ניתוח מהיר וחזק של תאי ומולקולרי קיטוב המושרה על ידי chemokine איתות

סיכום

איתות כימוקין מעורר שינויים ניכרים במורפולוגיה התאית וכמה הפצות מחדש חשובות של חלבונים תוך-תאיים. כאן, ניתן פרוטוקול מהיר ומפורט לחקר אירועים אלה.

תקציר

תאים מגיבים לגירוי chemokine ידי לאבד הצורה העגולה שלהם בתהליך הנקרא קיטוב, ועל ידי שינוי לוקליזציה subcellular של חלבונים רבים. טכניקות הדמיה קלאסית שימשו לחקר תופעות אלה. עם זאת, הם נדרשים הרכישה הידנית של תאים רבים ואחריו כימות של המורפולוגיה ושיתוף הלוקליזציה של ההכתמה של עשרות תאים זמן רב. כאן, שיטה מהירה וחזקה מתוארת ללמוד תופעות אלה על דגימות מורכבות מכמה אלפי תאים באמצעות זרימת הדמיה cytometry טכנולוגיה המשלבת את היתרונות של מיקרוסקופ עם אלה של cytometer. באמצעות לימפוציטים מסוג T מגורה עם CCL19 וצביעה למולקולות MHC Class I ויקטין פילמנטיות, אסטרטגית gating מוצגת למדוד בו זמנית מידת שינויי צורה והמידה של שיתוף לוקליזציה של סמנים שמושפעים מאיתות CCL19. יתר על כן, אסטרטגית gating זה אפשרה לנו observדואר ההפרדה אקטין פילמנטיות (בחזית) וEzrin-Radixin-Moesin פוספורילציה (phospho-ERM) החלבונים (בחלק האחורי) בתאי T מקוטבים לאחר גירוי CXCL12. טכניקה זו הייתה שימושית גם כדי לבחון את השפעת החסימה על קיטוב של שני אלמנטים שונים: עיכוב של פילמור אקטין ידי מעכב וביטוי תרופתי של מוטציות של / מסלול PKC איתות לא טיפוסי Par6. לפיכך, ראיות הראו כי טכניקה זו שימושית כדי לנתח את שני שינויים מורפולוגיים והפצה מחדש חלבון.

מבוא

כמוקינים הם חלבונים מסיסים קטנים שמושכים תאים למקומות מיוחדים ^1. לכן, הם משתתפים במיקום הנכון של תאים ברקמות, תפקיד מכריע בפיתוח ופיזיולוגיה. המערכת החיסונית היא לא יוצאת מכלל זה כפי שהוא מסתמך על הפעולה של סוגי תאים שונים הפועלים בתיאום לעלות תגובה חיסונית יעילה. על ידי שליטה על המיקום הספציפי של סוג תא חיסון אחד במצב נתון, כמוקינים הם-נדרש מראש לפני שניתן להבחין אנטיגנים זרים ונטרלו.

