איבר מרוחק איסכמי אכשור קד: טכניקת neuroprotective במכרסמים

Summary

נפשית מראש איסכמי מרחוק (RIP) הוא שיטה של ​​רקמות אוויר נגד לחץ מזיק. הקמנו שיטה של ​​איסכמיה מרחוק בגפיים האחורי, על ידי ניפוח שרוול מד לחץ דם למשך 5-10 דקות. יכולות ההגנה העצביות של RIP הוכחו במודל של ניוון רשתית במכרסמים.

Abstract

איסכמיה sublethal מגנה על רקמות מפני איסכמיה לאחר מכן, חמורה יותר באמצעות גברת הביטוי של מנגנונים אנדוגניים ברקמה הפגועה. איסכמיה sublethal גם הוכחה upregulate מנגנוני הגנה ברקמות מרוחקות. תקופה קצרה של איסכמיה (5-10 דקות) בגפיים האחורי של יונקים גורמת תגובות של הגנה עצמית במוח, הריאות, הלב והרשתית. ההשפעה ידועה כנפשי מראש מרוחק איסכמי (RIP). זוהי דרך טיפולית מבטיחה להגן על איברים חיוניים, וכבר נמצאה בניסויים קליניים לפציעות לב והמוח. פרסום זה מדגים שיטה מבוקרת, פולשנית של קבלת איבר - במיוחד הגפיים האחורי של חולדה - איסכמי. שרוול לחץ דם שפותח לשימוש בילודים אדם מחובר למד לחץ דם ידני ומשמש להפעלת לחץ מ"מ כספית 160 סביב החלק העליון של הגפיים האחורי. בדיקה נועדה לזהות טמפרטורת עור משמשת כדי לוודא ischemi, על ידי הקלטת הירידה בטמפרטורת עור נגרמת על ידי חסימה נגרם לחץ של עורקי הרגל, והעלייה בטמפרטורה העוקבת שחרור של השרוול. שיטה זו של RIP מקנה הגנה לרשתית העכברוש מפני נזק הנגרם על-אור בהיר וניוון.

Introduction

הישרדותם של רוב, אולי כל, רקמות לנוכח לחץ מטבולים ניתן לשפר על ידי אוויר מראש עם תקופה של איסכמיה sublethal ^1,2. נפשית מראש איסכמי (IP) במונחים מעשיים הוא החשיפה של רקמה לאיסכמיה sublethal, לפני חוויות רקמת לחץ חמור יותר, כגון עלבון איסכמי שלאחר מכן. במודלים של בעלי חיים, IP מספק הגנה מדהימה למוח, הרשתית, לב וריאות ^3-6. במקביל, תצפיות בחולי שבץ מוחי הראו קשר בין פיגועים הקודמים איסכמי חולפים ותוצאות קליניות טובות יותר ^7,8. IP גם מגן קולטני האור ברשתית מפציעות שאינן איסכמי ^9.

היעילות של IP ברקמות ופציעות שונות מצביעה על כך שהוא מפעיל מנגנון מולד של תא הישרדות נוכחת בכל הרקמות. נפשית מראש איסכמי של שריר הלב כבר הציע לי השפעות מגנות דרך upregulationשל גורם היפוקסיה מושרה (HIF), ידוע להסדיר רבים מסלולים מטבוליים באמצעות שחרור אדנוזין או באמצעות פתיחת ערוצי אשלגן ATP במיטוכונדריה ^10,11. ערוצי שחרור אדנוזין ואשלגן ATP הם מעורבים באיסכמיה מוחית אבל, חקירות מנגנוני ההגנה העצביות של אוויר איסכמי עד כה התמקדו בשינויים באנטי-הפעלת יתר רעילה, מסלולים אנטי-אפופטוטיים ואנטי דלקתיים ^12,13. בסך הכל, הבנה של התהליך המולקולרי של אוויר להגנה על תאי עצב איסכמי היא מוגבלת.

ניסיונות נפשית מראש איסכמי מרחוק להתנות איברים מרוחקים חשובים ביותר (לב, מוח, ריאות) על ידי יצירת איסכמיה ברקמות פחות קריטיות. נפשית מראש מרחוק איסכמי (RIP) באמצעות הגפיים האחוריות הודגם להיות neuroprotective במודלים של מכרסמים של שבץ ^14-17. השיטה שתוארה על ידי מספקת prot פשוט, אמין ולא פולשניocol גרימת RIP.

