אנו מתארים אמצעי למדידה מהירה ופשוטה של יכולת פיזור הריאות בעכברים ומראים שהוא רגיש מספיק לשינויים פנוטיפיים בפתולוגיות ריאה נפוצות מרובות. מדד זה מביא אפוא רלוונטיות תרגומית ישירה למודלים של העכברים, מכיוון שיכולת פיזור נמדדת בקלות גם בבני אדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פונקצית phenotyping עכבר ריאתי In vivo עם קיבולת הריאות לשדר
במאמר זה
סיכום
תקציר
העכבר הוא עכשיו בעלי החיים העיקריים המשמשים למודל מגוון של מחלות ריאה. כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס פתולוגיות כגון, יש צורך בשיטות פנוטיפי שיכול לכמת את השינויים פתולוגיים. יתר על כן, על מנת לספק את הרלוונטיות translational למודלים של העכברים, מדידות מסוג זה צריכה להיות בדיקות שיכולים להיעשות בקלות בבני האדם ועכברים. למרבה הצער, בספרות בהווה יש לי כמה מדידות פנוטיפי של תפקוד ריאות יישום ישיר לבני אדם. חריג היחיד הוא היכולת לשדר לפחמן חד חמצני, שהוא מדידה שנעשית באופן שיגרתי בבני אדם. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים אמצעים למדידת יכולת לשדר את זה בעכברים במהירות ובפשטות. ההליך כרוך אינפלציה קצרה ריאות עם גזים נותב בעכבר הרדים, ואחרי זמן ניתוח גז 1 דקות. בדקנו את היכולת של שיטה זו כדי לזהות כמה פתולוגיות ריאה, כולל אמפיזמה, סיסטיק, פציעת ריאות חריפה, ושפעת וזיהומים פטרייתיים ריאות, כמו גם התבגרות ריאה ניטור בגורים צעירים. תוצאות מראות ירידה משמעותית בכל פתולוגיות הריאות, כמו גם עלייה ביכולת לשדר עם התבגרות ריאה. מדידה זו של קיבולת לשדר ריאות ובכך מספקת בדיקת תפקוד ריאתי שיש לו בקשה רחבה עם היכולת שלה לזהות שינויים מבניים פנוטיפי עם רוב דגמי ריאות פתולוגיים הקיימים.
מבוא
העכבר הוא עכשיו בעלי החיים העיקריים המשמשים למודל מגוון של מחלות ריאה. כדי לחקור את המנגנונים שנמצאים בבסיס פתולוגיות כגון, יש צורך בשיטות פנוטיפי שיכול לכמת את זה שינויים פתולוגיים. למרות שיש מחקרים רבים שבם עכבר מכניקת אוורור נמדדות, מדידות אלה הן בדרך כלל אינן קשורות להערכות סטנדרטי של תפקוד הריאתי נעשו בדרך כלל בבני אדם. זה מצער, שכן היכולת לבצע מדידות מקבילות בעכברים ובני אדם עשוי להקל על התרגום של תוצאות במודלים של עכברים למחלות בבני אדם.
אחת המדידות הנפוצות ביותר ונעשו בקלות בבני אדם הוא היכולת לשדר לפחמן חד חמצני (DLCO) 1,2, אך מדידה זו כמעט ולא נעשתה רק במודלים של עכברים. באותם מחקרים שבם זה כבר דווח 3-7, לא חלו מחקרי מעקב, בין שאר משום שהנהלים הם לעתים קרובות מסורבלים או עשוי require ציוד מורכב. גישה נוספת היא להשתמש בשיטה CO rebreathing במערכת במצב יציבה, שבו יש את היתרון של להיות מסוגל למדוד דיפוזיה CO בעכברים מודעים. עם זאת שיטה זו היא מסורבלת מאוד, ותוצאות יכולות להשתנות עם רמת האוורור של העכבר כמו גם O 2 ו- CO 2 ריכוזים 8,9. קשיים אלה נראים שמנעו שימוש שיגרתי בלשדר יכולת לזהות פתולוגיות ריאות בעכברים, למרות כמה יתרונות משלה.