בלימפוציטים מסוג T בפרט, כמוקינים להיקשר לקולטנים ספציפיים משטח ש, על אירוסין, לעורר רבים אותות תאיים (עליית סידן, זירחון ERK, הפעלת GTPases Rho, עלייה בשינויי זיקת integrins וcytoskeletal) שמעדיפים תנועתיות תאי T ^2,3. ברמה התאית, ניתן לראות שינויים מורפולוגיים שהושרו על גירוי chemokine.שינויים אלה בצורות תא הם דרמטיים במיוחד בתאי T: יש לי תאי T נחים מורפולוגיה עגולה כמו חרוז-בעת נסיעה בזרם הדם. עם זאת, החישה של הנוכחות של כמוקינים באתרים דלקתיים או בקרבתו של איברי הלימפה הולכת לשנות את הצורה של תאי T אשר כעת לאמץ מורפולוגיה טיפוסית "יד-ראי" בהיקף של צורה דו-קוטבית: קצה מוביל בחזית ונגרר לקצה, או uropod, בחלק האחורי ^4. בנוסף, רכיבים תאיים יכולים להפריד לשני אזורים מנוגדים אלו של תאי T מקוטבים כדי לקיים הגירה. לדוגמא, עליית פילמור הסיבי אקטין על גירוי chemokine ⁵ ויקטין polymerized מצטברת בחלק הקדמי של תא T מקוטב ^2. מצד השני, כמה חלבונים, כגון חלבוני phosphorylated של משפחת Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) המקשרת את קרום הפלזמה לשלד תא F- אקטין קליפת המוח, מחדש בתרגום בuropod של מקוטבתאי T ^6. מעניין, אנחנו ואחרים הראינו שנדרש תהליך קיטוב זה לנדידת תאי T. ואכן, כל טיפול שמפריע לקיטוב ימנע תנועתיות סלולרית. לדוגמא, עיכוב של הפעילות של החברים של החלבון טיפוסי קינאז C (PKC) משפחה, קיטוב תא לוקי PKCζ וPKCι T ותהליך סריקת הנדידה שלהם של תאים דנדריטים ^7. קיטוב תא T גם מוסדר על ידי Rho GTPases. הראינו כי האפנון של פעילות RhoA על ידי חלבון Fam65b תאר לאחרונה מפריע T שינויי תא במורפולוגיה והיכולת שלהם להעביר בassay Transwell ^6. כקיטוב הוא צעד תנאי מוקדם לתנועתיות סלולרית, זה קריטי ובכך להיות מסוגל לכמת את זה כקריאה העיקרית של תגובות chemokine. שינויי צורת תא נמדדו בעבר באופן ידני ^8. עם זאת, בכימות סוג זה הוא זמן רב מאוד, כך שבדרך כלל רק כמהעשרות תאים נלקחים בחשבון.

כאן, שיטה חדשה מוצגת לכמת את מידת שינויי צורה של לימפוציטים מסוג T נחשף לchemokine גירוי במהירות. זרימת הדמיה cytometry הטכנולוגיה (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) משמש, המשלב את היתרונות של cytometer זרימה ומיקרוסקופ ⁹ לכמת ביעילות את כמות תאים מקוטבים בתנאים שונים של גירוי chemokine. בנוסף לכימות של השינויים מורפולוגיים שאפשר למדוד וחסונה עם הטכנולוגיה הזו, אפשר גם להעריך שינויים בלוקליזציה subcellular של חלבונים מסוימים על איתות chemokine.

פרוטוקול

1. הכנת T לימפוציטים

1. הכן עכבר ראשוני או תאי T אנושיים כפי שתואר ^10,11.
2. לטפח תאי T אנושיים במדיום RPMI להשלים עם 10% בסרום אנושי AB בצפיפות של 2 - 3 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
   הערה: השימוש בסרום עוברי עגל (FCS) במקום סרום אנושי יכול לעורר קיטוב ספונטני של חלק גדול של תאי T אנושיים בתרבות. שמור את התאים הללו בתרבות ל4-5 ימים ועוד תהליך אותם בכל עת במהלך תקופה זו.
3. שמור על תאי T העכבר במדיום RPMI מלא בתוספת 10% FCS בצפיפות תאים דומה. להשתמש מייד או ביום שלמחרת, לאחר O / תרבות N על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 10 ng / ml IL7.
4. לטפח את קו התא האנושי CEM T בRPMI המלא בתוספת 10% FCS.

