מאמר שיטה

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

DOI:

10.3791/52161

⸱

10 בדצמבר 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחה שיטת מיצוי DNA היברידית אוטומטית למחצה לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיות והדגימה שיפורים על פני שיטת מיצוי מכנית ואנזימטית נפוצה מבחינת ההערכות הכמותיות והאיכותיות של כלל קהילות החיידקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעילות של פרוטוקולי מיצוי DNA יכולה להיות תלויה במידה רבה על שני הסוג של מדגם נחקר והסוגים של ניתוחים שבוצעו במורד הזרם. בהתחשב בכך שהשימוש בטכניקות חדשות ניתוח קהילת חיידקים (למשל, microbiomics, metagenomics) הופך נפוץ יותר במדעי החקלאות ואיכות הסביבה, ורבים דגימות סביבתיות בתוך דיסציפלינות אלה יכולים להיות physiochemically וmicrobiologically ייחודי (לדוגמא, צואה ודגימות חול / מצעים מ ספקטרום ייצור העופות), שיטות מיצוי DNA מתאימות ויעילות צריכה להיות שנבחרו בקפידה. לכן, שיטת מיצוי DNA ההיברידי אוטומטית-למחצה רומן פותחה במיוחד לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיים. שיטה זו היא שילוב של שני סוגים העיקריים של מיצוי DNA: מכאני והאנזימטית. צעד הומוגניזציה מכאנית אינטנסיבי דו-שלבים (באמצעות חרוז הכאה גיבש במיוחד עבור לסביבהדגימות טל) התווספה לתחילתה של השיטה "תקן זהב" האנזימטית מיצוי DNA לדגימות צואה כדי לשפר את ההסרה של חיידקים וDNA ממטריצת המדגם ולשפר את ההתאוששות של חברי קהילת חיידקים גראם-חיוביים. ברגע שחלק החילוץ האנזימטית של השיטה ההיברידית יזם, תהליך הטיהור שנותר היה אוטומטי באמצעות תחנת עבודה רובוטית כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית מדגם מדגם שגיאת עיבוד. בהשוואה לשיטות מיצוי DNA המכנית והאנזימטית הקפדניות, השיטה ההיברידית הרומן הזה סיפק את הביצועים הטובים ביותר בשילוב כולל כאשר שוקלים כמותי (באמצעות 16S rRNA qPCR) ואיכותי (באמצעות microbiomics) ערכות של קהילות חיידקים הכוללת עת עיבוד צואת עופות ודגימות חול .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת ניתוח דגימות קליניות או סביבתיות מורכבות (למשל, צואה, קרקעות), ישנן שתי מתודולוגיות עיקריות המשמשות למיצוי DNA. הראשון הוא שיבוש מכני של המטריצה באמצעות צעד אינטנסיבי של הכאת חרוזים, ואילו השני הוא שיבוש אנזימטי של המטריצה לשחרור כימי של תאי חיידקים ועיכוב מעכבי PCR מהמטריצה בו זמנית. בהתחשב באמצעים השונים שבהם פועלים שני סוגים אלה של שיטות מיצוי, אין זה מפתיע שמחקרים קודמים הראו ששיטת מיצוי ה-DNA המתאימה תלויה מאוד בדגימה ובניתוח. מחקרי מיצוי DNA השוואתיים הראו בעבר כי שיטות מסוימות מתאימות יותר לשיפור איכות וכמות ה-DNA מדגימות סביבתיות1-3, בעוד שאחרות הראו שיפורים בניתוחים ברמת הקהילה כגון אלקטרופורזה של ג'ל שיפוע דנטורינג (DGGE)4-6, פולימורפיזם אורך שבר הגבלה סופית (T-RFLP)7, ניתוח מרווח בין-גני ריבוזומלי אוטומטי (ARISA)8 ומיקרו-מערכים פילוגנטיים9. לכן, יש להשתמש בשיטות מיצוי DNA מתאימות, או לפתח, בהתאם לסוגי הדגימות הסביבתיות וסוגי הניתוחים המבוצעים על דגימות אלה, במיוחד לאור ההתקדמות האחרונה בניתוחי קהילת החיידקים.