כדי לעקוף בעיות עם מדידה של קיבולת לשדר בעכברים, פרטים של אמצעים פשוטים למדוד את זה בעכברים כבר דיווח לאחרונה 10. ההליך מבטל את הבעיה הקשה של דגימת גז alveolar שאינו נגוע בדגימת נפח שווה לגז ההשראה כל מהירות. תוצאות הליך זה במדידה מאוד לשחזור, כינו את גורם דיפוזיה לפחמן חד חמצני (DFCO), כי הוא רגיש למארח של הרשות הפלסטיניתשינויי thologic בפנוטיפ הריאות. DFCO מחושב כך כ1 - (CO 9 / CO ג) / (Ne 9 / Ne ג), שבו ג ו9 התחתיים מתייחסים לריכוזים של גזי הכיול המוזרקים והגזים הוסרו לאחר זמן לעצור את נשימת 9 שניות, בהתאמה. DFCO הוא משתנה ממדים, אשר משתנה בין 0 ל -1, כאשר 1 משקף ספיגה של כל CO מלא, ומשקפים 0 אין ספיגה של CO.
במצגת זו אנו מראים כיצד לבצע מדידת קיבולת לשדר זה, וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לתעד שינויים כמעט בכל האחד מהמודלים הקיימים ריאות עכבר המחלה, כולל אמפיזמה, ציסטיק, פציעת ריאות חריפה, וזיהומים נגיפיים ופטריות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג'ונס הופקינס.
1. הכנת בעלי החיים
- הכן עכברי 6 C57BL / 6 שליטה למדידת DFCO, על ידי הרדמתם עם קטמין וxylazine כפי שמתוארת בשלב 2.3 להלן.
- הכן את כל עכברים האחרים עם פתולוגיות ריאות השונות מוצגות בטבלה 1 על ידי שימוש באותו הליך כלבקרה. פרטים ספציפיים הנחוצים להקמה כל אחד ממודלים אלה נמצאים באזכור הרלוונטי. עכברי בקרה ואלה בקבוצות פתולוגיים האחרות הם כל 6-12 השבועות של גיל.
2. מדידה של פקטור Diffusion לפחמן חד חמצני (DFCO)
- להגדיר את מודול כרומטוגרף גז המסופק עם המכשיר למדידת פסגות לחנקן, חמצן, ניאון, ופחמן חד חמצני. לשימוש ביישום זה רק את נתוני הניאון וCO.
הערה: מכשיר זה משתמש בs מולקולריתטור ieve עם הליום כגז מוביל, עם 12.00 מיקרומטר סרט, מזהה מיקרומטר 320.00 ו -10 מ 'אורך. יש עמודת כרומטוגרף נפח של 0.8 מיליליטר, אבל השתמשנו 2 מיליליטר כדי להבטיח סליקה נאותה של צינורות חיבור עם המדגם. - בתחילתו של כל יום ניסיוני, לפני ביצוע מדידות של דגימות מהעכברים, לקחת דגימת 2 מיליליטר ישירות משקית תערובת גז המכילה כ -0.5% Ne, CO 0.5%, ולאזן אוויר, ולהשתמש במדגם זה לכייל גז כרומטוגרף.
- הרדימי עכברים עם קטמין (90 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (15 מ"ג / קילוגרם), ולאשר הרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס. החל משחה טרינריים המשפיעה על העיניים כדי למנוע יובש. Tracheostomize עכברים עם צינורית מחט בדל (18 G במבוגרים או 20 G בעכברים צעירים מאוד).
הערה: DFCO הושלם בתוך פחות מ -10 דקות לאחר הרדמה ולפני כל הנשמה מלאכותית או הליכים אחרים. - בעכברים יותר מ -6 שבועות של גיל, השתמש t מזרק 3 מיליליטרo לסגת 0.8 מיליליטר של גז משקית תערובת גז. חבר את המזרק לצינורית לקנה הנשימה ולנפח את הריאות במהירות. שימוש במטרונום, לספור 9 שניות, ולאחר מכן במהירות למשוך את 0.8 מיליליטר (אוויר ננשף).
- לדלל 0.8 מיליליטר למשיכה זו נשף אוויר עד 2 מיליליטר עם אוויר חדר, לאפשר לו לנוח לפחות 15 שניות. אז להזריק את כל המדגם לגז כרומטוגרף לניתוח.
- תוך ניתוח מדגם DFCO הראשון, לנפח את ריאות עכבר עם 0.8 מיליליטר שני משקית תערובת גז, ולאחר מכן לעבד מדגם זה זהה למדגם הראשון. ממוצע שתי מדידות DFCO.
