגוטיות על סמך היעדר אות GFP.
1x PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט): 3  mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7.0NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's SolutionSigma-AldrichHT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA ב-1x PBSPFA (מדע אנכימיה - 66194-300). ראה doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 להוראות כיצד להכין את התמיסה.
[header]
1x PBT (תמיסת מלח פוספט עם טריטון): 1x PBS עם 0.01% טריטוןטריטון X-100 (סיגמא-אולדריץ' - T8787)
1% BSA (אלבומין בסרום בקר): 1% BSA ב-1x PBTBSA (Bioshop Canada - ALB001). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
עכבר אנטי-Dlg (דיסקים גדולים)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה4F3השתמש בדילול של 1:10 ב-1% BSA.
ארנב נגד HtsM (הו-לי טאי שאו)מסופק על ידי ד"ר לין קולי (אוניברסיטת ייל). יש להשתמש בדילול של 1:250 ב-1% BSA.
ארנב אנטי-פאק (קינאז המופעל על ידי p21)מסופק על ידי ד"ר ניקולס הארדן (אוניברסיטת סיימון פרייזר). יש להשתמש בדילול של 1:500 ב-1% BSA.
עכבר נגד WG (ללא כנפיים)מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank4D4השתמש בדילול של 1:5 ב-1% BSA.
עז נגד HRP (חזרת פרוקסידאז)ג'קסון                          ImmunoResearch123-065-021יש להשתמש בדילול של 1:200 ב-1% BSA.
חמור מצומד FITC נגד עזיםג'קסון                        ImmunoResearch705-095-003יש להשתמש בדילול של 1:200 ב-1% BSA.
Duolink באתרו PLA בדיקה נגד עכבר MINUSסיגמא-אולדריץ'DUO92004
Duolink באתרו PLA בדיקה נגד ארנב פלוססיגמא-אולדריץ'DUO92002
Duolink באתרו זיהוי ריאגנטים אדוםסיגמא-אולדריץ'DUO92008
1x מאגר כביסה A: 0.01  מ טריס, 0.15  M NaCl, 0.05% טווין 20, pH 7.4סיגמא-אולדריץ'DUO82049טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1), טווין 20 (פישר סיינטיפיק - BP337)
מאגר כביסה 1x B: 0.2  מ טריס, 0.1  M NaCl, pH 7.5סיגמא-אולדריץ'DUO82049טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1)
0.01x מאגר כביסה B: 2  מ"מ טריס, 1  mM NaCl, pH 7.5Sigma-AldrichDUO82049Tris (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
מדיום הרכבה Duolink באתרו עם DAPISigma-AldrichDUO82040
פלטפורמה

מקורות

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צומת עצבית-שרירית (NMJ) של זחלי דרוזופילהאינטראקציה בין חלבוניםמיקרוסקופיה קונפוקליתאימונופלורסצנציהקרומ פוסט-סינפטיקומפלקס Dlg Htsגששי PLAהגברה של מעגל מתגלגלהכנת דופן הגוף
זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.