ריצוף הדור הבא, בשילוב עם הערכות קהילתיות כמותיות יותר (למשל, PCR כמותי (qPCR)), הופך נפוץ יותר במדעי הסביבה והקליניים, עם זאת, מעט מאוד מחקר בוצע כדי לקבוע את ההשפעה של שיטות מיצוי DNA על מערכי נתונים אלה. רוב מחקרי השוואת מיצוי ה-DNA עסקו בהערכות של קהילת המיקרוביום מדגימות מודל אנושי או אנושי10,11, ולא דגימות של בעלי חיים חקלאיים. מחקרי הריצוף המעטים של הדור הבא שהתמקדו בעופות עסקו בשאלות מטגנומיותספציפיות 12,13 או מיקרוביומיות14; הם לא דנו בהשפעת שיטת מיצוי ה-DNA על הניתוחים המיקרוביומיים שנוצרו. בהתחשב באופי המורכב של דגימות סביבתיות הקשורות לייצור עופות (למשל, צואה, פסולת/מצעים, אדמת מרעה), יש לבחור בקפידה שיטות מיצוי DNA. ידוע כי דגימות סביבתיות הקשורות לעופות מכילות מספר רב של מעכבי PCR ונדרשו דילולים של עד פי 500 של תמצית DNA עבור PCR וניתוח במורד הזרם15-17. לכן חיוני ששיטות מיצוי ה-DNA יהיו מותאמות לדגימות מסוג זה על מנת לא רק לשבש פיזית את המטריצה, אלא גם להיות מסוגלים להפחית/לחסל את המספר הגדול של המעכבים הקיימים.

ערכת המיני של צואה DNA QIAamp, שיטת מיצוי אנזימטית, נחשבה ל"תקן הזהב" בעת חילוץ DNA מדגימות מעיים/צואה קשות1,18,19 ויושמה בהצלחה על דגימות סביבתיות של עופות8,14. ההסרה האנזימטית של מעכבי PCR באמצעות מטריצה קניינית היא אחד היתרונות הגדולים ביותר של שימוש בשיטה זו עבור סוגים אלה של דגימות סביבתיות, כמו גם היכולת לשפר משמעותית את התפוקה (ולהפחית את שגיאת עיבוד הדגימות) באמצעות תחנות עבודה אוטומטיות. חסרון מרכזי אחד הוא היעדר שלב הומוגניזציה מכני לניתוק פיזי של תאי חיידקים מהמטריצה הסביבתית. בעת בדיקת דגימות מעיים וצואה ממקור שאינו עופות, תוספת של שלב הכאת חרוזים או שיבוש מכני בפרוטוקול מיצוי DNA הגדילה משמעותית את יעילות המיצוי9, תפוקה/איכות DNA1,4,5 ושיפרה משמעותית את ניתוחי הקהילה במורד הזרם במונחים של עושר, מגוון וכיסוי5,6,11. מחקרים אלה השוו לא רק שיטות הכאת חרוזים מכניות לשיטה האנזימטית "תקן הזהב", אלא חלקם הוסיפו גם את שלב הכאת החרוזים המכני לפרוטוקול האנזימטי כדי לשפר את התוצאות6,9,11.

על פי התוצאות מהמחקרים לעיל, ניתן לשפר את ניתוחי קהילת החיידקים (הן איכותיים והן כמותיים) מדגימות סביבתיות הקשורות לעופות באמצעות הוספת שלב הומוגניזציה מכני לשיטה האנזימטית. לכן, מטרת מחקר זה הייתה כפולה: (1) לפתח טכניקת מיצוי DNA חדשה המשתמשת בהיבטים הרצויים ביותר הן של שיטות המיצוי המכניות (שלב הומוגניזציה רב עוצמה) והן האנזימטיות (הסרת מעכבי PCR ואוטומציה) ו-(2) להשוות את ההערכות הכמותיות (באמצעות qPCR) והאיכותיות (באמצעות מיקרוביומיקה) של שיטה חדשה זו לשיטות מכניות ואנזימטיות מייצגות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Homogenization מכאני של דוגמאות ייצור עופות הסביבה

