גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

סיכום

צביעת חומצה שיף תקופתית היא טכניקה המדמה את תכולת הפוליסכריד של רקמות. מאמר זה מדגים פרוטוקול צביעת חומצה שיף תקופתי המותאם לשימוש בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי מטוהרים מדם ורידי אנושי. דגימות כאלה מועשרות עבור לימפוציטים ותאי דם לבנים אחרים של מערכת החיסון.

תקציר

צביעת חומצה תקופתית שיף (PAS) היא טכניקה אימונוהיסטוכימית המשמשת בביופסיות שרירים וככלי אבחון לדגימות דם. פוליסכרידים כגון גליקוגן, גליקופרוטאינים וגליקוליפידים מכתימים מג'נטה בהירה מה שמקל על ספירת תאים חיוביים ושליליים בתוך הרקמה. בתאי שריר צביעת PAS משמשת לקביעת תכולת הגליקוגן בסוגים שונים של תאי שריר, בעוד שבדגימות תאי דם צביעת PAS נחקרה ככלי אבחון למגוון מצבים. הדם מכיל חלק מתאי הדם הלבנים השייכים למערכת החיסון. הרעיון שתאי מערכת החיסון מחזיקים בגליקוגן ומשתמשים בו כמקור אנרגיה לא נחקר באופן נרחב. כאן, אנו מתארים גרסה מותאמת של פרוטוקול צביעת PAS שניתן ליישם על תאי חיסון חד-גרעיניים בדם היקפי מדם ורידי אנושי. נצפו תאים קטנים עם גרגירים חיוביים ל-PAS ותאים גדולים יותר עם צביעת PAS מפוזרת. טיפול בדגימות עם עמילאז מבטל את הדפוסים הללו ומאשר את הספציפיות של הכתם. טכניקה חלופית המבוססת על עיכול אנזימטי אישרה את נוכחותו וכמות הגליקוגן בדגימות. פרוטוקול זה שימושי עבור המטולוגים או אימונולוגים החוקרים את תכולת הפוליסכרידים בלימפוציטים שמקורם בדם.

מבוא

שיף צביעת חומצה תקופתית (PAS) היא טכניקה immunohistochemical כי נעשתה שימוש נרחב במחקר שריר ואבחון. כמו כן הוא משמש ככלי אבחון בדגימות דם. הטכניקה עובדת על ידי יישום פתרון חומצה תקופתי למדגם, אשר מתחמצן יחידות בתוך קבוצות אלדהיד פוליסכריד יצירת המגיבות עם המגיב של שיף חסר הצבע וכך לייצר מוצר מגנטה עמוק. צעדיו של נוהל זה מוצגים באיור 1. הכתם הופך כל דבר עם מגנט רב-סוכרים, כולל גליקוגן, גליקופרוטאינים, glycolipids, mucins, או מולקולות אחרות עם moieties פוליסכריד.

צביעת PAS משמשת לעתים קרובות כדי למדוד את רמות הגליקוגן בסיבי שריר. חלקי רקמות שרירים הם אידיאליים עבור הטכניקה כמו שהם מייחסים היטב לשקופית ולעמוד שלבי כביסה וצביעה מרובים. גליקוגן הוא ההווה ביותר בעווית מהירה סוג II סיבי שריר, שבו יש ביקוש גבוהלייצור ATP מהיר הדורש גליקוגן ^ל1,2 ביצועים מרבי. גליקוגן הוא פולימר מסועף של גלוקוז שיכול להיות שבור לגלוקוז החופשי דרך הפעולה של אנזימי phosphorylase הגליקוגן. בימים של מנוחה ותזונה-הסתפקות, גליקוגן מתחדש בתהליך של גליקוגנזה, ואילו בתקופות של ביקוש אי ספיקה או אנרגיה גבוהה תזונתי; גליקוגן מתפרק לגלוקוז על ידי "גליקוגנוליסיס". ממוקדם ככל 1950 מדעני קלינאי בחנו צביעת PAS על דגימות דם כדי לנתח תוכן גליקוגן במחלות שונות ^3-7. לדוגמא, במחלת-אחסון גליקוגן bonafide Pompe תאי דם לבנים disease- לצבור כמויות גדולות של גליקוגן ששונה באופן משמעותי מנבדקי ביקורת בריאים ^8.