הערה: למדידות בעכברים צעירים כמו 2 שבועות של גיל, השתמש בהיקף של 0.4 מיליליטר, מאז 0.8 מיליליטר גדול מדי נפח לבצע מדידות בריאות של עכברים צעירים מאוד. עדיף להשתמש בנפח 0.8 מיליליטר לעכברים מבוגרים מ -6 שבועות, ושאם יש צורך בנפח 0.4 מ"ל לכמה עכברים, יש להשתמש בו באופן עקבי לכל העכברים בקבוצה הנחקרים. - לחשב DFCOכ1 - (CO 9 / CO ג) / (Ne 9 ג / Ne), שבו subscripts ג ו9 מתייחס לריכוזים של גזי הכיול המוזרקים והגזים הוסרו לאחר זמן לעצור את נשימת 9 שניות, בהתאמה.
- לנתח ולהשוות הבדלים עם ANOVA חד-כיווני ולהעריך את הרמה מובהקת עם התיקון של Tukey להשוואות מרובות בכל עכברי העוקבה. שקול p <0.05 ערך משמעותי כ.
הערה: כל העכברים משמשים כאן היה חלק ממחקרי ניסויים מעורבים מספר מדידות עוקבות של אוורור ריאות, מכניקה, שטיפת ריאות, או היסטולוגיה, אשר אינן מדווחות כאן. בנוסף, מאז השיטה היא זהה בכל הדגמים הניסיוניים כפי שנעשה לעיל בעכברי השליטה, רק התוצאות מדגמי פתולוגיים השונים מוצגות. מידע נוסף על דגמים אלה מוצג בטבלה משלימה. - להרדים בעלי החיים על ידי anesthe העמוקמנת יתר של טיקים ואחריו נקע או עריפת ראש צוואר רחם. במידת צורך, להסיר את תאי ריאה ו / או רקמות מהעכברים המתים עבור ביולוגי נוספים או עיבוד היסטולוגית וניתוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג את מדידות DFCO מהעכברים הבוגרים בקבוצות A, B, C, D, E, ופ היו ירידה משמעותית בשני זיהומי אספרגילוס ושפעת, כמו גם לירידה משמעותית בfibrotic, emphysematous, ואקוטי מודלים פציעת ריאות. איור 2 מראה את השינויים בקבוצה G התפתחותיים בDFCO לאורך זמן כמו עכברים מגיל 2-6 שבועות. יש עלייה קלה אך משמעותית עם התפתחות ריאות על מהלך הזמן הזה. ההשפעה של שימוש קטן יותר בנפח אינפלציה גם הייתה די ברורה בנקודת הזמן 6 השבוע. הייתה נטייה לנקבות יש DFCO מעט ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעבודה הנוכחית, שהגדרנו מדד חדש לכמת את יכולת גז החלפה של ריאות העכבר. מדד זה מקביל ליכולת לשדר, מדידה קלינית נפוצה המודדת את התפקיד העיקרי של הריאות, כלומר, יכולתו להחליף גז. היכולת לשדר היא מדידת הריאות רק פונקציונלית, כי יכול לעשות זאת בקלות ובמהירות בשני עכברים ובני אדם. לגילוי מחלת ריאות בעכברים, מטרה העיקרית היא לכמת שינויים בתפקוד ריאות בין השליטה וחברים ניסיוניים. כדי להשיג מטרה זו, יש לנו מוגדר ונצלו את DFCO להפגין את יכולתה של quanitfying שינויים פנוטיפי ברוב הדגמים הנפו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים, ומה למסור.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH HL-10342
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כרומטוגרף גז | Inficon | Micro GC דגם 3000A | Agilent מייצר דגם דומה |
| 18 G Luer מחט בדל | בקטון דיקנסון | מספר ספקים אפשריים אחרים | |
| מזרק פלסטיק 3 מ"ל | בקטון דיקנסון | מספר ספקים אפשריים אחרים | |
| שקיות דגימת גז פוליפרופילן | SKC | 1 או 2 ליטר עובדת היטב | שקיות אטומות אחרות לגז יעבדו היטב |
| מיכל גז, 0.3% Ne, 0.3% CO, אוויר מאזן; (מידה ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | זוהי התערובת הסטנדרטית המשמשת ל-DLCO בבני אדם |
| 25 TCID50/עכבר של נגיף השפעת A/PR8 מדולל במי מלח חוצצים פוספט. | |||
| אלסטין אלסטין בלבלב חזיר | , אוונסוויל, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μ גרם/גרם משקל גוף; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (מבודד Af293) קונידיות נאספו ממושבות בוגרות שגדלו על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה. |
מקורות
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299(2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
