מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

סיכום

כאן אנו מתארים בדיקה פשוטה לכימות תגובת ההזנה בהידרה הנגרמת על ידי הצורה המופחתת של גלוטתיון. בדיקה זו מסתמכת על מדידת המרחק בין הקצה האפיקלי של הזרוע לפה של ההידרה.

תקציר

הידרה היא בין האורגניזמים הפרימיטיביים ביותר בעלי מערכת עצבים וכימותרפיה לזיהוי גלוטתיון מופחת (GSH) ללכידת הטרף. התנועה של אורגניזמים טרף גורמת לפריקה מכנית-חושית של התאים הצורבים הנקראים נמטוציסטים מהידרה, המוחדרים לטרף. תגובת ההזנה בהידרה, הכוללת סלסול של הזרועות כדי להביא את הטרף לכיוון הפה, פתיחת הפה וכתוצאה מכך בליעת הטרף, מופעלת על ידי GSH הקיים בנוזל המשתחרר מהטרף הפצוע. כדי להיות מסוגל לזהות את המנגנון המולקולרי של תגובת ההזנה בהידרה שאינו ידוע עד כה, יש צורך לקבוע בדיקה למדידת תגובת האכילה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לכימות תגובת ההזנה שבה נמדד המרחק בין הקצה האפיקלי של הזרוע לפה של ההידרה ונקבע היחס בין מרחק כזה לפני ואחרי הוספת GSH. היחס, הנקרא התפשטות הזרוע היחסית, נמצא כנותן מדד לתגובת האכלה. בדיקה זו אומתה באמצעות מודל רעב שבו הידרה מורעבת מראה תגובת הזנה משופרת בהשוואה להידרה המוזנת מדי יום.

מבוא

הידרה הוא האורגניזם הפרימיטיבי ביותר בעל מערכת עצבים וכימותרפיה לזיהוי גלוטתיון מופחת (GSH) ללכידת הטרף¹. הוא ניזון ממגוון בעלי חיים כגון נמטודות, סרטנים, זחלי חרקים, ראשנים ודגים שזה עתה בקעו¹. התנועה של אורגניזמי הטרף האלה גורמת לפריקה מכנית-חושית של הקפסולות הצורבות הנקראות נמטוציסטים מהידרה, המוחדרות לטרף². GSH הקיים בנוזל המשתחרר מהטרף הפצוע מפעיל לאחר מכן את תגובת ההזנה בהידרה הכוללת סלסול של הזרועות כדי להביא את הטרף לכיוון הפה, פתיחת הפה וכתוצאה מכך בליעת הטרף. מולקולות מרובות, כגון דופמין³, גלוטמט⁴, GABA, גליצין⁵, קולטני NMDA⁶ ואלטוטרופין⁷, הוכחו כמעורבות בתגובת ההזנה בהידרה. כמו כן, הוכח כי התגובה הכימו-סנסורית הנגרמת על ידי GSH מווסתת על ידי מצב ההזנה של בעל החיים כך שההידרה המורעבת הפגינה תגובת הזנה משופרת¹. עלייה כזו ברגישות ל-GSH רלוונטית מבחינה ביולוגית מכיוון שתחת רעב הידרה צריכה למצוא את הטרף שלה ברגישות גבוהה יותר.

למרות שניתן לראות בבירור את תגובת ההזנה הנגרמת על ידי GSH במיקרוסקופ, השיטות המשמשות בדרך כלל למדידת תצפיות תגובת ההזנה אינן כמותיות. ברוב המקרים, הזמן שבו הפה של ההידרה נשאר פתוח נלקח כמדד לתגובת ההזנה^8,9; ואילו במקרה אחר, הכימות התבסס על מספר ההידרה מתוך אוכלוסייה המציגה את תגובת ההזנה¹⁰. עם זאת, התבוננות בזמן פתיחת הפה של פוליפי ההידרה היא מסורבלת ונתונה לשינויים הנגרמת על ידי פרמטרים בלתי נשלטים כגון כיוון כיוון הפה במהלך תצפיות. באופן דומה, מכיוון שתגובת ההזנה היא פרמטר כמותי, גישות מבוססות אוכלוסייה נתונות לשינויים/שגיאות הנגרמות על ידי דעה או הטיה תצפיתית של הצופה הבודד. כדי לעקוף את הבעיות הללו פיתחנו שיטה לכימות יחסי של תגובת ההזנה בהידרה (Hydra vulgaris Ind-Pune¹¹) המבוססת על המרחק של הקצה האפיקלי של הזרוע מהפה של פוליפ ההידרה.