וידאו-מאמר זה מדגים גרסה מותאמת של מכתים PAS לשימוש בתאי הדם היקפי mononuclear (PBMC) דגימות מהדם ורידים של בני אדם בריאים. PBMCs מכיל בעיקר לימפוציטים של הלימפוציטים T ומשפחות הלימפוציטים B, כמו גם תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי הרג טבעיים ומונוציטים. הצעד הראשון לטיהור מסיר אריתרוציטים, נויטרופילים, וגרנולוציטים אחרים. טכניקה זו מספקת נתונים על שיעור מרוכז של לימפוציטים מסוג המאפשר לספירה חזקה יותר של תאי PAS-חיובי בהשוואה לשימוש במשטחי דם כולה.

איור 1:. צעד אחר צעד המתודולוגיה של מכתים PAS על PBMC () ראשית, בידוד של PBMC מושגת באמצעות שיפוע ficoll, הלוח השמאלי מציג את ההכנה לפני צנטריפוגה, הפנל הימני מראה את זה אחרי צנטריפוגה בי המעיל באפי המכיל את PBMC הוא ציין במרכז של הצינור. PBMCs מבודדת (ב ') הם קבועים לשקופית באמצעות solu מקבע פורמלין-אתנולtion. השקופיות היא שטפו בעדינות עם מים מזוקקים מבקבוק פלסטיק לשטוף. (C) השקופית ממוקמת אז במחצית דרך 100 מיליליטר כוס מלאה פתרון עמילאז, שיתמוסס גליקוגן. השקופיות היא שטפו בעדינות. הוא טיפל (D) השקופיות עם פתרון חומצה תקופתי, שבו חמצון של סוכרים מתרחש. שקופיות הם שטופים בעדינות; זה יסיר את החומצה התקופתית העודפת ולעצור את צעד החמצון. (E) כאשר מגיב שיף מתווסף לשקופיות, זה יגיב עם אלדהידים נוצרו במהלך שלב החמצון. אז מגיב חסר צבע זה יגרום מוצר מגנטה אדום עמוק. שקופיות הם שטופים בעדינות כדי להסיר את מגיב שיף העודף.

פרוטוקול

מחקר עם דגימות דם אדם אושר על ידי אוניברסיטת קונקורדיה האתיקה המועצה לביקורת, מספר תעודת 10000618. העבודה על שריר עכבר אושרה על ידי אוניברסיטת קונקורדיה האתיקה המועצה לביקורת, מספר תעודת 2010BERG.

1. בידוד PBMC מדם מלא

הערה: לבצע הליך זה בקבינט בטיחות ביולוגי באמצעות טכניקה סטרילית וציוד מעוקר יצרן.