2. chemokine גירוי

1. לשטוף 5 x 10 ⁵ תאים לכל תנאי ניסוי במדיום HBSS חם בתוספת 10 מ"מ Hepes. עבור חלק מניסויים, שיתוף transfect התאים T אנושי ראשוני היום קודם לכן עם 2 מיקרוגרם pmaxGFP ו8 מיקרוגרם pcDNA3.1 ⁺ (וקטור ריק, שליטה), kinase PKCζ המת, או פלסמידים Par6 N-terminal.
2. Resuspend התא גלולה במדיום HBSS-Hepes חם (0.3 להשתמש מספר x מיליליטר של תנאי ניסוי).
3. להפיץ את התאים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
   הערה: לכן, צינור אחד המתאים לתנאי ניסוי יחידים יכיל 5 x 10 ⁵ תאים ב0.3 מיליליטר בינוני HBSS-Hepes. עבור חלק מניסויים, להוסיף 500 ננומטר Latrunculin או רכב (DMSO) ודגירת התאים למשך 30 דקות לפני גירוי chemokine.
4. להוסיף 10 עד 500 ng / ml CCL19 או chemokine CXCL12 בצינור אחד.
   הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 10-200 מיליליטר chemokine / ng לתאי T אנושיים. תאי CEM אינם מבטאים את הקולטן CCR7 שנקשר CCL19. לכן, תאי CEM רק להיות מסוגלים להגיב לגירוי CXCL12. יתר על כן, שימוש בריכוזים גבוהים יותר chemokine (300-500 ng / ml) לקטב תאי T העכבר.
5. הפוך את הצינורות כמה פעמים דגירה אותם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 8 או 10 דקות לתאי T ראשוניים או CEM, בהתאמה.
6. לעצור את תהליך הקיטוב על ידי הוספה על צינור אחד 0.3 מיליליטר של פתרון חם המכיל paraformaldehyde 2% (PFA) ו -10 מ"מ Hepes בPBS. הפוך את צינורות דגירה אותם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

3. Stainings

1. להעביר את התאים מצינורות microcentrifuge לזרום cytometry צינורות.
2. ממלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון RT המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.5 mM EDTA ו -10 מ"מ Hepes בPBS.
3. בצנטריפוגה הצינורות ב 460 XG למשך 4 דקות.
4. בטל supernatant וresuspend התאים של פתרון RT המכיל 5% FCS בPBS 100 μl.
5. הוסף 5 μl של FITC-אנטי-HLA-ABC בצינור אחד, מערבולתם, דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT, הרחק מאור.
6. שטוף תאים פעם עם PBS המכיל 5% FCS,פעם אחת עם PBS רק ND.
7. ב RT: להוסיף 500 μl 1% PFA, דגירה של 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף תאים עם תמיסה המכילה 1% BSA, 0.5 mM EDTA ו -10 מ"מ HEPES בPBS.
8. בטל supernatant, למלא את הצינורות לחלוטין עם פתרון של PBS המכיל BSA 0.2%, saponin 0.1%, 0.5 mM EDTA ו -10 מ"מ Hepes (חיץ permeabilization).
9. לשטוף תאים פעמיים במדיום זה.
10. הפוך את הצינורות כדי להסיר בינוני ומערבולתם לנתק את התא גלולה.
11. להוסיף 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר TRITC-Phalloidin ו / או 1: של נוגדן אנטי-P-100 ERM דילול על צינור אחד, מערבולתם דגירה במשך 30 דקות ב RT.
12. לשטוף את התאים עם חיץ permeabilization. דגירה עם נוגדנים משני ניאון במידת צורך.
13. Resuspend תאי 200 μl PBS ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge.
    הערה: תאים מוכנים לרכישה. לחלופין, תוך שמירה על נפח כולל מרבי של 200 μl לכל צינור, להוסיף PFA המרוכז ל% 1 סופייםריכוז על מנת לשמר את stainings אם לא כדי לשמש התאים באותו היום לעיבוד נוסף.

