Method Article

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vivo אינטראקציות מרחביות-זמניות של פתוגן והגנות חיסוניות ברמת הרירית אינן ניתנות להדמיה בקלות במארחים קיימים של בעלי חוליות. השיטה המוצגת כאן מתארת פלטפורמה רב-תכליתית לחקר קנדידה רירית בבעלי חוליות חיים תוך שימוש בכיס השחייה של דג הזברה הצעיר כאתר זיהום.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגנה מוקדמת מפני פתוגנים רירית מורכבת משני מחסום האפיתל ותאי חיסון מולדים. Immunocompetency של שניהם, ואינטרקום, הם בעל חשיבות עליונה להגנה מפני זיהומים. האינטראקציות של תאי מערכת חיסון המולדים אפיתל ועם הפתוגן נחקרות הטובות ביותר in vivo, שבו התנהגות מורכבת נפרש על פני זמן ובמרחב. עם זאת, מודלים קיימים אינם מאפשרים הדמיה מרחב ובזמן קלה של הקרב עם פתוגנים ברמה הרירית.

המודל שפותח כאן יוצר זיהום ברירית על ידי הזרקה ישירה של הפתוגן פטרייתי, קנדידה אלביקנס, לswimbladder של דג הזברה לנוער. הזיהום כתוצאה מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אפיתל והמולד התנהגות תא חיסונית לאורך התפתחות מחלת רירית. הרבגוניות של שיטה זו מאפשרת לחקירה של המארח כדי לחקור את הרצף המפורט של אירועים חיסוניים המובילים לphגיוס agocyte ולבחון את תפקידם של סוגי תאים מסוימים ומסלולים מולקולריים בהגנה. בנוסף, ההתנהגות של הפתוגן כפונקציה של התקפה חיסונית ניתן הדמיה בו זמנית על ידי שימוש בג-להביע חלבון פלואורסצנטי אלביקנס. רזולוציה מרחבית מוגברת של האינטראקציה מארח הפתוגן ניתן גם להשתמש בטכניקה לנתיחה swimbladder המהירה תיארה.

מודל הזיהום ברירית שתואר כאן הוא פשוט ושחזור מאוד, מה שהופך אותו לכלי רב ערך ללימוד פטרת ברירית. מערכת זו יכולה להיות גם באופן רחב הניתנות לתרגום לפתוגנים ריריים אחרים כגון חיידקים mycobacterial, חיידקים או ויראלי, כי בדרך כלל להדביק באמצעות משטחי אפיתל.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים ברירית עלולים להוביל לזיהומים מסכני חיים בזרם הדם עקב הנזק של מחסום האפיתל, המאפשר לפתוגנים גישה לסביבה המערכתית1,2. בנוסף, זיהומים ברירית יכולים גם לגרום לאימונופתולוגיה משמעותית גם כאשר הם כלולים חיצונית3-5. הפטרייה החד-תאית קנדידה אלביקנס קיימת ברוב האוכלוסייה בחלל הפה ובאתרים ריריים אחרים6-9. למרות שבדרך כלל מוכלים על ידי תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות, פגמים חיסוניים מולדים והתערבויות רפואיות עלולים להוביל לקנדידה רירית חמורה. ההתקפה על מחסום האפיתל מביאה לסיכון מוגבר למחלה מפושטת מסכנת חיים כמו גם לאימונופתולוגיה, כמו במקרה של קנדידה בולוו-נרתיקית, בנוסף קולוניזציה של C. albicans נקשרה להומאוסטזיס חיסוני ריאות10,11. קנדידה מפושטת היא כעת הזיהום הרביעי בשכיחותו בזרם הדם ביחידות טיפול נמרץ12 ותמותה של עד 40% הופכת אותה לדאגה גדולה. בשל הגידול בטיפולים אימונומודולטוריים לחולים עם מחלות אוטואימוניות, סרטן או השתלות איברים, חובה להבין את האינטראקציה בין פתוגן זה לתא החיסון הרירי.

רוב ההתקדמות הביולוגית של התאים בנוגע לאינטראקציות בין C. albicans לתאים ברמת הרירית מגיעה ממודלים במבחנה13-15 ועכברים16-18. לשתי הגישות הללו יש יתרונות ברורים, אך היכולת לדמות תאים חיים ברזולוציה גבוהה במארח שלם הגבילה את האפיון הזמני והמרחבי של הזיהום. עבור מחקרים אלה, יש צורך במודל in vivo שבו ניתן לדמיין את האינטראקציה של פתוגן, תאי חיסון ואפיתל מולדים במארח חוליות שלם.

