מקרופאגים הם תאי המפתח המעורבים בפתוגניות של המארח. מקרופאגים מציגים מגוון פנוטיפי ותפקודי שניתן לנתח ולזהות על ידי ניתוח פרוטאומי. מאמר זה מתאר כיצד לבצע אלקטרופורזה דו-ממדית של תרביות ראשוניות של מקרופאגים אנושיים המובחנים לפנוטיפ M1 או M2.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטרה של פרוטוקול האלקטרופורזה הדו-ממדי (2D) המתואר כאן היא להראות כיצד לנתח את הפנוטיפ של מקרופאגים מתורבתים אנושיים. תפקיד המפתח של מקרופאגים הוכח בהפרעות פתולוגיות שונות כגון מחלות דלקתיות, אימונולוגיות וזיהומיות. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בתרביות ראשוניות של מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים שניתן להתמיין לפנוטיפ M1 (פרו-דלקתי) או M2 (אנטי דלקתי). מודל מבחנה זה אמין לחקר הפעילות הביולוגית של מקרופאגים M1 ו-M2 וגם לגישה פרוטאומית. טכניקות פרוטאומיות שימושיות להשוואת הפנוטיפ וההתנהגות של מקרופאגים M1 ו-M2 במהלך פתוגניות המארח. אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי היא טכניקה פרוטאומית רבת עוצמה למיפוי מספר רב של חלבונים או פוליפפטידים בו זמנית. אנו מתארים את הפרוטוקול של אלקטרופורזה דו-ממדית באמצעות צבעים פלואורסצנטיים, הנקראים אלקטרופורזה של ג'ל דיפרנציאלי דו-ממדי (DIGE). חלבוני המקרופאגים M1 ו-M2 מסומנים בצבעי ציאנין לפני ההפרדה על ידי מיקוד איזואלקטרי, על פי הנקודה האיזואלקטרית שלהם בממד הראשון, והמסה המולקולרית שלהם, בממד השני. לאחר מכן משתמשים בחלבון או כתמים פוליפפטידיים מופרדים כדי לזהות הבדלים ברמות ביטוי החלבון או הפוליפפטיד. הגישות הפרוטאומיות המתוארות כאן מאפשרות לחקור את השינויים בחלבון המקרופאגים הקשורים להפרעות שונות כמו פתוגניות מארח או רעלנים מיקרוביאליים.
מבוא
המקרופאגים הם תאים הטרוגנית ופלסטיק כי הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים פונקציונליים שונים. בחי, תאים אלה מגיבים למגוון רחב של signalssuch הסביבתי מיקרו מוצרים של חיידקים, ציטוקינים, וכו '. 1. במבחנה, פנוטיפ פרו-הדלקתי (M1) של מקרופאג יכול להיגרם על ידי lipopolysaccharide (LPS) ואת הפנוטיפ אנטי דלקתי (M2) על ידי כמה ציטוקינים כגון אינטרלוקין 4 (IL-4). יתר על כן, מקרופאגים יכולים לעבור מM1 הופעל לפנוטיפ M2, ולחלופין, על אותות ספציפיים 2.
בהתאם לפנוטיפ, יהיו לי מקרופאגים פונקציות שונות. מקרופאגים M1 הם תאים המייצרים ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון α גורם נמק גידול (TNF-α), להרוג מיקרואורגניזמים או תאי גידול 3. בניגוד לכך, מקרופאגים M2 למנוע תגובה הדלקתית אלה כמו בריפוי פצעים וסיסטיק על ידי ייצור אנטי-inflammatorגורמי y כגון TGF-β 3,4.
תאי הדם היקפיים mononuclear אדם מתורמים בריאים בודדו על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll כפי שתואר לעיל 5 תוך שימוש בטכניקה שהותאמה מBoyum 6. המקרופאגים בתרבות יכולים להיות מובחנים לפנוטיפ M1 או M2 לאחר 6 ימים של התרבות העיקרית 7.
ניתוח של ביטוי חלבון או חלבון שינויים בין שני תת הסוגים של מקרופאגים תחת גירויים מבוקרים שונים, כגון פתוגניות מארח או רעלנים של חיידקים, יהיה מועיל כדי לפענח את הפונקציונליות של פרו ומקרופאגים אנטי דלקתיים.
פרוטאומיקה הן כלים ייחודיים לניטור ישיר של חלבונים כי הם במיוחד למעלה או למטה מוסדרים במקרופאגים התרבותיים האנושיים תחת גירויים שונים. צבעי ניאון פתרו חלק מהמגבלות של ג'ל אלקטרופורזה 2D, כמו רגישות נמוכה וניתוח תמונה 8 < / Sup>. הצבעים מגיבים עם שאריות ציסטאין הגדילו את רגישות זיהוי בהשוואה לאלו מגיבים עם שאריות ליזין 9. במחקר קודם, שהראינו את התועלת של תיוג רוויה DIGE לניתוח דגימות נדירות 10 בהשוואה לאלקטרופורזה מוכתמת הכסף הקלאסי 2D 11. טכנולוגיה זו שימושית במהירות ניתוח שינויי חלבון בין שני תת הסוגים של מקרופאגים או בין מקרופאגים שלא טופלו ומטופל מאותו תת-הסוג.