  1. לפני המיצוי, להגדיר אמבט מים עד 95 ° C ולאפשר זמן אמבט מים כדי להגיע לטמפרטורה זו.
  2. לשקול את 0.33 גרם של אדמה או חומר צואתי לתוך צינור lysing מטריקס E 2 מיליליטר.
    1. לא יעלה על 0.33 גרם של מדגם בצינור, שכן זה יגרום הפתרונות הבאים למעבר לקיבולת של הצינור.
    2. דגימות הפשרה קפוא לRT לפני השקילה.
    3. על מנת לנתח את כולל של 1 גרם של אדמה / צואה, שוקל 3 מ- לשכפל 0.33 דגימות g עבור כל דגימה סביבתית בודדת.
    4. חנות דגימות ב -20 ° C בתוך צינורות מטריצת חרוטי לפני המיצוי, במידת צורך.
  3. להוסיף 825 μl סודיום פוספט הצפת וμl 275 של פתרון PLS לצינור מדגם. מערבבים בעזרת מערבולת ל~ 15 שניות ואז צנטריפוגות הדגימות 14,000 XG במשך 5 דקות.
  4. למזוג supernatant ולהוסיף 700 μl של הצפת ASL. מערבבים בעזרת מערבולת במשך 5 שניות.
    1. ודא שיש אמיץ (10% נפח כולל ~) זמין בצינור חרוטי בשלב זה. אם אין אמיץ, הצינורות יהיו נטייה לדלוף במהלך שלב הומוגניזציה הבא שעלולות להוביל לזיהום צולב ו / או הפסד מדגם.
  5. מניחים את הדגימות למכשיר 24 FastPrep, וhomogenize הדגימות במהירות של 6.0 מ '/ שנייה למשך 40 שניות.
  6. צנטריפוגה המדגם הומוגני 14,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר סטרילי.
  7. על מנת למקסם את התאוששות DNA מן המדגם, חזור על שלבים 1.4-1.6, המשלבים את supernatants לתוך צינור microcentrifuge, 2 מיליליטר סטרילי.

2. אנזימתי עיכוב של המעכבים מhomogenates לדוגמא

הערה: פרוטוקול זה משתמש בערכת QIAamp DNA הצואה Mini.

  1. דגירהsupernatant באמבט מים C ° 95 במשך 5 דקות על מנת למקסם את התאוששות DNA מכל תאים שנותרו בתוך supernatant.
    1. לדגור על 70 מעלות צלזיוס למשך דגימות המכילות אורגניזמים בעיקר גראם שליליים. עם זאת, אם אורגניזמים גראם חיוביים נמצאים (שהוא במקרה עם דגימות צואה עופות), דגירה על 95 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש בקליפים פלסטיק נעילה על צינורות microcentrifuge כדי להבטיח שהצינורות לא "פופ" פתוחים ואפשרות לאבד נפח דגימה כלחץ יכול להצטבר בצינורות microcentrifuge האטומים אלה.
  2. פתח כל צינור microcentrifuge כדי לשחרר את הלחץ, צינורות microcentrifuge מחדש כובע ומערבבים בעזרת מערבולת במשך 15 שניות.
  3. צנטריפוגה מדגם 14,000 XG דקות 1, להסיר 1.2 מיליליטר של supernatant ולמקם אותו לתוך צינור סטרילי חדש 2 מיליליטר microcentrifuge.
  4. הוסף 1 כרטיסיית InhibitEx מדגם זה, ומערבבים בעזרת מערבולת עד המדגם הופך נוזל אחיד לבן / off-לבן.
    1. הימנע touching כרטיסיית InhibitEx תוך שימה אותו לתוך צינור microcentrifuge המכיל את המדגם. כדי להשיג זאת, הנח את חבילת השלפוחית ​​המכילה את הכרטיסייה ישירות על צינור microcentrifuge הפתוח ודחף בעדינות את הכרטיסייה מחפיסת השלפוחית ​​ולתוך צינור microcentrifuge.
  5. דגירה המדגם 1 דקות בRT (~ 25 מעלות צלזיוס) וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
  6. להעביר את כל הנוזל לצינור סטרילי 1.5 מיליליטר microcentrifuge ו צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
    1. הימנע מכל חלקיקים שנותרו שאולי pelleted בתחתית צינור microcentrifuge בסוף השלב 2.5 בעת העברת הנוזל.

