מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה In vivo

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג in vivo של נוירונים חושי ריח על ידי אלקטרופורציה ולאחר מכן סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופ רב-פוטוני כדי להמחיש את המורפולוגיה העצבית והתפתחותה לאורך זמן.

תקציר

למערכת הריח יש יכולת יוצאת דופן ליצור נוירונים חדשים לאורך חייו של אורגניזם. תאי גזע של חוש הריח בחלק הבסיסי של אפיתל הריח מולידים ללא הרף נוירונים חושיים חדשים המרחיבים את האקסונים שלהם לתוך פקעת הריח, שם הם מתמודדים עם האתגר להשתלב במעגלים קיימים. בגלל תכונה מסוימת זו, מערכת הריח מייצגת הזדמנות ייחודית לנטר חיווט והנחיה אקסונליים, ולחקור את היווצרות הסינפסות. כאן אנו מתארים הליך לתיוג in vivo של נוירונים חושיים והדמיה לאחר מכן של אקסונים במערכת הריח של זחלי הדו-חיים Xenopus laevis. כדי לצבוע נוירונים חושיים באיבר הריח אנו מאמצים את טכניקת האלקטרופורציה. אלקטרופורציה in vivo היא טכניקה מבוססת להעברת דקסטרנים מצומדים פלואורופור או מקרומולקולות אחרות לתאים חיים. לאחר מכן ניתן לנטר נוירונים חושיים מוכתמים והתהליכים האקסונליים שלהם בבעל החיים באמצעות סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופיה מולטיפוטונית. על ידי הפחתת מספר התאים המסומנים לתאים בודדים או בודדים לכל בעל חיים, ניתן לעקוב אחר אקסונים בודדים לתוך פקעת הריח ולעקוב אחר השינויים המורפולוגיים שלהם במשך שבועות על ידי ביצוע סדרות של ניסויי הדמיה ב-in vivo. בעוד שהפרוטוקול המתואר מדגים את התיוג והניטור של נוירונים חושי ריח, ניתן לאמץ אותו גם לסוגי תאים אחרים בתוך חוש הריח ומערכות אחרות.

מבוא

התחלופה לכל החיים של נוירונים חושיים מבדילה את מערכת הריח ממערכות חישה ועצביות רבות אחרות^1,2. נוירונים חושיים חדשים שנוצרו נוצרים ברציפות בחלק הבסיסי של אפיתל הריח³ ומרחיבים את האקסונים שלהם לתוך נורת הריח, תחנת הממסר הראשונה של מערכת הריח⁴. עם זאת, המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהיווצרות ותחזוקה של מפת הריח רחוקים מלהיות מובנים במלואם^4,5.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיוג נוירונים חושיים של איבר הריח של הזחל X. laevis על ידי אלקטרופורציה in vivo של dextrans מצומד פלואורופור. הפרוטוקול המוצג מאפשר הדמיה של מורפולוגיה וקישוריות אקסונלית, מעקב אחר התפתחות אקסונלית לאורך זמן ולחקור מנגנונים המווסתים חיווט והנחיה אקסונליים.

אלקטרופורציה היא שיטה מבוססת היטב להחדרת מקרומולקולות טעונות, כמו צבעים מצומדים דקסטרנים ו-DNA, לתאים^6,7. קרום התא חודר על ידי הפעלת פולסים במתח קצר והמולקולות מועברות אלקטרופורטית לציטוזול⁸. אלקטרופורציה מוגבלת מרחבית באמצעות מיקרופיפטה מאפשרת תיוג סלקטיבי של תאים כולל נוירונים ויושמה במערכות עצביות שונות כולל מערכת הראייה של X. laevis^9,10.

אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בבעלי החיים החשמליים כדי לחקור דפוסי גדילה אקסונליים ומורפולוגיה בבעלי חיים באמצעות סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופיה רב-פוטונית. ההליך המתואר מאפשר לזהות את הטופולוגיה הגסה של הקרנות אקסונליות של נוירונים חושיים של מערכת הריח הראשית והאביזר^11,12. באמצעות הדמיית דולג זמן in vivo, הוא מתאים גם לפקח על הקשרים הגלומרולרים של נוירונים חושיים בוגרים בודדים, ולעקוב אחר התפתחות דפוסי ההקרנה האקסונליים של נוירונים חושיים לא בשלים¹². ניתן ליישם את הפרוטוקול המתואר כדי לחקור את המבנה וההיווצרות של מעגלי ריח בבעל חיים שלם וניתן להתאים אותו לסוגי תאים אחרים בתוך מערכת הריח ומערכות עצביות אחרות.

פרוטוקול

הערה: טיפול בבעלי חיים וניסויים בוצעו כפי שאושרו על ידי ועדת אוניברסיטת גטינגן לאתיקה בניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת ייצור מכשירים ופיפטה

1. ודא שהתקנת electroporation מורכבת מסטראו עם מרחק עבודה גדול ומצוידת במערכות תאורה ומסנן ניאון לצבע המשמש.
2. לelectroporation להשתמש גם electroporator אחד ייעודי תא או מחולל פעימות כיכר הגנרית המצורף לאוסצילוסקופ. חבר את יציאות electroporator לבעל טפטפת ואלקטרודה אמבטיה. חבר את הקוטב החיובי של מחולל הפעימות לבעל micropipette והקוטב השלילי על האלקטרודה האמבטיה. להבטיח הן את בעל טפטפת ואלקטרודה האמבטיה מכילות חוטי כסף מצופים בשכבה דקה של כלוריד כסף.
3. הר בעל פיפטה על micromanipulator כדי לאפשר מיקום מדויק.
4. לפברק micropipettes electroporation מנימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה פנימית.
5. השתמש בחולץ micropipette אופקי וליישם פרוטוקול שונה עבור הייצור של טפטפות לניסויי מהדק תיקון כפי שתואר על ידי Bestman et al. ^13.
6. להתאים פרמטרים לייצר Shank ופתיחת טיפ קטן יותר וכתוצאה מכך התנגדות פיפטה גבוהה יותר של כ 15-20 mOhm לelectroporation תא בודד יותר. התנגדות פיפטה צריכה להיות נמוכה יותר, למשל, 3-4 mOhm, לתיוג של קבוצות של תאים.
7. מדוד את התנגדות פיפטה באופן ישיר עם electroporator תא בודד ייעודי או לחשב אותו עם חוק אוהם לאחר מדידת זרימה נוכחית עם אוסצילוסקופ לאחר היישום של דופק מתח מוגדר.

2. הכנת Electroporation הפתרון

1. לפזר dextran מצמידים fluorophore בצלצול צפרדע (98 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 1 מ"מ CaCl _2, 2 מ"מ MGCl _2, 5 גלוקוז מ"מ, 5 מ"מ Na-פירובט, 10 HEPES מ"מ, מותאם pH 7.8, osmolarity הייתה 230 mOsmol / l) בריכוז של 3 מ"מ. התאים לא יכולים להיות כל כך שכותרתו במאור פנים, אם ריכוזי צבע נמוכים יותר משמשים. הכן פתרון מניות נפח גדול ולחלק אותו לaliquots קטנים. להקפיא אותם לאחסון (יציב במשך חודשים).
   הערה: dextrans זמין בגדלים שונים ומגוון רחב של פליטה / ספקטרום עירור (למשל, 10kD Alexa 488-dextran, Alexa 10kD 546-dextran, Alexa 10kD 568-dextran, 10kD 594-dextran אלקסה, 3kD TMR-dextran.).
2. למילוי micropipette עם קצה פיפטה מוארך עם נפח קטן של פתרון dextran (1-5 μl). קפיצי בזהירות את micropipette עם האצבע כדי להסיר בועות אוויר שנותרו בקצה פיפטה.
3. הר micropipette בבעל פיפטה. ודא שחוט הכסף בתוך פיפטה הוא במגע עם פתרון הצבע.