היתרונות של טכניקת proteomic זה שיש גישה למידע של גודל חלבון ולאחר translational שינויים על ידי ניתוח ג'ל 2D 12. יש לקחת בחשבון שזה לא טכניקת תפוקה גבוהה, המגביל את מספר הדגימות שניתן לנתח. הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהים המבוססים על ספקטרומטר מסה כפי שנסקר לאחרונה 13 יכולים לשפר את זה.
_content "> כאן אנו מציגים כיצד לבצע ניתוח 2D DIGE ממיצוי החלבון של מקרופאגים התרבותיים באמצעות התהליכים של אלקטרופורזה, isoelectrofocusing, וSDS-PAGE וכן מידע על השימושיות של תוכנת 2D נאותה.הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות של ועדת האתיקה המחקרית שלנו מוסדות האנושית. מעיל באפי מתורמים אנושיים בריאים התקבל ממרכז עירוי הדם האזורי (Lille, צרפת). דגימות שהתקבלו ממעיילי האפים מוכרזות כאוסף INSERM (N ° DC2010-1209).
1. חומר ותרבות מדיה הכנה
- לדלל 10x פוספט הצפת מלוח (PBS) במים מזוקקים סטריליים כדי להשיג PBS 1x.
- הפוך 1640 בינוני RPMI בתוספת גנטמיצין (40 מיקרוגרם / מיליליטר) ו- L-גלוטמין (2 מ"מ), עם ובלי 10% בסרום אנושי ויקווה.
2. תרבויות עיקריות של המקרופאגים הנגזרים מונוציטים (MDM)
- לדלל buffycoat (25 מיליליטר) עם 1x PBS. לטעון בזהירות על Ficoll / צינור leucosep ו צנטריפוגות ב XG 1,600 במשך 20 דקות, בטמפרטורת חדר.
- לאסוף מונוציטים בממשק שלתוך צינור חדש. 3x לשטוף עם 10 מיליליטר 1x PBS המכיל ethylenediaminetetra 0.1%חומצה אצטית (EDTA) על ידי centrifugations רצוף XG ב 1000, 370 XG ו -160 XG במשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן פעם ב1x PBS לבד ב160 XG במשך 10 דקות.
- Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני RPMI-1640 ללא סרום וזרע התאים ב -35 מנות מ"מ בצפיפות של 1 x 10 6 תאים לכל תבשיל.
- לאחר שקיעה למשך 90 דקות בחממה, לבטל את supernatant המכיל את התאים שאינם חסיד. לשטוף את התאים חסיד, הכולל מונוציטים, 3x עם 1 מיליליטר PBS; לאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של מדיום חדש המכיל 10% (v / v) בסרום אנושי לתאי הסרום ללא עבר.
- לאחר 6 ימים של תרבות, כדי להניב מקרופאגים חלופיים הבדיל (M2), להוסיף IL-4 אנושיים רקומביננטי (15 ng / ml) ולשמור במשך 6 ימים. ואז, טיפול במקרופאגים הבדיל עם lipopolysaccharide (100 ng / ml) ביום 12 במשך 4 שעות כדי להשיג מקרופאגים M1.
3. הפקה של החלבונים מקרופאג M1 ו- M2 ל2D אלקטרופורזה
- macroph לשטוףגילאי שלוש פעמים עם 25 מ"מ טריס, pH 7.4, וגרוטאות במאגר המכיל 30 מ"מ טריס pH 8, 4% - 3 [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (בחורים), 2 M thiourea ו -7 M אוריאה.
- תאי lyse בעזרת מערבל מתאים לצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge למשך 5 דקות בקרח ולאחסן ב -20 ° C.
- קביעת ריכוז חלבון באמצעות מגיב ברדפורד מסחרי. אחסן 100 aliquots μl של החלבונים ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
4. Isoelectrofocusing
הערה: בצע את כל הליכי התיוג בחושך.
- להפחית 5 מיקרוגרם של כל דגימה (מקרופאגים M1 ו- M2) מותאמת ל9 μl עם חיץ תמוגה עם 2 מ"מ טריס (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף cyanine 3 (Cy3) לתמצית M1 ותמצית צבע sulfhydryl-reactive M2 בריכוז של 0.8 חלבון / מיקרוגרם ננומטר. להוסיף cyanine 5 (Cy5) לM1 ו- M2 תמציות בריכוז של 0.8 NM / חלבון מיקרוגרם דגירהבמשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לעצור את התגובה בתוספת נפח שווה של חיץ מדגם המכיל 7 M אוריאה, 2 M thiourea, 4 בחורים%, pharmalytes 130 dithiothreitol מ"מ (DTT) ו- 2%.