דג הזברה התגלה ככלי רב ערך להבנת מחלות אנושיות, בעיקר בשל השקיפות שלו ויכולתו למניפולציה גנטית. התפתחות תאים ואיברים צולמה בפירוט מעולה, מה שהוביל לתיאור התנהגויות חדשות של תאי חיסון, כגון התנהגות תאי T בתימוס19 המתפתח או הקרב בין מיקובקטריות תוך-תאיות לפגוציטים20-22. עבודה אחרונה תיארה אינטראקציות בין חיידקי מעיים למארח בדגי הזברה והראתה כי קולוניזציה מיקרוביאלית של מערכת העיכול משפיעה על הפיזיולוגיה של המעי המארח ועל עמידות לזיהומים אחרים23,24. יתר על כן, זיהום דרך אפיתל המעי תואר עבור מספר פתוגנים.

בניגוד למערכת העיכול, שלפוחית השחייה מייצגת מודל רירי מבודד ומשלים יותר. איבר זה הוא הרחבה של צינור המעי המתפתח ונוצר קדמית לכבד וללבלב25,26. הוא מייצר פפטידים פעילי שטח, ריר ואנטי-מיקרוביאלים27,28 ומבחינה אנטומית, כמו גם מבחינה אונטוגנטית, איבר זה נחשב להומולוג של ריאת היונקים29,30. מכיוון שהצינור הפנאומטי נשאר מחובר למעי בדג הזברה, הדבר מאפשר לזיהום טבילה להתרחש באופן טבעי. למרבה הפלא, הזיהומים הטבעיים היחידים הידועים של דגים עם מיני קנדידה הם זיהומי C. albicans בכיס השחייה31. לאחרונה תיארנו מודל זיהום טבילה ניסיוני שבו C. albicans מדביק את שלפוחית השתן, ומצאנו שזיהום זה מסכם כמה מסימני ההיכר של אינטראקציה בין C. albicans לאפיתל במבחנה32,33.

בשיטה המוצגת כאן, מודל הזיהום המקורי בטבילה משופר על ידי הזרקה ישירה של C. albicans לכיס השחייה של דג הזברה 4 ימים לאחר ההפריה (dpf). זה מאפשר שליטה זמנית מדויקת בזיהום כמו גם חיסון בעל יכולת שחזור גבוהה. זה מאפשר הדמיה תוך-חיונית מפורטת, יחד עם הרבגוניות של דגם דג הזברה. כדוגמה למה שניתן לעשות בשיטה זו, אנו מציגים את הדינמיקה המרחבית-זמנית של גידול C. albicans יחד עם גיוס נויטרופילים לאתר ההדבקה. מכיוון שרקמת שלפוחית השחייה של דג הזברה מאתגרת להדמיה תוך-חיונית, אנו מציגים גם טכניקת דיסקציה מהירה של שלפוחית השחייה המשפרת את אות הקרינה והרזולוציה המיקרוסקופית. שיטות אלה מרחיבות את ארגז הכלים למחקר פטרייתי, אימונולוגי וחקלאות ימית, כמו גם מתארות מסלול זיהום חדש שעשוי להיות מתורגם למודל זיהומים פטרייתיים, חיידקיים או נגיפיים אחרים של משטחים ריריים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל פרוטוקולי טיפול דג הזברה והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות NIH תחת מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) A2012-11-03 פרוטוקול.

1. דג הזברה גידול עד 4 ימי הפריה הודעה

  1. לאסוף דג הזברה AB, או כל קווים מהונדסים אחרים, תוך שלאחר ההפריה 3 שעות הראשונות, כפי שמוצג בסרטון אחר 34.
  2. דגירה 120 ביצים ב-15 סנטימטרים צלחות פטרי המכילות 150 מיליליטר של תקשורת E3 (5 mM NaCl; 0.17 מ"מ KCl; 0.33 מ"מ CaCl 2; 0.33 מ"מ MgCl 2; 2 מ"מ HEPES; pH 6.8) עם מתילן הכחול (מיקרוגרם 0.3 סופי / ml ריכוז) בחממה C ° 33 עם 12/12 האור / photoperiod כהה.
  3. החלף את התקשורת לאחר שעה 6 עם E3 + PTU (1-פניל-2-thiourea, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) ולהסיר את הביצים מתות.
  4. דגירה של 4 ימים על 33 מעלות צלזיוס, החלפת מדיה עם E3 הטרי + PTU לאחר 2 ימים.