3. בחירה של הזחל X. laevis </ Em>

1. השתמש זחלים לבקן של X. laevis לניסויים. בעלי חיים מסוג ברי רשות melanophores מלא פיגמנט המציג פליטת autofluorescence במהלך confocal / ההדמיה multiphoton ולכן אינו מתאימים לניסויים שתוארו.
2. שלב ראשני premetamorphotic לאחר Nieuwkoop ו ^-14 פאבר. בחר ראשנים של שלבים 45-53 לניסויים.

4. Electroporation של dextrans מצמיד Fluorophore

1. מניחים פיסה קטנה של רקמה בצלחת פטרי ולכסות אותו עם נפח קטן של מים המכילים 0.02 tricaine% (methanesulfonate 3-aminobenzoate אתיל, מותאם pH 7).
2. להרדים את הראשנים במים המכילים tricaine 0.02%. אחרי כמה דקות החיות יפסיקו לנוע. לאשר הרדמה תקינה על ידי נגיעה ראשנים. הם צריכים להיות ללא תגובה.
3. להעביר בזהירות את הראשן מההרדמה לצלחת פטרי רקמות מכוסות.
4. ודא אלקטרונ האמבטיהשיר הלל סוגר את מעגל electroporation. ודא כי האלקטרודה היא במגע עם הרקמות הרטובות; מקשר ישיר לראשן אין צורך.
5. מקם את הקצה הקרוב micropipette לאיבר חוש הריח באמצעות micromanipulator.
6. לחדור את העור המכסה את איבר חוש הריח עם קצה פיפטה ובזהירות לקדם את הקצה לתוך שכבת תא עצב חושי במיקום המרכזי של אפיתל הריח העיקרי או אפיתל יעקובסון.
7. תגרום להבזקי מתח מרובע חיוביים להעברת צבע לתוך תאי עצב תחושתיים. החל דופק מתח יחיד (לדוגמא., 25 V, אורך הפולס 25 אלפיות שני) או רכבות של פולסים מרובים (לדוגמא., 50 V, אורך הפולס 300 μsec, 400 משך רכבת msec ב 200 הרץ).
   הערה: קביעת פרמטרים דופק מתח אופטימליים עבור רצוי להאריך של תיוג. להפחית משרעת מתח דופק, משך ומספר החזרות להפחית את מספרם של תאים שכותרתו. החל גבוה משרעת דופק מתח, משך ומספר pulses לתיוג נרחב יותר.
8. דמיין שחול מוצלח צבע וelectroporation על ידי פולסים מופעלים באמצעות תאורת ניאון של סטראו. הצבע מתפשט במהירות לתוך גוף תא ודנדריט לאחר electroporation המוצלח.
9. חזור על שלבים 4.5-4.9 לאיבר ההרחה השני של הראשן.
10. העבר את הראשן לתוך כוס מלאה במים שפירים להתאוששות. אחרי בערך 5 דקות הראשנים מתעוררים מהרדמה ולהתחיל תנועות שחייה רגילות.
11. לאחר 24 שעות לצבוע electroporated מתפשט בעצב סנסורי וסופו של דבר מגיע לנורת חוש הריח באמצעות תחבורת axonal.

5. בעלי חיים הרכבה להדמיה in vivo של תאים ותהליכי axonal

1. להרדים את הראשנים במים המכילים tricaine 0.02%.
2. בזהירות להעביר ראשנים לחדר הדמיה, למשל, גומי סיליקון קטן מכוסה צלחת פטרי עם הפסקת ראשן בגודל.
3. לחתוך מלבן קטן בפס של Parafilm. מכסה את הראשן עם Parafilm, עוזב את telencephalon הקדמית חשופה מבעד לחלון לחתוך החוצה. תקן את Parafilm עם מחטים על הצלחת מבלי לפגוע בראשן.
4. ודא הראשן הוא שקוע במים מספיקים מכילים tricaine 0.02%.
5. הר חדר ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ multiphoton זקוף או מיקרוסקופ confocal.
6. לרכוש שלוש ערימה ממדית של תמונות של הנורה חוש הריח. ודא שהליך ההדמיה הוא קצר ככל האפשר ולא יעלה על 10-15 דקות.
7. להחזיר את הראשן למים רגילים במכל נפרד ולמנוע חשיפה לאור. לאחר 5 דקות, הראשן מתעורר מהרדמה.
8. חזור על שלבים 5.1-5.7 לאחר מרווחי זמן שצוינו, לדוגמא., בכל יום.