3. אוטומטי DNA טיהור באמצעות QIAcube רובוטית Workstation

הערה: מספר מתכלה פלסטיק, ההסדר של מתאמי הרוטור מדגם בתוך צנטריפוגות, וכרכים הנדרשים ממאגרים / הפתרונות תלויים בnumבער של דגימות שמתנהלות.

  1. להוסיף צינורות elution וצינורות מסנן לחריצים המתאימים במתאמי הרוטור. עבור כל דגימה, להוסיף 400 μl לחריץ אמצע מתאם הרוטור. הנח את מתאמי הרוטור בצנטריפוגה תחנת העבודה בהסדר הנכון בהתאם למספר הדגימות מטוהר.
    1. ודא שכל מכסי צינור microcentrifuge מאובטחים כראוי בתוך מתאם הרוטור מאז כישלון לעשות זאת עלולה לגרום לגז באחד משלבי צנטריפוגה של פרוטוקול הטיהור.
  2. הוסף את המספר הדרוש של 1,000 μl ו -200 μl מסנן-טיפים לתחנת העבודה, ולמלא את בקבוקי חיץ המסופקים עם הנפח הנדרש לאחסון.
    הערה: כל המאגרים הנדרשים לפרוטוקול טיהור זה (AL, AW1, Aw2, וAE) נמצאים בתוך ערכת QIAamp DNA הצואה Mini. המשתמש צריך לספק אתנול 100% מה שצריך לbu AWffers וכפתרון המשמש בתהליך הטיהור.
  3. הוסף את הנפח הנדרש של פתרון K proteinase סיפק לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ומניח אותו לחריץ בתחנת העבודה. כמו כן, להוסיף את המספר הנדרש (שווה למספר של דגימות מטוהרות) של RB צינורות מדגם microcentrifuge בטוח נעילת 2 מיליליטר לסעיף שייקר של תחנת העבודה.
    1. ודא שהמכסים של צינורות המדגם ממוקמים באופן מאובטח לחריצים המתאימים בתחנת העבודה, מאז כישלון לעשות זאת תגרום לשגיאה כאשר המכונה בתחילה סורק את תחנת העבודה כדי לוודא שכל הפלסטיק והנוזלים הדרושים זמינים לבקש לרוץ.
  4. שימוש במסך המגע בתחנת העבודה, בחר בצואת DNA - צואה אדם - פתוגן איתור פרוטוקול, וקרא במסכים הבאים כדי להבטיח שתחנת העבודה הייתה טעונה בצורה נכונה. ברגע שכל מסכי הבדיקה מועברים, בחר התחל לרוץ בפרוטוקול זה.
    1. אם חילוץ DNA יותר מ 12 דגימות, להתחיל בתהליך הומוגניזציה (שלב 1) לסדרה הבאה של דגימות, מאז ריצה של 12 דגימות לוקחת ~ 72 דקות כדי להשלים בתחנת העבודה.
  5. הסר את הדגימות ממתאמי הרוטור, כובעם, ומקום ב -20 ° C עד צורך לניתוחים במורד הזרם שלאחר מכן.
    1. בשלב זה, לשלב את purifications לשכפל 3 למדגם בודד (סכום כולל = 1 גרם ניתחו) באמצעות מערכת צנטריפוגה / מבוסס אידוי. מערבבים את משכפל מחדש elute לנפח סופי של של חיץ טריס-ETDA 100 μl.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, גללי צואה טריים ודגימות חול שהתאוששו מבית מסחרי פטם (~ 25,000 ציפורים) בדרום-מערב ארה"ב. הפטמים (גאלוס גאלוס) היו קוב-500 חוצים, והם היו בני 59 ימים בזמן הדגימה. דגימות צואה וחול טריות היו התאוששו מארבעה אזורים שונים בתוך הבית (ליד קירור כרית, בקרבת קווי Waterer / המזין, בין שורות Waterer / מזין, וליד אוהדי