4. תמונות רכישה וניתוח

1. הפעל את המכשיר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי) ולתת לו לכייל את עצמו בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: תוכנת INSPIRE שימשה עם מטרת 40X (0.75 NA). תוכנת 3.0 הרעיונות שימשה לכל quantifications דיווח.
2. הכן סדרה של חלונות רכישתו ניתן לשמור בתבנית לניסויים עתידיים. לצייר היסטוגרמות שלכמת את ערכי שיפוע RMS. מאוכלוסיית "בפוקוס", שנבחרה על RMS היסטוגרמה שיפוע, delimitate האוכלוסייה "תא יחיד" על היסטוגרמה של האזור. ברגע שצינור microcentrifuge הוכנס במכונה, להתאים את כוח הלייזר, שער על תאים בודדים ולרכוש 5,000 T לימפוציטים.
3. ברעיונות רכיםכלי, לפתוח את קובץ הרכישה וליצור היסטוגרמה שתציג את הערך של ערך RMS שיפוע לתמונות בשדה בהיר (ערוץ 1) התקבלה לכל תא בודד. צייר שער על ההיסטוגרמה שיפוע RMS שרואה תאים מציגים RMS ערך שיפוע מעל 57.
   הערה: צבע RMS מאפשר לקחת בחשבון בניתוח רק לימפוציטים מסוג T הנמצאים במישור המוקד. יש לנו לקבוע באופן אמפירי שתאים בודדים המציגים ערך שיפוע RMS עדיף על 57 הם במישור המוקד, ויכולים להיחשב באופן מדויק.
4. בניתוח / תפריט מסכות, ליצור מסכה חדשה, שנקרא Erode (M01,2) ממסכת המורפולוגיה על תמונות brightfield M01, נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה של האזור, המחושב על מסכת Erode (M01,2). מהתאים שנבחרו בשער הקודם, לפתוח ההיסטוגרמה מראה את השטח של תאים באמצעות מסכה חדשה שנוצרה זה.
   מסכות המורפולוגיה זמינות על ידי: הערהברירת מחדל הוא הרבה יותר גדולה מהגודל האמיתי של התא. לכן, זה יותר מדויק לשחוק אותו עד 2 פיקסלים.
5. צייר שער על תאי T הבודדים, לא כולל את חרוזי הכיול ופסולת (פינת קטנה) והכפילויות (שטח גדול). התאם את השער הזה בכל רכישה.
   הערה: וריאציות בגודל תא תשפיע על מעמדו של השער. ככל שתאי T העכבר קטנים יותר תאי T אנושיים שהם עצמם קטנים יותר מאשר תאי CEM, השטח של כל אחד מסוגי תאים יהיה יחסית לגודלו.
6. בהתחשב בתאים בודדים, בפוקוס שהיו סגור בשלבים הקודמים, לפתוח עלילת נקודה בהיקף של Raw מקס Pixel על הכתמת HLA-ABC (ערוץ 2, ציר x) כפונקציה של Raw מקס Pixel על phalloidin הכתמה (ערוץ 4, ציר y). צור שער שלא לכלול את אירועי ניאון בלא כתם או רוויים. שתי היסטוגרמות פתוחות המציגות את Raw מקס Pixel לHLA-ABC (ערוץ 2) וphalloidin (ערוץ 4) stainings.
7. בניתוח / תפריט מסכות, creatמסכת ea חדשה, הנקראת Erode (M02,2) ממסכת המורפולוגיה של התאים HLA-ABC המוכתם (ערוץ 2), נשחקו של 2 פיקסלים. לאחר מכן, בניתוח / תכונות תפריט, ליצור תכונה חדשה הכוללת את הפרמטר המעגלי, המחושבת על Erode (M02,2).
   הערה: פרמטר זה מודד את הסטייה של צורת התא ממעגל. לכן, תא T עגול ומושלם יהיה ערך מעגלי גבוה ואילו תאים מקוטבים מוארכים יציג מדד מעגלי נמוך.
8. כתוצאה מכך, ליצור היסטוגרמה אחרת שתדווח על הערכים של התכונה המעגליות מהתאים מגודר בעבר. השתמש היסטוגרמה זו עלילה ישירות ההפצה של פרט, אוכלוסיית תאים בפוקוס על פי השווי של המעגליות לכל תא בודד.
9. כאשר מסתכלים על צורת ההיסטוגרמה עבור תאים-מגורה עישון, לצייר שער לתאים מקוטבים, החל משעת הערך המעגלי הנמוך ביותר עד לגובה שווי הגבול המעגלי שבו רוב תאי מגורה שאינוהם זממו. תראו את תצוגת הנתונים הסטטיסטיים עבור אחוז התאים מקוטבים בקרב האוכלוסייה הנשלטת (% מגודרים).
   הערה: יש לנו קבוצת השער הזה לערכי מדד מעגליים להלן 13.
10. כדי להסתכל על הקיטוב של ההכתמה אקטין בתאים, העלילה היסטוגרמה לערך הדמיון R3 פרט מואר, השוואת צביעת HLA-ABC (ערוץ 2) ומכתים phalloidin (ערוץ 4).
    הערה: גדולה יותר את הערך של תכונה זו, יותר גבי שני stainings הן.
11. שימוש באותה האסטרטגיה gating כמו קודם, עלילה שער על תאי מגורה שאינו לצביעה הנפרדת המציגה את אחוז התאים עם כתמים אקטין מקוטבים.
12. כאשר יושלם, אחוז התאים מציג הפרדה בחלוקת MHC Class I וstainings phalloidin, אחוז התאים מקוטבים יחד עם הערכים הממוצעים של המדדים מעגליים ודמיון של כל התאים ± SD מוצג בcorrespלוחות סטטיסטיקת onding.