פרוטוקול

1. הידרה תרבות ומדידה של תגובת ההאכלה

1. לשמור על פוליפים מפלצת בתרבות על ידי האכלה להם מדי יום עם הארטמיה ולשמור אותם במדיום (חיץ 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6, 1 מ"מ NaCl, 1 מ"מ CaCl _2, 0.1 מ"מ KCl, ו0.1 מ"מ MgSO ₄₎ הכלולים ב קערת זכוכית על 18 מעלות צלזיוס תחת מחזורים כהים שעות אור-12 12 שעות כפי שתוארה קודם לכן ^12.
2. למדידת תגובת ההאכלה, להעביר את אחד להבשיל פוליפ מפלצת שיש 5 עד 6 זרועות ולבודדות של צלחת 24 גם. הסר את מדיום השייר מהבאר על ידי הטיית אותו, ולאחר מכן להוסיף באופן מיידי 500 μl של מדיום חדש.
3. הכן פתרון גלוטתיון 9 מיקרומטר במדיום מפלצת. מאז פתרון גלוטתיון הוא נוטה לחמצון, תמיד להשתמש בפתרון גלוטתיון מוכן טרי עבור כל ניסוי.
4. העבר את הצלחת לפלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ שיש הפרשות להקלטת תמונה. השתמש ברקע כהה באופן שo ההתנהגותפוליפ מפלצת F ניתן הדמיה בבירור על הרקע המנוגד.
5. החדר המשמש לצפייה והדמית ההתנהגות חופשית מפלצת מאורות בעוצמות משתנות, זרמי אוויר ורעש. הפרעות כאלה עלולות לגרום גם פוליפ המפלצת להראות התכווצות של זרועות - גם בהיעדרו של גלוטתיון.
6. לאפשר פוליפ להירגע במשך 5 דקות.
7. ודא שפוליפ ממוקם לאורך האזור המרכזי של הבאר, כך שההתנהגות ניתן הדמיה ברורה. אם פוליפ הוא בקצה של הבאר, להביא אותה למרכז על ידי שטיפה הבינוני באמצעות פיפטה ושוב לאפשר לו להירגע.
8. ללכוד תמונה של מפלצת במצב רגוע. זה יהיה תצפית נקודת אפס-הזמן.
9. להוסיף במהירות 9 מיקרומטר פתרון גלוטתיון להגיע לריכוז סופי של 3 מיקרומטר בבאר. בהתאם לצורך של הניסוי והתגובה מוצג על ידי מפלצת, לבדוק מגוון של ריכוזים שונים של גלוטתיון וChoose הריכוז המתאים הנדרש.
10. להפעיל את הטיימר מייד לאחר הוספת פתרון גלוטתיון וללכוד תמונות אחרי כל שניות 15-30 ל4-5 דקות. אין לשנות את הגדרות ההגדלה במהלך ההדמיה הזמן לשגות.
11. מוסיף את פתרון גלוטתיון בעדינות ובזרימה אחידה כך שעמדתו של בעל החיים ובתהיה מוטרדת מינימאלית בשדה הראייה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם פוליפ נע בהרחבה לאחר הוספת פתרון גלוטתיון, להזיז את הצלחת בעדינות רבה כדי להביא את פוליפ בשדה הראייה ללכידת תמונה.
12. בניסוי השליטה, להשתמש במדיום חסר גלוטתיון תוך שמירה על כל הפרמטרים האחרים זהים.
13. הקפד לבצע את כל שלבי ניסוי מעל במחצית הראשונה של היום - לפני 13:00 להימנע ההשפעה האפשרית של קצב היממה על מידת היענות האכלה.
14. פתח כל אחת מהתמונות שנתפסו באמצעות תכנית GNU תמונת מניפולציה (GIMP).
השתמש בכלי "מדוד" זמין מתפריט> כלים> למדוד כדי לקבוע את המרחק בין קצה קודקוד של כל אחד מהזרועות וhypostome. אם פתיחת הפה הוא ציין בכל אחת מהתמונות, לקבוע את המרחק בין המרכז של הפה נפתח וסוף הפסגה של הזרוע. עיין במרחק זה כמו התפשטות הזרוע.
15. לחשב את התפשטות הזרוע הממוצעת לכל פוליפ לפני ואחרי חשיפת גלוטתיון. לחשב את היחס של התפשטות זרוע ממוצעת בנקודת אפס זמן לזה שבכל אחד מנקודתי הזמן שלאחר מכן. יחס זה נקרא התפשטות זרוע היחסית.
16. חזור על מדידות לפחות 20 פוליפים.