הרוב המכריע של פרוטוקולי RIP כרוך הגפיים האחורי, כנראה משום שעורק הירך ממוקם בגפיים האחורי העליונים ניתן לזהות בקלות והגישה להידוק כירורגית ויישום חוסם עורקים. במחקרי איסכמי איבר פולשני לחקר המוח והגנת עור, איסכמיה מושרה על ידי הפרדת עורק הירך מרצועות המפשעה ומהדק את עורק הירך ^2,15,18.

איסכמיה כתוצאה מהידוק עורק או כבילת איבר או הירך אושרה על ידי שינויים באיבר כולל אובדן של דופק, ירידה בחמצון וירידה בטמפרטורת עור. איסכמיה מרחוק יכולה להיות מאושרת על ידי האובדן של דופק באמצעות דופלר לייזר או דופלר אולטרה סאונד ^17-19. טמפרטורת עור יכולה לשמש כחלופה לדופלר למרות מערכת היחסים היא אינו ליניארי ^20,21. הקלטות טמפרטורה מדויקות הן דבר שבשגרה במעבדות ופחיתלהיות משולב בקלות לתוך מחקרי איסכמי מרחוק.

אלטרנטיבה לירך מהדקת ניתוח היא האינדוקציה של איסכמיה באמצעות חוסם עורק. יישום חוסם עורקים מייצר איסכמיה דומה לזה שהושג עם הידוק כלי; Kutchner et al. לעומת עורק הירך פולשנית מהדק לחוסם עורק שאינו פולשני ומצא שני השיטות הופסקו זרימת דם לאיבר ונזק לעור מופחת במודל ניתוח פלסטי של איסכמיה דש עור ^18. איזוק או הרגל או זרוע והעלאת לחץ השרוול לעיל לחץ דם הסיסטולי נמצא להיות מגן מפני נזק איסכמי בחזירים ובני אדם ^17,19,22.

חוסם עורקים גישות שונים לגרימה מרוחקת איסכמי כולל שימוש בשרוול לחץ דם או ^17,22,23 גומייה. עם זאת, השימוש בגומייה כדי לגרום לאיסכמיה הוא שיטה בטוחה, פוטנציאל עלייה נותנת לסכום מוסדר של לחץ באיבר, עם עליות בלחץ מעל 500 מ"מ כספית מוקלט בבני אדם ^24. יתר על כן, איסכמיה האיבר באמצעות גומייה מובילה לנזק לשרירים בחולדות לאחר הסרת הלהקה ^23, כפי שהוערך על ידי אוונס הכחול צבע, סמן vivo של חדירות myofiber ^25. לעומת זאת, משלוח של לחץ מבוקר לחוסם העורק יכול להיות מושגת באמצעות שרוול לחץ דם קשור ^{ל17,19,22,26} מד לחץ דם.

במחקר זה, מודל פציעה קל של ניוון קולטי האור שימש כדי להדגים את היעילות של נוירו נפשית מראש איסכמי מרחוק. איסכמיה מרחוק הייתה מושרה באופן מיידי לפני פציעה קלה, ומנעה ניוון קולטי האור הבא כפי שאושרה על ידי בדיקת תפקוד רשתית. הווידאו הנלווה ידגים את היישום של איסכמיה המרוחקת לא פולשנית.

Protocol

הצהרת אתיקה: הפרוטוקול כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת סידני, AEC # 5657. אלחוש אושר על ידי ועדת אתיקה של בעלי החיים (אוניברסיטת סידני, # AEC 5657).

1. הכנת ציוד

1. להשתמש במעקב טמפרטורת עור בזמן אמת. לעבור על מחשב, וחומרת רכישת נתונים.
2. תוכנת הטמפרטורה להרחיב הקלטה ולהתאים את הגדרת טמפרטורה לבין 30-35 מעלות צלזיוס ותדירות דגימה לכל 100 אלפית שניים.
3. אופציונאלי: מדחום רקטלי הכנס על מנת להבטיח טמפרטורת ליבה נותר יציב ב37.5 מעלות צלזיוס.

2. כיול של המד לחץ הדם הידני

1. חבר שרוול זרוע ילוד לsphygmomanometer.Use גודל 2 שרוול לחולדת 250-550 גר '. מתאם ייתכן שיהיה צורך לחבר את צינורות שרוול למד לחץ הדם.
2. להוציא את האוויר השרוול או על ידי התרופפות שסתום שחרור אוויר או ניתוק צינורות שרוול מלהתאיםאו. להבטיח שאין לחץ נשאר בצינור ואת מחט מד הלחץ מוטלת על אפס בתוך האליפסה / המלבן.
3. בדוק את הלחץ בין צינורות, מד לחץ ושרוול. לנפח את השרוול עם משאבות עדינות של הנורה האינפלציה עד שקורא על מד הלחץ 100 מ"מ כספית. ודא לחץ נשאר קבוע. להוציא את האוויר השרוול ידי פתיחת ערך שחרור האוויר לאט.