6. בעלי חיים הרכבה להדמיה Ex Vivo של תאים ותהליכי axonal

1. לחלופין לסעיף 5של הפרוטוקול, להשתמש הכנת מוח נכרתה לדמיין את עצב סנסורי שכותרתו.
2. הרדימי ולהרוג את הראשן על ידי חיתוך רוחב של המוח במעבר לחוט השדרה. בלו בלוק של רקמה המכיל את איברי חוש הריח, עצבי חוש הריח וtelencephalon הקדמית.
3. מעביר את גוש הרקמה לפתרון צלצול צפרדע ולהסיר רקמת חיבור עם מספריים עדינים כדי לחשוף את הצד הגחוני של המוח.
4. מעביר את גוש הרקמה לחדר הדמיה ולתקן את זה עם מסגרת פלטינה חוטים עם חוטי ניילון.
5. הר חדר ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ confocal / multiphoton.
6. לרכוש שלוש ערימה ממדית של תמונות של הנורה חוש הריח.

7. עיבוד תמונה והערכת נתונים

1. לייעל וליישם אמצעים לא-מקומיים של סינון לשיפור איכות תמונה והדמיה של מבנים עצביים כפי שתואר על ידי קופה, פ et al. ¹⁵.
   הערה: נתוני ניסויי הדמיה בשכבות רקמה עמוקות יותר של דגימות חיות הם לעתים קרובות רועשים.
2. צור תחזיות בעוצמה מקסימלית של ערימות תמונה לסקירה.
3. לזמן לשגות ניסויי הדמיה מסך ערכות נתונים עבור אקסונים באופן חד משמעי לזיהוי יחידים של עצב סנסורי.
4. לשחזר מורפולוגיה תאית באמצעות סיוע תוכנת מעקב של תהליכים עצביים כפי שתואר על ידי אל פנג et. ^16.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר יכול להיות מיושם בהצלחה עבור electroporation ובהדמית vivo של תהליכי axonal של נוירונים חושיים של מערכת ההרחה של X. בהרדמה laevis, באמצעות confocal לייזר סריקה או במיקרוסקופ multiphoton (איור 1).

Electroporation מאפשרת dextrans מצמידים fluorophore להיכנס ולהתפשט במהירות בתוך תאים של איבר חוש הריח. זה מועיל ליישם תאורת ניאון כדי לוודא תיוג מוצלח לאחר מפעילה פולסים מתח. בהתאם לפרמטרי electroporation, למשל., התנגדות פיפטה, קבוצות של תאים (איור 2 א, ב) או תאים בודדים (איור 2C) של איבר חוש הריח מסומנות. האקסונים של תאי עצב תחושתיים שכותרתו ניתן דמיינו בעצב ההרחה (איור 2 ד) וניתן לצפות תהליכי axonal גם בנורת חוש הריח, בדרך כלל 24 שעות לאחר electroporation המוצלח(איור 3). Electroporation של קבוצות של תאי עצב תחושתיים מאפשר לדמיין את דפוסי חיווט הגסים בנורת חוש הריח (איור 3 א). electroporation תא הבודד יכול להיות מיושם על לחקור דפוסים בודדים axonal הקרנה, בהסתעפויות axonal וקישוריות למבני גלומרולריות בנורת חוש הריח (איור 3 ג-ה).