תוצאות

הדוגמא הראשונה שנבחרה כאן נוגעת לשימוש בלימפוציטים מסוג T האנושי העיקרי מגורה עם CCL19. עם זאת, באותה האסטרטגיה ניתן להשתמש בתאי עכבר העיקרי T, שורות תאי T או כל סוג תא אחר מגיב לגירוי chemokine. אסטרטגית gating מוצגת כאן כוללת סדרה של חלונות שבחר את האירועים ממוקדים, אז תאים בודדים. לבסוף הטווח של עוצמת הקרינה ואחריו כאן כדוגמא על שני סמנים: MHC Class I HLA-ABC ויקטינו פילמנטיות למנוחה (איור 1) או מגורה CCL19 (איור 2) לימפוציטים מסוג T.

דיון

באמצעות טכנולוגיה האחרונה של זרימת ההדמיה cytometry, אסטרטגית gating מהירה ואינפורמטיבי לנתח אירועים תאיים ומולקולריים הנגרמים על ידי גירוי chemokine מוצג. מניסוי בודד, ניתן לקבל שני סוגים עיקריים של מידע: השינויים במורפולוגיה של תאים הנגרמים על ידי גירוי chemokine והפצת subcellular של חלבונים שונים בתהליך הקיטוב. מעניין, ראיות היא גם סיפקו לאפשרות לנתח מספר גדול של תאים, המאפשר חוסן סטטיסטי וניתוח רלוונטי של חלק קטן של האוכלוסייה כל התא. כפי שדווח, טכניקה זו יכולה לשמש גם לניתוח ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI	Gibco	61870-010
סרום אנושי AB	PAA	C11-021	יש לחמם מראש כדי להשבית את המשלים.
סרום עגל עוברי	PAN Biotech	P30-3300	יש לחמם מראש כדי לנטרל את המשלים.
ערכת נוקלאופקטור של תאי T אנושיים	Lonza	VCA-1002
עכברים IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.
Hepes	Gibco	15630-056
עכברים CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots מופשרים על קרח לפני הוספת הכימוקין לתאים.
CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots אנושיים מופשרים על קרח לפני הוספת הכימוקין לתאים.
CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots אנושיים מופשרים על קרח לפני הוספת הכימוקין לתאים. ניתן להשתמש בכימוקין זה גם על תאי T של עכברים.
	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	PFA 157-8-100	זוהי תמיסת PFA של 8% במים. ערבבו נפח לנפח עם 2x PBS כדי לקבל תמיסת PFA של 4% ב-PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
נוגדן FITC-anti-HLA-ABC	בקמן קולטר	IM1838	B9.12.1
Anti-P-ERM נוגדן	איתות תאים	3149P
ImageStreamx Mark II	אמניס