1. יוצק בזהירות 10-15 מיליליטר של דם מלא מצינורות heparinized (נוגדת קרישה) איסוף דם לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. לנשפך דם קטין, לנגב עם DDH ₂ O ו- 70% EtOH באמצעות רקמת ניקוי.
2. לדלל את הדם בצינור חרוטי ליחס של 1: 1 עם פוספט הצפת מלוח (PBS 1x) pH 7.4. ודא שעוצמת הקול המרבית הכוללת אינו עולה על 30 מיליליטר.
3. מערבבים בעדינות באמצעות אקדח פיפטה סרולוגיות הימנעות בועות.
   הערה: אל מערבבים על ידי היפוך הצינור כדי למנוע דםccumulation בכובע והחלחול שלאחר מכן במהלך צנטריפוגה.
4. להוסיף 13 מיליליטר של Ficoll-Paque (ראה חומרים וציוד שולחן), לצינור חרוטי 50 מיליליטר קיבולת חדש. שמור את הצינור זקוף במעמד.
5. בעזרת פיפטה העברה, לקחת דם מדולל, לגעת בקצה פיפטה ההעברה לקיר הפנימי של הצינור סמוך לראש. עם לחץ איטי ויציב, להעביר את הדם לאורך הקיר הפנימי של הצינור ויוצר שכבת דם על גבי שכבת סוכרוז. לעשות את הצעד הזה כמה וכמה פעמים עד שכל הדם הועבר.
6. שווי הצינור בחוזקה וצנטריפוגות הצינור בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ב 700 XG בהרוטור נדנדה עם סט ההאצה בינוני עד 5, והאטה לאפס.
7. לאט לאט להוציא את הצינור ומבלי להפריע את השכבות, לקחת אותו בחזרה לארון הבטיחות הביולוגי.
8. לאסוף את המעיל באפי (שכבה לבנה דקה מעונן), שבו PBMCs נמצאות, ממוקם בין PBS / פלזמה בזהירותnd שכבות ficoll בעזרת פיפטה העברה. הימנע מאיסוף שכבת סוכרוז ולא להפריע את שכבת תאי דם האדומה.
9. העבר את המעיל באפי לתוך צינור חרוטי חדש 50 מיליליטר סטרילי. זה עלול לקחת כמה פעמים לחזור על צעד 1.8 לאסוף את כל PBMC.
10. להוסיף PBS pH 7.4 לצינור עם PBMC ולמלא עד הסימן 45 מיליליטר. Shake צינור ביסודיות. לא מערבולת.
11. שטוף 1: צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 480 עם שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9. שימו לב היווצרות של גלולה של PBMCs בחלק התחתון של צינור חרוטי.
12. מחק את PBS (supernatant) לתוך כוס פלסטיק עם 10 מיליליטר של אקונומיקה.
13. שחרר תא גלולה בעדינות על ידי "צוברים" נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). לא מערבולת.
14. להוסיף 25 מיליליטר של pH PBS הטרי 7.4 לצינור. אם צינור אחד או יותר נמצא בתהליך עיבוד, בריכת הכדורים יחד בשלב זה.
15. לשטוף 2: צנטריפוגה צינור דקות 12 ב 480 XG with שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9.
16. מחק את PBS (supernatant) לתוך כוס הפלסטיק עם התזה של אקונומיקה.
17. בעדינות "מדף" נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). לא מערבולת.
18. להוסיף 25 מיליליטר של PBS הטרי הצינור.
    1. להוציא 50 μl של התאים ולהעביר לתוך צינור microcentrifuge לספירת כדאיות.
    2. להוסיף סכום השווה (50 μl) של trypan כחול (כתם כדאיות) ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות.
19. להוציא 10 μl ולהעביר אותו לhemocytometer כדי לבדוק את הכדאיות של תאים לכל מיליליטר. רשום את מספר תאים / מיליליטר.
20. להוציא את הכמות הרצויה של תאים וצנטריפוגות צינור דקות 12 ב 480 XG עם שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9.
21. מחק את PBS (supernatant) לתוך הכוס עם אקונומיקה.
22. בעדינות "מדף" נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). הוסף 80 μl של PBS לתוך הצינור.

2. ביצוע Slide PBMC

1. מניחים 80 μl של התאים לשקופית מיקרוסקופ. למרוח הטיפה בעזרת שקופיות אחרת או להציב 2 טיפות של 40 μl כל בשני הקצוות של השקופית.
2. השאר שקופיות בארון הבטיחות הביולוגית לייבוש. תווית השקופיות עם עיפרון בצד החלבית.

3. תיקון דוגמאות על השקופיות

1. הכן את הפתרון מקבע על ידי הערבוב של 0.5 מיליליטר של פורמלדהיד 37% ל- 4.5 מיליליטר של 99% אתנול.
2. לאחר השקופיות הן יבשות, להוציא 2 מיליליטר של הפתרון מקבע הטרי ושופכים אותו בשקופית, כך שכל פני השטח של השקופית מכוסה.
3. השאר את הפתרון בשקופית 1 דקות. יש לשטוף את שקופית 1 דקות במים ברז ולהשאיר לייבוש באוויר.