ראשנים לבקן שקופים של X. היתר laevis בconfocal vivo או ההדמיה multiphoton של עצב סנסורי שכותרתו במוח שלם של ראשן בהרדמה. פיתוח דפוסי צמיחת axonal ניתן לעקוב במשך כמה ימים / שבועות על ידי חוזר ונשנה בהדמית vivo של אותו תא העצב החושי שכותרתו (איור 4). בהתאם לפדיון של נוירון החושי בנקודת הזמן של electroporation דפוס האקסון בנורת חוש הריח יכול להשתנות במידה ניכרת. נוירונים בוגרים כבר יש סניפי axonal משוכללים שכוללים ציצהאזורי ed מחוברים לglomeruli. דפוס צמיחת axonal של נוירונים בוגרים הוא יציב למדי, אבל התארכות של ענפי האקסון וחידודים של ציצות גלומרולריות ניתנת לצפייה (איור 4 א-ה). ניתן לצפות עצב סנסורי in vivo לתקופות זמן ממושך, למשל., יותר משלושה שבועות (איור 4F-I). מצד השני, האקסונים של תאי עצב לא בוגרים עדיין בתהליך של צמיחה ראשונית, אין לי arborizations המצויץ ועדיין אינו מחוברים למטרות גלומרולריות הסופיות שלהם. פרוטוקול הניסוי מאפשר מעקב ההתפתחות של תאי העצב האלה במהלך הבשלה, לדוגמא., התארכות האקסון, בהסתעפויות והקמת arborizations המצויץ (איור 4J-L). לדוגמאות נוספות ראה גם Hassenklöver ו ^-12 מנציני.

איור 1. סקירה סכמטי של פרוטוקול הניסוי. () נוירונים חושיים באפיתל ההרחה הראשי (משרד החינוך) או איבר יעקובסון (VNO) של איבר חוש הריח של X. בהרדמה זחלי laevis מסומנים דרך electroporation באמצעות פיפטה מזכוכית מלאה בפתרון dextran ניאון. יכולים להיות אחרי האקסונים של תאי עצב שכותרתו דרך עצב ההרחה (ON) וסופו של דבר להגיע לנורת חוש הריח (OB). (ב) הראשן הוא מורדם ונוירונים שכותרתו נחקרים שוב ושוב באמצעות מיקרוסקופ confocal או multiphoton בזמנים הקצובים. הפיתוח ההדרגתי של דפוסי צמיחת axonal של תאים שכותרתו (C) ניתן בעקבות לאורך פרקי זמן של ימים עד שבועות.

איור 2. Electroporation של עצב סנסורי באיבר חוש הריח. Electroporation () עם טפטפות התנגדות הנמוכה מובילה לתיוג של מספר תאים באיבר חוש הריח. בדוגמא זו נציג נוירונים קולטני ריח מרובים (ORNs, ראשי חץ מלאים) ושני תאים תומכים בצורת עמודים (SCS, כוכביות) הוכתמו. קווים מקווקווים לסמן את גבולותיה של אפיתל הריח (OE). (ב) זיקוק הפרמטרים electroporation, למשל., הגדלת התנגדות פיפטה, מגביל את מספר התאים שכותרתו. בדוגמא זו, תא עצב אחד חושי (ראשי חץ מלאים) ותא אחד (כוכבית) תמיכה בסמוכה הוכתמו לאחר electroporation. הערה האקסון היחיד שעזב את אפיתל ההרחה (ראשי החץ פתוחים). (ג) electroporation תא הבודד מוצלח מוביל לתיוג בלעדי של נוירון בודד חושי (ראש חץ מלא) והאקסון שלו המחובר (ראשי החץ פתוחים) באפיתל ההרחה.

איור 3. לדמיין תחזיות האקסון חוש הריח בנורת חוש הריח נכרתה. () טופולוגיה הגסה של תחזיות axonal של עצב סנסורי בנורת חוש הריח יכול להיות דמיין באמצעות טפטפות electroporation התנגדות נמוכות יותר. חצי הכדור אחד חוש הריח נורה ועצב ההרחה הקשורים אליו (ON) מתוארים. ארבעה dextrans מצמידים את fluorophores שונה electroporated בארבעה מקומות מרוחקים של איבר חוש הריח: לרוחב (ירוק), בינוני (צהובה), מדיאלי משרד החינוך (אדום) וVNO (כתום). זה מאפשר לדמיין את הנורה אבזר חוש הריח (AOB) ושלושה שדות ההשלכה העיקריים של הנורה העיקרית חוש הריח (MOB). (CE) של אקסונים חוש הריח חד מקרינים לתוך הנורה חוש הריח ויוצרים arborizations / סינפסות מצויצות בglomeruli הכדורית (ראשי חץ מלאים). שים לב כי בX. laevis האקסונים חוש הריח להתפצל באופן קבוע (ראשי חץ פתוחים) לפני ההתחברות לglomeruli אחד, שתיים או מרובה (ראשי חץ מולא באופן, גם לראות Hassenklöver ו ^-12 Manzini).