פליטה), ודגימות מכל אחד מהתחומים הללו הכילו חמישה במאגר דגימות מתוך אזור זה. דוגמאות מארבעת תחומי הבית חולצו וכמותית / איכותי ניתחו בנפרד בהתאם לסוג מדגם (צו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת מיצוי DNA משמשת בוצעה הערכות חיידקים כוללת כמותיים ואיכותיות הקהילה לשתי דגימות הצואה והמלטה, התומך במדגם מנתח טבע תלוי בשיטות מיצוי DNA ראה בעבר 1,3,6. עבור שני דגימות צואה והמלטה, סדר ביצועים של שיטות מיצוי DNA היה שונה עבור כמותית (מכאני> היברידי> אנזימתי) ו(> ההיברידית אנזימתי> מכאני) האיכותית הכוללת הערכות קהילת חיידקים. בעוד השיטה ההיברידית לא לייצר האומדנים כמותיים או איכותיים הגבוהים ביותר, בשני המקרים בשיטה ההיברידית הניבה תוצאות שהיו מבחינה סט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות ללטויה וויגינס וקטלין גריפין על סיועם ברכישת דגימות, כמו גם ללורה לי רתרפורד על סיועם בדגימה וניתוחים מולקולריים. אנו רוצים גם להודות לשרה אוונס מהמעבדה הלאומית ארגון על הכנת דגימות מיקרוביומיות וריצוף. מחקרים אלה נתמכו באופן שווה על ידי שירות המחקר החקלאי, פרויקטים של USDA CRIS "פרמטרים להפחתת פתוגנים ועיבוד במערכות עיבוד עופות" #6612-41420-017-00 ו"גישות מולקולריות לאפיון פתוגנים הנישאים במזון בעופות" #6612-32000-059-00.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050גדלים שונים זמינים ושלושת המספרים האחרונים של החתול. לא. ציין גודל (-050 = 50 צינורות, -200 = 200 צינורות, -1000 = 1,000 צינורות)
תמיסת נתרן פוספטMPBio6570-205ניתן לרכוש בנפרד, או להכיל גם בערכת הספין של FastDNA לצואה (Cat. מס' 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 מ"ל)Qiagen19082
FastPrep 24 הומוגנייזרMPBio11600450048 x 2 מ"ל מתאם HiPrep (Cat. מס' 116002527) זמין לתפוקה כפולה של שלב הומוגניזציה מכנית
QIAamp DNA שרפרף מיני ערכתQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292תוצאות ראשוניות מראות כי QIAcube HT (Cat. מס' 9001793) יכול לשמש לשיפור התפוקה, אך נדרשים חומרים מתכלים שונים ממכונה זו ויש לבצע עבודה השוואתית יותר.
טיפים לפילטר, 1,000 מ"ל (1024)Qiagen990352
200 מ"ל (1024)מתאמי רוטור Qiagen990332
QIAcube (10 x 24)Qiagen990394עבור צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל הכלולים בערכת מתאם הרוטור יש חלופה. זה Sarstedt Micro tube 1.5 מ"ל מכסה בטיחות, Cat. מס' 72.690
מבחנות דגימה RB (2 מ"ל)חלופה Qiagen990381: מבחנה מיקרו Eppendorf Safe-Lok, Cat. מס' 022363352
קצות מסננים ,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Hybrid DNA ExtractionMechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

מאמרים קשורים