4. ביצוע פתרון עמילאז לבקרה שלילית

1. קח 0.25 גרם של אבקת עמילאז ולפזר ב 50 מיליליטר של diמים דוממים. יוצקים את הפתרון בכוס 100 מיליליטר נקייה.
2. לטבול את השקופית בכוס כך שמחצית מהשקופית מקבלת טיפול ואת החצי השני נותר ללא טיפול ולאחר מכן דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (איור 1 ג).
3. רשום באיזה צד של השקופיות מקבל טיפול עמילאז. למתוח קו על הגב של השקופית המציין את הגבול בין הטיפול והשליטה.
4. שטוף את השקופיות עם DDH ₂ O להסיר את פתרון עמילאז ולהשאיר את השקופיות לייבוש באוויר.

.5 בצע תקופתי חומצה שיף (PAS) מכתים והדמיה

הערה: ריאגנטים PAS רעילים על ידי שאיפה ומאכלים, ולכן הצעדים צריכים להיעשות במנדף הכימי, וחומרי הפסולת יש להשליכם כהלכה על פי הנחיות מוסדיות.

1. מניחים את השקף על משטח שטוח ולשפוך 1.50-2.00 מיליליטר של חומצת פתרון התקופתי על המדגם. אינקובטורים לte במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
2. יש לשטוף את השקופיות בכמה אישומים של מים מזוקקים.
3. יוצקים 1.50-2.00 מיליליטר של המגיב של שיף בשקופית ודגירה אותו בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
4. לשטוף את השקופית במים מזוקקים למשך 5 דקות ולהשאיר לייבוש באוויר.
5. החל תקשורת הרכבה 10 μl בשקופית ומכסה בשני coverslips קטן, או להחיל 50 μl ולהשתמש coverslip אחד גדול.
6. החל לק ברור בקצוות של coverslip, בואו לילה יבש.

6. השג תמונות עם משקפת האור מיקרוסקופ באמצעות מטרת 100X

תוצאות

כדי לאמת את חומרים כימיים וטכניקה בסיסית, צביעת PAS בוצעה בהתאם להוראות יצרן על חלקי שריר סולית עכבר. הצביעה נעשתה באותו יום כקורבן ובשלב האחרון של הצביעה, החלקים תוקנו על ידי קסילן. שריר הסוליה ידוע מכיל ~ תאי גליקוגן חיובי 35% ^9. תאי השריר המוכתמים מוצגים שני גרגרי punctate תכונות- PAS-חיובי מובהקים בתוך התא, וקו רציף demarking קרום תא (איור 2 א). הנוכחות של גרגרי punctate עולה בקנה אחד עם מאגרי הגליקוגן, ומשמשת להגדרת תא שריר חיובי. טיפול בדגימות עם ...

דיון

השלבים הקריטיים של מאמר זה וידאו היו במהלך טיפול כביסה ועמילאז של התאים. בזמן שטיפת השקופיות, צעד מפתח השתמש בבקבוק שטיפת סָחִיט פלסטיק ולתת את המים בעדינות להפעיל באמצעות המדגם בשקופית ולא מכוון ישירות על הדגימות. אפילו לחץ המים ישיר הקל היה לגרום לתאים לרדת שקופיות. עוד צעד מפתח היה להשתמש באותה השקופית ל± תנאי עמילאז. לאחר PBMCs דבקה בשקופיות, השקופיות הונחו בזהירות לתוך כוס, כך שרק מחצית מהמריחה נחשפה לפתרון עמילאז. צעד זה מספק שליטה חזקה, כי תאי הדם הם מאותו השקופיות, ובכך לצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכה לצביעת Periodic Acid Schiff	Sigma-Aldrich	395B	להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש. החומרים בערכה זו רעילים ומסוכנים. יש לנקוט משנה זהירות.
α-Amylase מלבלב חזיר	Sigma-Aldrich	A3176
מיקרוסקופ בינוקולרי	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
ערכה לבדיקת גליקוגן	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	פולימר סינתטי לא-יוני של סוכרוז.
צנטריפוגה			לבידוד PBMC, נעשה שימוש בראש דליים נתיבים (swing buckets).