3. הכנת בעלי החיים

הערה: בעלי חיים, כי הם לעבור פציעת אור דורשים adaption הכהה בלילה שלפני איסכמיה מרחוק. בעלי חיים עוברים נזק קל דורשים גידול (אור 12 שעות: מחזור כהה (5 סוויטה דה לוקס)) אפל

1. בצע איסכמיה המרוחקת בשני מכרסמים ער או anesthetised. ודא שיש לי חיות טונוס שרירים בריאים. להבטיח זאת על ידי צביטת הגפיים האחורי העליונים כדי לאשר יש הווה שריר נאות. הגנה מושרה RIP מפני פגיעת אור נבדקה בחולדות בישיבה עד גיל 6 חודשים.
2. הכנת anesthetised לRIP
   1. הזרק חולדות עם זריקת intraperitoneal של 60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -5 מ"ג / קילוגרם xylazine. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הרחבת הרגל וצובט את העור בחלק התחתון של כף הרגל. יש בעלי החיים לא רפלקס אם הוא anesthetised עמוק. החל דמעות מלאכותיות כדי למנוע יובש בקרנית תוך תחת הרדמה.
   2. מניחים חולדות בשתי כרית חום או במחזור צינורות דוד כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה של 37.5 מעלות צלזיוס. מקם את העכברוש במצב שכיבה עם כריות כף הרגל של הגפיים התחתונים פונות כלפי מעלה. ימין או שמאל האיבר עשוי לעבור איסכמיה מרחוק.
3. הכנה ערה לRIP
   הערה: ער ניסויים בבעלי החיים דורשים שני אנשים. אדם אחד מרסן את החיה והאדם השני מפעיל את מד לחץ דם הידני. הנסיינים חייבים להיות בטוחים כדי לבצע את ההליך כאיפוק מעלה את הסיכון לפגיעה במפעילים. החולדות שעברו איסכמיה מרחוק חייבת להיות מותנות to איפוק במדריך. בהתאם להנחיות האינטואיטיבית איפוק במדריך צריך להיות התקדמות מ 30 שניות עד למקסימום של 5 דקות על פני מספר השבועות. בעלי חיים ביישנים שלא מצליחים להסתגל לריסון ספר צריכים להיות מחוץ ניסויים ער. לבסוף, איפוק ידני עשוי לגרום ללחץ (ואפשרות להציג את בלבול למחקר) לבעלי חיים ומחזור דמה (מיקום של שרוול ללא דלקת) יש להשתמש כדי לפרש במדויק תוצאות מחקר RIP.
   1. חותך מגבת לתוך 15 סנטימטרים x 30-50 סנטימטר ומניח חתיכת הקצה הקצר בניצב לעמוד השדרה של החולדה, כיסוי הראש לראש הגפיים האחורי.
   2. לתחוב את הקצה הקצר מתחת לגופו של העכברוש בחוזקה ומתחיל לעטוף את העכברוש עם הקצה הארוך הנותר של מגבת. אבטח את בעלי החיים עטופים תחת הזרוע במצב שכיבה. אם החולדה מוחזקת ביד השמאל, לשחרר את האיבר תקין של החולדה מהמגבת.

o 4. יישוםבדיקה טמפרטורת עור F

1. הארך את הרגל של העכברוש שהוא לעבור איסכמיה ולמקם את הבדיקה העור על השודד. מקם את הבדיקה העור למקסם את הקשר בין הבדיקה הטמפרטורה והעור. בתוקף לדחוף את החללית לשודדת הדרכים ולהדביק את החללית עם קלטת נייר.
2. בדוק את מיקום הבדיקה עור על ידי מעקב הטמפרטורה בתוכנת הקלטת טמפרטורה. ודא שטמפרטורת העור היא בין 30-34 מעלות צלזיוס ונשארה יציב. עקוב אחר טמפרטורת העור במשך 1-2 דקות. התאם את הבדיקה העור אם הטמפרטורה היא יציבה או מתחת ל -30 מעלות צלזיוס.