איור 4. בזמן לשגות הדמיה vivo של אקסונים נוירון חוש הריח חד. (AE)לאחר electroporation תא בודד המוצלח האקסון שכותרתו יכול להיות דמיין שוב ושוב בנורת חוש הריח (OB). דוגמא זו מראה האקסון בודד שנחקר במשך שבוע אחד. המורפולוגיה הכוללת אינה משתנה במידה ניכרת וניתן לזהות שתי נקודות הסתעפות גדולות (ראשי חץ פתוחים). שים לב כי במהלך הזמן, ציצה אחד גלומרולריות עוברת הפחתה מתמשכת (חץ מלא), ואילו בשתי קווצות גלומרולריות האחרות תישאר יציבים (כוכביות). (FI) דוגמא מייצגת זו מציגה את הכדאיות של תצפיות ארוכת טווח, כמו אקסון הספציפי זה נחקר במשך יותר משלושה שבועות. אין שינוי לכאורה של דפוס הגדילה שלו יכול להיות מזוהה. (JL) דוגמא של האקסון חושי בשלה בתהליך של צמיחה מתוארת. היא עדיין לא מחוברת לglomeruli וציצות גלומרולריות אופייניות חסרות. לאחר 5 ימים סניפי axonal מוארכים, האקסון מפוצל מספר פעמים וarborizations קנס הןהוקם.

דיון

הליך הניסוי המתואר כאן מאפשר עצב סנסורי תיוג של איבר חוש הריח של X. הזחל laevis על ידי electroporation של dextrans מצמידים fluorophore וההדמיה הבאה של צמיחת האקסון חושית בחי. על ידי שינוי הפרמטרים של electroporation in vivo ניתן לשלוט על מספר תאי העצב התחושתי שכותרתו. זה ובכך ניתן לתייג קבוצות גדולות של תאי עצב של האפיתל חושית, כמה או אפילו תאים בודדים מאוד.

כדי להבטיח הרצוי להאריך תיוג עצבי חשוב להיות זהיר במיוחד על מאפייני micropipette וקטניות electroporation. התנגדויות פיפטה גבוהות יותר והפחתה של דופק מתח משרעת, משך ומספר החזרות יכולות להפחית את כמות התאים שכותרתו, ואילו הפחתת התנגדויות פיפטה ומשרעת דופק מתח גבוה יותר, משך זמן ומספר הפעימות יכול להוביל לתיוג נרחב יותר. השימוש בדואר של dextrans ניאון עבור electroporation מספק משוב חזותי מיידי אם ההגדרות להחיל מתאימות. היזהר שבאמצעות פרמטרים למשרעת, משך ומספר הפעימות שתעלינה על הערכים שנקבעו בפרוטוקול עלול לגרום לנזק לתאים או אפילו מוות של תאי ^17. טיפים סתומים או שבורים של micropipettes יכולים גם לעכב electroporation המוצלח.

בelectroporation vivo באיבר חוש הריח של X. laevis מוגבל לשלבי זחל מאז העור של צפרדעי postmetamorphotic הוא קשה ולא ניתן לחדור בקלות עם micropipette. ההדמיה in vivo של תהליכים עצביים יכולה להתעכב על ידי הפיזור של עירור / פליטת אור באזורים במוח עמוק יותר או על ידי כלי דם. בעיה זו הופכת להיות בולטת במיוחד בשלבי זחל גבוהים יותר בשל מוח גדול יותר ויכולה להוביל לאותות רועשים שהופכים את זיהוי ברור של תהליכי axonal בסדר קשה יותר.