2. בjection מיקרו-מחט הכנה

  1. משוך נימי בורוסיליקט (1.2 מ"מ OD, מ"מ ID 0.69) למייקרו-מחט באמצעות חולץ מחט עם ההגדרות הבאות (550 חום; 0 Pull; 130 Velocity; 110 זמן).
    הערה: ההגדרות תשתנה מחוט הלהט לחוט להט להשיג מיקרו-מחטים בצורה דומה (ראה איור 1) ויהיה צורך בכל פעם שסדרה את נימה חדשה מותקנת.
  2. מלא מיקרו-מחט עם 3 μl של 0.4 מיקרומטר מלוח מסונן-חיץ פוספט (PBS; 137 מ"מ NaCl; 2.7 מ"מ KCl; 10 מ"מ Na 2 HPO 4; 1.8 מ"מ KH 2 PO 4; pH 7.4) בעזרת פיפטה microloader 20 μl טיפ.
  3. הגדרת מיקרו-המחט על בעל micropipette על micromanipulator המחובר למערכת הזרקה בלחץ. הגדר את לחץ ההזרקה עד 30 PSI ומשך הדופק ליום 30 באלפיות שניים.
  4. שימוש בצלחת פטרי עם מים מזוקקים, להוריד את מיקרו-המחט עד 1/5 של המחט הוא במים. קליפ wi מיקרו-המחטth פינצטה בסדר, ממש מתחת למפלס המים. להביא מיקרו-המחט מחוץ למים וללחוץ על הדוושה מספר פעמים עד בולוס מופיע.
  5. מדוד את הקוטר של בולוס ידי הורדת מיקרו-המחט על hemocytometer שכבתי עם ירידה של סוג אחד שמן טבילה. התאם את משך הדופק כדי לקבל את העצמה הרצויה (ראה טבלה 1).
  6. הגדר את backpressure לבולוס להישאר יציב בשמן (להוריד את הלחץ אם בולוס מגביר את עוצמת השמע ולהגדיל את backpressure אם בולוס הנפח קטן). רשום את משך הדופק לכל מיקרו-מחט.
  7. הסר את PBS ממייקרו-המחט על ידי aspirating אותו באמצעות קצה פיפטה microloader ולגרש את השמאל על PBS על ידי הצבת אותו בחזרה על המזרק ומדליק את הדופק הרציף. שומר כל מיקרו-מחט.

3. הכנת קנדידה

  1. קנדידה אלביקנס Streak הפך עם אופטימיזציה קודון dTomato, GFP, BFP, EOS או רחוקאדום ממניות קפוא (-80 ° C המניה ב -25% גליצרול) באמצעות מסמרת עץ סטרילי על דקסטרוז שמרי peptine (YPD) צלחת אגר (10 גר 'שמרי L / תמצית, 20 גר' / peptone L, 20 גר '/ דקסטרוז L , אגר L / 20 g; autoclaved ושפכתי 25 מיליליטר בצלחות פטרי) ודגירת הלילה בשעה 30 ° C.
  2. פיק מושבה אחת באמצעות מסמרת עץ סטרילי ולחסן 5 מיליליטר של נוזל YPD (10 גר 'שמרי L / תמצית, 20 גר' / peptone L, 20 גר '/ דקסטרוז L, autoclaved וaliquotted סביבה נקי מחיידקים ב5 מיליליטר בתרבות זכוכית 16 x 150 מ"מ צינורות).
  3. דגירה הלילה בשעה 30 ° C בתוף רולר ב 60 סל"ד.
  4. לאסוף 1 מיליליטר של ג תרבות אלביקנס והעברה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 1.7 מיליליטר.
  5. צנטריפוגה בXG 5000 במשך כמה שניות. רוקן את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של סטרילית PBS, מערבולת ביסודיות. חזור פעמיים זה.
  6. ספירת המושבות באמצעות hemocytometer על ידי דילול מניות 1 מיליליטר 1: 1,000 בPBS סטרילי.