5. איסכמיה מרחוק

1. להוציא את האוויר השרוול ולהבטיח את שסתום לחץ האוויר סגור. הארך את הרגל ורופפת להקיף את השרוול על הגפיים האחורי העליונים. השתמש באצבע והאגודל להאריך את הרגל ואת הספרות נמוכה יותר כדי לשמור על השרוול הרופף בעמדה.
2. להעלות את לחץ השרוול של החיה anesthetised 160 מ"מ כספית, ובחיות ערה increASE לחץ השרוול 180 מ"מ כספית.
   הערה: לחץ דם anesthetised של חולדות נע 120-140 מ"מ כספית ועולה ל 160 מ"מ כספית כאשר מודע. להתחיל הקלטות טיימר וטמפרטורת רגל פעם אחת הוא הגיע בלחץ הנכון.
   הערה: טמפרטורת הרגל צריכה לרדת ב -2 מעלות צלזיוס לאחר 5 דקות של לחץ מתמיד.
3. לשמור על המיקום של השרוול מעל "הברך" של בעלי החיים ברחבי איסכמיה. לחץ השרוול יתחיל לרדת לאחר כמה דקות, או אם האיבר של החולדה נע.
4. שוב ושוב לשאוב את הנורה האינפלציה בפרצים קצרים כדי לשמור על צרור קצר החוזר ונשנה לחץ שרוול הרצוי של שאיבה
5. איסכמיה מרחוק יכולה להיות מועברת ברציפות בין 5 ל 15 דקות. פרוטוקול reperfusion איסכמיה כולל 2 תקופות של 5 דקות עם איסכמיה reperfusion 5 דקות חלף.
6. להוציא את האוויר בלחץ השרוול על ידי שחרור שסתום לחץ האוויר. בדוק את שינוי הטמפרטורה במהלך פרו איסכמיהtocol. שחרר את השרוול.
7. תמשיך עם ניסויים פציעה. בעלי חיים תחת השפעת ההרדמה יצטרכו להיות ממוקמים על משטח חום. תמשיך לעקוב אחר בעלי חיים עד אמבולטורי. לא ניתן להחזיר בעלי חיים לדיור עד הליכה.

6. אור פגיעה - רשתית ניוון דגם

1. Dark להתאים את החיות הלילה (שעות 12-15). מייד לאחר איסכמיה אוויר מרוחק או איסכמיה דמה מרחוק (ריסון בעלי חיים) בעלי חיים במקום דיור פרספקס עם מזון ומים.
2. לעבור על תאורת ניאון (1,000 לוקס) ממוקמת מעל דיור פרספקס שעה 9 בבוקר ל -24 שעות. בעקבות חשיפה לאור, להחזיר את בעלי החיים ללעמעם תאורה מחזורית למשך 7 ימים.

נהלי איסכמיה 7. לאחר מרחוק

1. הערכת חזון עם electroretinogram (ERG):
   הערה: הגדרת ERG ובזק פרוטוקול אחרי ברנדלי ואבן ^26.
   1. Dark להסתגל חיות לילה (12-15 שעות). תחתלעמעם תאורה אדומה להרדים בעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal של קטמין ו xylazine (60 מ"ג / קילוגרם ו 5 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה). Mydriatic (סולפט אטרופין 1.0%), הרדמה קרנית (proxymetacaine 0.5%).
   2. החל לחות קרנית העין (פולימר קרבומר) יורדת באופן מיידי לקרנית. החל ג'ל עיניים ב 20 דקות במרווחים לשמור על הידרציה קרנית.
   3. לצייר חוט קשור ברפיון סביב גלגל העין כדי לסייע הקלטות ERG יציבים. צג טמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים ב37-37.5 מעלות צלזיוס.
   4. מקם את הראש בתוך תחום שילוב Ganzfeld.
      הערה: Ganzfeld הוא גירוי אור לתכנות מלא, המספק הבזקים כהוא אחידים מנוריות לעין.
   5. רשום את electroretinogram באמצעות אלקטרודה מחוייט פלטינה 4 מ"מ חיובית נוגעת קלות הקרנית וקוטר 2 מ"מ אלקטרודה גלולה Ag / AgCl מוכנס לתוך הפה. התייחסות הן לאלקטרודות מחט נירוסטההוכנס מתחת לעור לתוך העכוז.
   6. שיא אותות עם הגדרת להקה עוברת מ0.3-1,000 הרץ (-3 dB), עם רכישה בשיעור 2 קילוהרץ (מכשירים לספירה). לאחר הקלטת ERG יציבה הוקמה נושא בעלי החיים להסתגלות כהה 10 דקות לפני תחילת הקלטות.
   7. בצע את פרוטוקול הבזק כפי שתואר בעבר על ידי ברנדלי ואבן ^26.
      1. לתכנת את משך הבזק (השתמשנו הבזקים 1-2 אלפית שני בזמן), ולהגדיר את עוצמתו ל-4.4 ל -2.0 יומן סקוטי cd.sm ^-2. השתמש הבזקים בהירים (cd.sm 2.0 יומן הסקוטי ^-2, 1 ms) כדי למדוד את תפקוד הרשתית. במחקר זה היא ההשוואה בין שליטה, פציעה קלה ופציעה קלה עם RIP.