היתרי הפרוטוקול המובא "jove_content" לדמיין עצב סנסורי במערכת ההרחה שלמה בלי לנתח את החיה, לפגוע בתאים במהלך תיוג, הכנת חתכי רקמה או תיקון הרקמות כפי שיידרש לשיטות חלופיות, כמו תיוג בתיקון כל התא ניסויי -clamp ^18. כאשר משלב את התיוג של כמה או בודדים נוירונים חושיים עם in vivo הדמיה הזמן לשגות, אפשר לדמיין את קשרי גלומרולריות של עצב סנסורי הבוגר יחיד על מרווחי זמן ארוכים. בדרך זו אפשר גם לעקוב אחר ההתפתחות של דפוסי הקרנת axonal של עצב סנסורי לא בשלה במשך מספר שבועות. אפשרות השנייה זו היא מעניינת במיוחד שכן היא מאפשרת ניטור דפוסי הצמיחה של אקסונים יחידים בחי. זה מפותח את האפשרות לחקור מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים האקסון הדרכה וpathfinding. מספר גורמים, כולל ביטוי קולטן odorant, axo השוניםמולקולות ההנחיה n ופעילות מושרה odorant / ספונטנית של תאי עצב תחושתיים הוכחו להסדיר את ממצא היעד של אקסונים נוירון החושיים ^4,5.

היישום של הפרוטוקול אינו מוגבל לעצב סנסורי חוש הריח, אבל יכול להיות מיושם גם ללמוד סוגי תאים אחרים, למשל., תאי גזע / אב של האזורים העצביים של המוח המתפתח או תאי צניפי של הנורה חוש הריח. בנוסף טכניקה הפגינה יכולה לשמש גם בשילוב עם dextrans רגיש סידן או בזריקת צבעי סידן קרום חדיר כדי לקבל מידע לגבי תפקוד תא העצב שכותרתו ו / או המעגלים המחוברים ^7,19. הזמינות של מגוון רחב של fluorophores מצמידים את dextrans מאפשרת תיוג של תאים בודדים מרובים או אוכלוסיות עם צבעים שונים. גם פלסמיד פתרון ה- DNA, למשל קידוד לחלבוני ניאון, מתאים לelectroporation ועוד יכול לשפר את versatiliטאי ותועלת של הטכניקה ^6. הפרוטוקול נוסף ניתן לשפר כדי לאפשר electroporation המשולב של dextrans וDNA או morpholinos הטעון לתפעל ביטוי גנים ^13,17.

השיטה המתוארת בהחלט מייצגת כלי חדש כדי לחקור המורכב ותהליכים עדיין לא הבינו באופן מלא המסדירים הדרכת axonal במערכת חוש הריח החוליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אולימפוס		SZX16	עם תאורה פלואורסצנטית
אקסון אקסופורטור 800A		מולקולריים	אלקטרופורטור תא יחיד
ELP-01D	npi	אלקטרופורטור
MMJ	Mä rzhä משתמש Wetzlar		ידני מיקרומניפולטור
P-1000	Sutter		חולץ מיקרופיפטה אופקי
G150F-4	Warner Instruments		נימי זכוכית לייצור פיפטות אלקטרופורציה; נימה פנימית מקלה על מילוי חוזר
Alexa 488-dextran 10 kD	Life Technologies	D22910
Alexa 546-dextran 10 kD	Life Technologies	D22911
Alexa 568-dextran 10 kD	Life Technologies	D22912
Alexa 594-dextran 10 kD	Life Technologies	D22913
TMR-dextran 3 kD (מיקרו-רובי)	Life Technologies	D7162
קצות פיפטה מיקרו-מעמיס	Eppendorf	930001007
Tricaine (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)	Sigma-Aldrich	E10521	חומר הרדמה; השתמש בכפפות
A1-MP	מיקרוסקופ מולטיפוטון	ניקון
LSM 780	Zeiss		מיקרוסקופ קונפוקלי
Imaris	Bitplane		תוכנה חלופית למעקב עצבי