מקרופאגים הם תאי המפתח המעורבים בפתוגניות של המארח. מקרופאגים מציגים מגוון פנוטיפי ותפקודי שניתן לנתח ולזהות על ידי ניתוח פרוטאומי. מאמר זה מתאר כיצד לבצע אלקטרופורזה דו-ממדית של תרביות ראשוניות של מקרופאגים אנושיים המובחנים לפנוטיפ M1 או M2.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטרה של פרוטוקול האלקטרופורזה הדו-ממדי (2D) המתואר כאן היא להראות כיצד לנתח את הפנוטיפ של מקרופאגים מתורבתים אנושיים. תפקיד המפתח של מקרופאגים הוכח בהפרעות פתולוגיות שונות כגון מחלות דלקתיות, אימונולוגיות וזיהומיות. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בתרביות ראשוניות של מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים שניתן להתמיין לפנוטיפ M1 (פרו-דלקתי) או M2 (אנטי דלקתי). מודל מבחנה זה אמין לחקר הפעילות הביולוגית של מקרופאגים M1 ו-M2 וגם לגישה פרוטאומית. טכניקות פרוטאומיות שימושיות להשוואת הפנוטיפ וההתנהגות של מקרופאגים M1 ו-M2 במהלך פתוגניות המארח. אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי היא טכניקה פרוטאומית רבת עוצמה למיפוי מספר רב של חלבונים או פוליפפטידים בו זמנית. אנו מתארים את הפרוטוקול של אלקטרופורזה דו-ממדית באמצעות צבעים פלואורסצנטיים, הנקראים אלקטרופורזה של ג'ל דיפרנציאלי דו-ממדי (DIGE). חלבוני המקרופאגים M1 ו-M2 מסומנים בצבעי ציאנין לפני ההפרדה על ידי מיקוד איזואלקטרי, על פי הנקודה האיזואלקטרית שלהם בממד הראשון, והמסה המולקולרית שלהם, בממד השני. לאחר מכן משתמשים בחלבון או כתמים פוליפפטידיים מופרדים כדי לזהות הבדלים ברמות ביטוי החלבון או הפוליפפטיד. הגישות הפרוטאומיות המתוארות כאן מאפשרות לחקור את השינויים בחלבון המקרופאגים הקשורים להפרעות שונות כמו פתוגניות מארח או רעלנים מיקרוביאליים.
מבוא
המקרופאגים הם תאים הטרוגנית ופלסטיק כי הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים פונקציונליים שונים. בחי, תאים אלה מגיבים למגוון רחב של signalssuch הסביבתי מיקרו מוצרים של חיידקים, ציטוקינים, וכו '. 1. במבחנה, פנוטיפ פרו-הדלקתי (M1) של מקרופאג יכול להיגרם על ידי lipopolysaccharide (LPS) ואת הפנוטיפ אנטי דלקתי (M2) על ידי כמה ציטוקינים כגון אינטרלוקין 4 (IL-4). יתר על כן, מקרופאגים יכולים לעבור מM1 הופעל לפנוטיפ M2, ולחלופין, על אותות ספציפיים 2.
בהתאם לפנוטיפ, יהיו לי מקרופאגים פונקציות שונות. מקרופאגים M1 הם תאים המייצרים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות של ועדת האתיקה המחקרית שלנו מוסדות האנושית. מעיל באפי מתורמים אנושיים בריאים התקבל ממרכז עירוי הדם האזורי (Lille, צרפת). דגימות שהתקבלו ממעיילי האפים מוכרזות כאוסף INSERM (N ° DC2010-1209).
1. חומר ותרבות מדיה הכנה
- לדלל 10x פוספט הצפת מלוח (PBS) במים מזוקקים סטריליים כדי להשיג PBS 1x.
- הפוך 1640 בינוני RPMI בתוספת גנטמיצין (40 מיקרוגרם / מיליליטר) ו- L-גלוטמין (2 מ"מ), עם ובלי 10% בסרום אנושי ויקוו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לבצע ניתוח proteomic ההפרש מתאים, העיבוד של דגימות כדי להיות מנותחות צריך להיות מאומת.
בדוגמא המוצגת, איכות תרבית תאים של מקרופאגים נדרש להיבטים מורפולוגיים ומולקולריים כפי שפורסמה בעבר 5. הבידול של מונוציטים למקרופאגים ואת ההומוגניות של התרבות בעקבות שלב מיקרוסקופ. איור 1 הראה דוגמא של תרבויות העיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2. כפי שניתן לראות, אנו מאמתים את ההומוגניות של M1 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מפרט שיטות כדי לנתח את ההשפעה של גירויים שונים משני תת הסוגים של מקרופאגים, M1 (פרו-דלקתי) ו- M2 (אנטי דלקתי). תרבויות עיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2 התקבלו מההתמיינות של מונוציטים כפי שפורסמו בעבר 7.
ההליך של ג'ל אלקטרופורזה 2D DIGE דורש חומרים מיוחדים וציוד, כגון תא IEF לצלחות isoelectrofocusing, נמוכה הקרינה לSDS-PAGE כדי לסרוק פעמיים את הג'ל על עירור / אורך גל פליטה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים מוצהר.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי Inserm. מריון בובה היא עמיתה במשרד המחקר והטכנולוגיה הצרפתי. אנני טורקיה היא עמיתה שהוענקה על ידי האיחוד האירופי FP7 HOMAGE (305507).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| סרום אנושי | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| צלחת 6 בארות PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | מחקר אורגני | 3.00E+01 | |
| מסנן 0.22 ומיקרו; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 מ"ל צילינדר | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| מגיב ברדפורד | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive color | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| רצועת IPG 3-10 24 ס"מ | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| אגרוז נמס נמוך | Invitrogen | 15517-014 | |
| מערכת Ettan-Daltsix | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager סורק | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | דינמיקה לא ליניארית | ||
| צינורות 50 מ"ל | כל ספק | n/a | |
| צינורות 15 מ"ל | כל ספק | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| שלך; e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| ברומופנול כחול | סיגמא-אולדריץ' | 114391 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ' | G6279 | |
| אקרילאמיד 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| גליצין | סיגמא-אולדריץ' | G7126 | |
| עמום ומעומעם; תילפורממיד | סיגמא-אולדריץ' | 22705-6 | |
| פתילי אלקטרודה | Bio-Rad | 165-4071 |
מקורות
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