8. TUNEL Assay

1. להרדים בעלי חיים על ידי זריקת intraperitoneal של מנת יתר phenobarbital (100 מ"ג / קילוגרם). Enucleate העיניים ולתקן paraformaldehyde 4%.
2. לשטוף את העיניים בPBS לפני cyroprotectingעיני הלילה ב -30% סוכרוז (w / v). להטביע את העיניים במתחם OCT וחתוך למקטעים של 20 מיקרומטר sagittal באמצעות cryostat.
3. בצע את assay TUNEL על סעיפי רשתית עם מכתים DAPI הבא הפרוטוקול של et al Maslim. ²⁷
4. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספירת TUNEL של הרשתית. תאי TUNEL נרשמו מהשכבה החיצונית הגרעינית (ONL); השכבה החיצונית ביותר של הרשתית המכילה גרעיני קולטי האור. במחקר זה, ספירת TUNEL נעשתה בשלושה עותקים לכל עין, עם 5 עיניים לכל קבוצת טיפול.
5. השתמשו בכיוון אחד ANOVA לקבוצה סטטיסטית להשוות אמצעי שליטה, פציעה קלה, וחולדות פציעה + RIP אור.

Results

שרוול לחץ דם גבוה למעל 160 מ"מ כספית עוצר את זרימת דם לגפיים האחורי כפי שניתן לראות בבירור באיור 1. חוסר חמצון רקמות הביא הפחתת טמפרטורת הרגל של בעל החיים לפרוטוקול איסכמיה reperfusion (איור 2). טמפרטורת הרגל (33 מעלות צלזיוס) הייתה נמוכה מטמפרטורת ליבה ומופחתת באופן מהימן בגובה שרוול לחץ (31 מעלות צלזיוס) עולה כאשר השרוול היה מנוכה (32 מעלות צלזיוס). אחת פציעת אור 1,000 סוויטה דה לוקס נמסרה לעמעם העלתה חולדות לבקן עם או בלי נפשית מראש איסכמי מרחו...

Discussion

איסכמיה גפיים אחוריות מכרסמים הייתה מושרה בהצלחה עם מד לחץ דם ידני ולאזוק את אספקת neuroprotection לקולטני האור ברשתית. ממצא עקבי עם הגנת אוויר מושרה איסכמי של קולטני האור מפגיעת אור ^9,28.

בעיקרו של דבר, איסכמיה מרחוק גורמת מחסור בחמצן לרקמות קצר. לפיכך, יש נפשית מראש איסכמי מרוחק דמיון רב לאוויר איסכמי או סובלנות איסכמי מכונה לחלופין, נפשית מראש חוסר חמצן, ובמידה מסוימת, פעילות אנאירובית. תאים מגיבים ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סדרת זהב DuraShock מד לחץ דם אנרואיד	יד Welch Allyn	DS56	מד לחץ דם ידני
יילוד [גודל 2] 1 צינור, 10 חבילות	Welch Allyn	5082-102-1	שרוול לחץ דם לגפיים
מתאם נעילת Luer	Welch Allyn	5082-178	מתאם לשרוול ילודים
תרמיסטור תרמיסטור AD	מכשירים	ML 309	יחידת טמפרטורת עור
בדיקת טמפרטורת עור	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, חומרת רכישה 4 ערוצים	AD Instruments	PL 35044
מערכת שמיכות הומותרמית עם בדיקה גמישה	Harvard Appartus	507222F
מגבת			אופציונלית: איסכמיה מרחוק ער
איזופלו - 100% איזופלורן (250 מ"ל)	Abbot Animal Health	05260-05	אופציונלי: איסכמיה מרחוק הרדמה אינהלטיון
קטמיל - קטמין 100 מ"ג/מ"ל (50 מ"ל)	Troy Laboratories Pty Ltd		אופציונלי: איסכמיה מרחוק הרדמה להזרקה
קסיליום - קסילזין 100 מ"ג/מ"ל (50 מ"ל)	Troy Laboratories Pty Ltd		אופציונלי: איסכמיה מרחוק הרדמה להזרקה