2. שיטת אימות באמצעותדגם רעב

1. לרעב, להעביר כמה פוליפים הידרה לקערת זכוכית נפרדת ולא להאכיל אותם במשך 5 ימים. להאכיל את קבוצת הביקורת של כמה פוליפים יומיים עם הארטמיה בקערה בגודל דומה. לשנות את המדיום משני ניסויי קערות יומיים, כדי למנוע צמיחת פטרייה במדיום.
2. ביום של הניסוי, להאכיל את קבוצת הביקורת של מפלצת עם הארטמיה עבור שעה 1 ולהשתמש בהידרה אלה לניסויים הבאים לאחר הסרת כל הארטמיה לא נאכלה ומת מהמדיום.
3. למדוד את תגובת ההאכלה של המפלצת הרעבה בהשוואה למפלצת מקבוצת ביקורת בשיטה שתוארה קודם לכן בשלב 1. כדי למנוע כל הטיה בשל זמן של התבוננות, להחליף את המידות של כל אחד מרעב ולשלוט פוליפים מפלצת.

תוצאות

גלוטתיון גורם מפלצת להציג סלסול של זרועות לכיוון הפה לצורך שוטף את הטרף. סלסול כזה של זרועות מביא קצות הפסגה של זרועות קרובה יותר לhypostome. התוצאה היא ההפחתה במרווח הזרוע, או את המרחק ליניארי בין סוף הפסגה של הזרוע וhypostome (איור 1). ההתפשטות היחסית הזרוע, או היחס של זרוע ממוצעת להתפשט לפני ואחרי הוספת גלוטתיון, בממוצע על פני פוליפים מרובים מפחיתה לאורך זמן. התפשטות הזרוע היחסית לאחר תוספת של המדיום חסר גלוטתיון, לעומת זאת, מפחיתה רק זמנית ומשיגה ערך יחידה בתו...

דיון

התנהגות אכילה בהידרה מייצגת את אחת ממערכות chemosensory האבות ביותר בmetazoans. למרות הנוכחות של GSH בנוזל הסרטנים שוחרר לאחר לכידת טרף בסיוע nematocyst זוהתה מזמן ^1, לא חלבון GSHR ולא את גן הקידוד המשוער / s מתאפיינת ממפלצת עד כה. ניסיונות מעטים שנעשו לאפיין GSH מחייב חלבונים במפלצת ^{8, 14, 15.} עם זאת, זהותם של חלבוני הקולטן המשוערים אלה נשאר רכיבים מעורפלים ומעט מאוד אחרים מולקולריים, אשר עשוי לתרום לתגובת ההאכלה, כבר דיווחו ל תאריך ^{16, 17.} GSHR ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חממה מקוררת	Panasonic	מיקרוסקופ MIR-254-PE
	Leica	S8AP0
מצלמה למיקרוסקופ	Leica	EC3
גלוטתיון מופחת	Sigma	G4251	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס הביאו את הבקבוק לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה כדי למנוע חמצון
תוכנית עריכת תמונות	GIMP	גרסה 2.8