4. הזרקת דג הזברה בSwimbladder

  1. לחמם צלחת הזרקה (agarose 2%) למשך 30 דקות בחממה C ° 33.
  2. בזמן הרצוי, להסיר 100 של 150 מיליליטר של E3 + PTU מ -15 סנטימטרים צלחת פטרי המכילה דגים להזריק בעזרת פיפטה 25 מיליליטר ללא aspirating כל דג הזברה.
  3. הרדימי 4 DPF דג הזברה על ידי הוספת 2 מיליליטר של 4 מ"ג / מיליליטר שנאגרו tricaine מניות מתאן sulfonate (TR) לנותרה 50 מיליליטר התקשורת (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) ולהמתין במשך 15 דקות.
  4. תחת מיקרוסקופ לנתח, בחר דגים עם swimbladder מנופח. דגים גם יכולים להיות מוקרנים באותו הזמן לפנוטיפ הומוגנית, כגון הפצת נויטרופילים בMPO: קו GFP באמצעות epifluorescence לנתח מיקרוסקופ.
  5. לדלל את ג מניית אלביקנס מריכוזו המקורי (שלב 3.8) 1.5 x 10 7 מושבה להרכיב יחידות למ"ל (CFU / ml) בPBS.
  6. העבר את 30 דג הזברה על צלחת ההזרקה באמצעות צינור העברת פלסטיקטטי ולהסיר את המדיה העודפת.
  7. שימוש בכלי דיג-חוט (חוט דיג קוטר 0.012 אינץ 'סופר-דבוק לנימי ורוסיליקט), לעשות 3 שורות של 10 דגים, על ידי הלחיצה על צלחת ההזרקה אנכית ולהתמצא הדגים אנכי.
  8. הסר את המדיה העודפת.
  9. ביסודיות מערבולת הצינור עם 1.5 x 10 7 CFU / ml ג אלביקנס.
  10. מלא מיקרו-מחט אחת עם 3 μl של ג אלביקנס באמצעות קצה פיפטה microloader חדש ולהגדיר את משך הדופק להגדרה המתאימה (ראה שלב 2.9).
  11. סובב את צלחת ההזרקה לעשות זווית של 20 מעלות בין מיקרו-המחט והראש של הדג, מכוון לכיוון חלק האחורי של swimbladder (איור 3 א).
  12. לדחוף את מיקרו-המחט לתוך swimbladder, כדי לוודא שנשאת של המחט הוא בלומן, ולחץ על הדוושה פעם.
  13. חזור על פעולה עבור כל דגים ולהעביר לצלחת התאוששות (25 מיליליטר E3 + PTU) על ידי הצפת המנה עם E3ד לרוקן אותה לתוך צלחת ההתאוששות.
  14. העבר את 30 דגים אחר לצלחת ההזרקה.
  15. הזרקה חוזרת עם מיקרו-מחט חדשה מלאה ביסודיות vortexed ג אלביקנס.
  16. סיום על ידי הזרקת שליטת PBS, במידת צורך, באמצעות צלחת הזרקה שונה, כדי למנוע זיהום ולהעביר לצלחת נפרדת התאוששות (שלב 4.10).

5. הקרנת הדגים לבידוד רצוי

  1. הכן 40 מיליליטר של 0.4% נמוכים להמיס פתרון agarose (אה"ע) על ידי הוספת 160 מ"ג של נמוך להמיס agarose 40 מיליליטר של E3, רותח על ידי במיקרוגל עד שהיא נמסה, וקירור עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 400 μl של TR (מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי) מקורר פעם.
  2. לאחר 30 דקות התאוששות, לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מ"ל E3 + PTU, 200 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי).
  3. העברת 30 דגים (עם תקשורת קטנה ככל האפשר) עד 2 מיליליטר של LMA בסירה במשקל.
  4. דגים לשאוב בודדים עם טפטפת העברה וצלחת הדגים עם טיפות 1 של LMA לתוך צלחת הדמיה 96-היטב, רק באמצעות 10 x 6 הבארות מרכזיות.
  5. חזור על פעולה עד שכל הדגים למסך נטענים לצלחת ההדמיה.
  6. בואו התקשורת לגבש בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
  7. מקם את הדגים בצד שלהם, כדי לוודא שהם נמצאים בקשר עם תחתית הזכוכית.
  8. באמצעות מטרת 20X על epifluorescence / מיקרוסקופ confocal הפוך והמסנן המתאים, לרשום את המספר של ג תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של כל דגים.
  9. בחר את הדג עם 15-25 תאי שמרים בswimbladder (או הבידוד רצוי), להרדים לא נבחרו-דגים (800 / מיליליטר מיקרוגרם של TR בE3) ולחזור דגים נבחרו לצלחת פטרי עמוקה 50 מיליליטר של E3 + PTU עם על ידי הוספת 3 טיפות של E3 לבארות שנבחרו צלחת ההדמיה וaspirating הדגים עם טפטפת העברת פלסטיק.
  10. לדגור על 33 מעלות צלזיוס למשך הרצוי.

6. הדמיה הדגים Post-ההקרנה

  1. בזמן הרצוי, להסיר 25 של 50 מיליליטר של תקשורת E3 + PTU מהצלחת העמוקה פטרי המכילה דגים לתמונה.
  2. לטשטש את הדגים כפי שתואר (שלב 4.3 באמצעות רק 1 מיליליטר של TR לתוך 25 מיליליטר E3 + PTU שנותר, מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 200 סופי).
  3. צלחת הדגים לצלחת 96-היטב הדמיה ומיקום הולם (שלבים 5.3-5.7).
  4. תמונה על ידי סריקה מיקרוסקופית confocal באמצעות הלייזרים המתאימים ומסנני פליטה. מוקד ראשון על הדגים באמצעות מטרת 4X תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) ולרכוש תמונות של האזור של עניין באמצעות מטרת 20X עם לייזרי confocal במצב סריקה עם 2 מהירות μsec / פיקסל ו1024 x 600 פיקסל יחס ממדים. לרכוש Z- ערימות עם גודל צעד מיקרומטר 1, החלת מצב מסנן קלמן של 3 מסגרות.
  5. חזור אל צלחת פטרי עמוקה עם 50 מיליליטר E3 + PTU או לindividuaבארות l (צלחת 24 גם תרבות, 3 מיליליטר E3 + PTU) ולדגור על 33 מעלות צלזיוס.

7. ביתור Swimbladder

  1. ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה.
  2. הכן LMA 2% (שלב 5.3 עם 160 מ"ג של התכה נמוכה agarose ב 8 מיליליטר של E3).
  3. בזמן הרצוי, לטשטש את הדגים (שלב 5.2).
  4. העברה 10 דגים לצינור 1.7 מיליליטר צנטריפוגות עם 1 מיליליטר של E3 ולהרדים על ידי הוספת 200 μl של 4 מ"ג / מיליליטר Tricaine (מיקרוגרם / מיליליטר סופי ריכוז 800) לצינור צנטריפוגות ודוגר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. הכן שקופיות זכוכית הדמיה על ידי הצבת 4 טיפות של שומן ואקום בכיכר, מלבד 1 סנטימטר על microslide (75 x 25 מ"מ, איור 2).
  6. מקום 2 טיפות של 2% LMA באמצע הכיכר.
  7. הנח דג אחד בשקופית זכוכית נפרדת תחת מיקרוסקופ לנתח ולוודא שהלב הפסיק מכות, להסיר את עודפי המים.
  8. שימוש בפינצטה בסדר לנתח swimbladder על ידי שמירה על הראש בתנוחה קבועה עם פינצטה השמאל ומושך את הבטן הקדמית עם פינצטה תקין (איור 4 א).
  9. להרים את swimbladder על ידי צינור פנאומטי עם פינצטה השמאל, מפריד אותה ממערכת העיכול, ולמקם אותו במרכזה של LMA 2% לפני שהוא מבצרת.
  10. מניחים כיסוי להחליק (18 x 18 מ"מ) על גבי שקופית זכוכית הדמיה ולדחוף אותו עד שהוא נוגע גריז הוואקום, כמו גם את אה"ע (איור 2).
  11. תמונה בתוך 10 דקות של נתיחה כמתואר בשלב 6.4. חזור על שלב 7.7-7.11 עם הדגים האחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection בswimbladder האחורי

השיטה הניסיונית שהוצגה כאן מתארת ​​את ההזרקה של מינון של ג עקבי תאי שמרי אלביקנס בswimbladder של 4 DPF דג הזברה. עבודה קודמת עם מודל הטבילה עולה כי התגובה החיסונית swimbladder לג אלביקנס דומה לפטרת ברירית יונקים 32. כאן אנו מדגימים שיטת זיהום שונה שהיא יותר פשוט, לשחזור ומהיר; כמה מאות דג הזברה יכולות להיות מוזרקים והוקרנו בתוך כמה שעות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות ומגבלות מודל המחלה microinjection swimbladder

המודל שהוצג כאן הוא הרחבה של מודל טבילת פטרת הרירי המתואר בGratacap et al (2013).; זה מוסיף את היתרונות של זמן זיהום בשליטה, במינון מאוד לשחזור זיהום, ושיפור יעילות ולכן. אנו מדגימים כאן שיטות חדשות המאפשרות תיעוד לא פולשנית זמני של דינמיקת זיהום בפירוט רב, כמו גם הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר vivo לשעבר של swimbladder. נהלים אלה צריכים להקל על המח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר Le טרין וד"ר טובין לנדיבות מתן α-קטנין: קו דגי סיטרין וביל ג'קמן על שאפשר לנו לעשות את הצילומים במעבדה שלו. המחברים מודים מקורות מימון המכון הלאומי לבריאות (המענקים 5P20RR016463, 8P20GM103423 וR15AI094406) ומשרד חקלאות אמריקאי (פרויקט # ME0-H-1-00517-13). כתב יד זה מתפרסם כחקלאות וראשי ניסוי יערנות מספר פרסום התחנה 3371.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות 1.7 מ"לAxygenMCT-175-C
צלחות פטרי עמוקפישר סיינטיפיק89107-632
פיפטות העברהפישר סיינטיפיק13-711-7M
תמצית שמריםVWR Scientific90000-726
פפטוןVWR Scientific90000-264
דקסטרוזפישר סיינטיפיקD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
פינצטה משובחת (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
דיבלים מעץVWR Scientific10805-018
אגרוז נמס נמוךVWR Scientific12001-722
חולץ מיקרופיפטה חום בוערSutter InstrumentsP-97
בורוסיליקט נימיSutter InstrumentsBF120-69-10
MPPI-3 מערכת הזרקהמכשור מדעי יישומיMPPI-3
יחידת לחץ אחוריתמכשור מדעי יישומיBPU
ערכת מחזיק מיקרופיפטהמכשור מדעי יישומיMPIP
יישומי מדעי מכשורFSW
מיקרומניפולטורמכשור מדעי יישומיMM33
בסיס מגנטימכשור מדעי יישומי בסיסמגנטי
טריקאין מתאן סולפונאטווסטרן כימיקלים בע"MS-222
ניתוח מיקרוסקופאולימפוסSZ61 למעלה SZX-ILLB2-100 בסיס
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסIX-81 עם מערכת סריקת לייזר FV-1000 מערכת קונפוקלית
Eppendorf930001007
צינורות תרבית זכוכית (16 x 150 מ"מ)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
חימר ילדים (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
מתילן כחולVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
צלחות פטריפישר סיינטיפיקFB0875712
המוציטומטר ( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
שמן טבילה מסוג Aמוצרי שיש כחול51935
צנטריפוגהEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 פישר סיינטיפיקS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
חוט דיגStren
96 צלחת הדמיה באר (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
גריז ואקום גבוה (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
מיקרו-שקופית (25 x 75 מ"מ)VWR Scientific48300-025
תלושי כיסוי (18 x 18 מ"מ), מס' 1.5VWR Scientific48366-045
צלחת פטרי 15 ס"מ (פלסטיק אולימפוס)Genesee Scientific32-106
גליצרול (כימיקלים EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
צלחת תרבית 24 בארות (פלסטיק אולימפוס)Genesee Scientific25-107
סירות משקל (8.9 ס"מ)VWR Scientific89106-766
מתג רגל מ 20X מיקרוסקופ אובייקטיבי אולימפוס UPlanSApo 20x/0.75 תוף רולר ניו ברונסוויק מדעי TC-7 קצות פיפטה מיקרו-מעמיס

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mucosal CandidiasisZebrafish ModelSwimbladder InjectionCandida AlbicansConfocal MicroscopyNeutrophil RecruitmentHost Pathogen InteractionFluorescent ProteinSwimbladder DissectionJuvenile Zebrafish

Related Articles