- מיקס Cy3 שכותרתו דגימות M1 עם דגימות M2 שכותרתו Cy5 ביד אחת וCy3 שכותרתו דגימות M2 עם דגימות M1 שכותרתו Cy5 ביד אחרת.
- רצועת רעננות שיפוע pH ללא יכולת לזוז (IPG) (מ"מ 240, pH 3-10 שיפוע ליניארית) עם 450 μl דגימות מעורבות שכותרתו במאגר המכיל 7 M אוריאה, 2 M בחורים thiourea ו -4% על isoelectric התמקדות מערכת תא (IEF) למשך 24 שעות מבלי להחיל נוכחי.
- בצע התמקדות ב 300 וולט (V) במשך 3 שעות, ולאחר מכן בשיפוע 1,000 V עבור 6 שעות, בשיפוע 8,000 V עבור 3 שעות ובסופו ב 8000 V למשך 3 שעות.
5. ממד שני
הערה: בצע את כל נהלי אלקטרופורזה בחושך.
- דגירה רצועות IPG במאגר איזון לכלולing 0.1 מ"מ טריס HCl (pH 8), 6 M אוריאה, 2% (w / v) סולפט dodecyl נתרן (SDS) ו -30% (V / V) גליצרול עבור 10 דקות.
- העבר את רצועות IPG equilibrated לממד השני (ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide (עמוד)) על גבי ג'לי עמוד 12.5% וחותם עם ההתכה נמוכה agarose.
- לבצע אלקטרופורזה על 20 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת Ettan-Daltsix במתח קבוע של 70 V לילה ואחריו 300 V עד החזית הכחולה bromophenol מגיעה לתחתית הג'ל.
ניתוח רכישה וbioinformatic 6. תמונה
- ג'לי סריקה יצוק בין שני לוחות הזכוכית נמוכה הקרינה עם סורק DIGE Imager באורכי גל עירור / פליטה של 532/580 ננומטר עבור Cy3 ו633/670 ננומטר עבור Cy5 להניב לתמונות בגודל פיקסל של 100 מיקרומטר.
- ביצוע ניתוח תמונה עם תוכנה מסחרית, כמפורט 12 בעבר.
- לחשב ולנרמל את כרכי מקום בכל תמונה. הקצאה מנורמלת נקודת נפח כאבזרortion של הערך הכולל של כל נקודה שהתגלתה בג'ל.
- נתח את ההבדלים בכמויות חלבון מקום לכל סוג של מקרופאגים על ידי השוואה בין ערך נקודת נפח המנורמל בין שתי הקבוצות (M1 ו- M2). קח לדוגמה את ההבדל בין כרכי המקום להיות משמעותי אם השינוי הוא 1.5 פי (p <0.05, ניתוח ANOVA חד-כיווני).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לבצע ניתוח proteomic ההפרש מתאים, העיבוד של דגימות כדי להיות מנותחות צריך להיות מאומת.
בדוגמא המוצגת, איכות תרבית תאים של מקרופאגים נדרש להיבטים מורפולוגיים ומולקולריים כפי שפורסמה בעבר 5. הבידול של מונוציטים למקרופאגים ואת ההומוגניות של התרבות בעקבות שלב מיקרוסקופ. איור 1 הראה דוגמא של תרבויות העיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2. כפי שניתן לראות, אנו מאמתים את ההומוגניות של M1 ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מפרט שיטות כדי לנתח את ההשפעה של גירויים שונים משני תת הסוגים של מקרופאגים, M1 (פרו-דלקתי) ו- M2 (אנטי דלקתי). תרבויות עיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2 התקבלו מההתמיינות של מונוציטים כפי שפורסמו בעבר 7.
ההליך של ג'ל אלקטרופורזה 2D DIGE דורש חומרים מיוחדים וציוד, כגון תא IEF לצלחות isoelectrofocusing, נמוכה הקרינה לSDS-PAGE כדי לסרוק פעמיים את הג'ל על עירור / אורך גל פליטה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים מוצהר.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי Inserm. מריון בובה היא עמיתה במשרד המחקר והטכנולוגיה הצרפתי. אנני טורקיה היא עמיתה שהוענקה על ידי האיחוד האירופי FP7 HOMAGE (305507).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| סרום אנושי | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| צלחת 6 בארות PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | מחקר אורגני | 3.00E+01 | |
| מסנן 0.22 ומיקרו; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 מ"ל צילינדר | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| מגיב ברדפורד | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive color | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| רצועת IPG 3-10 24 ס"מ | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| אגרוז נמס נמוך | Invitrogen | 15517-014 | |
| מערכת Ettan-Daltsix | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager סורק | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | דינמיקה לא ליניארית | ||
| צינורות 50 מ"ל | כל ספק | n/a | |
| צינורות 15 מ"ל | כל ספק | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| שלך; e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| ברומופנול כחול | סיגמא-אולדריץ' | 114391 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ' | G6279 | |
| אקרילאמיד 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| גליצין | סיגמא-אולדריץ' | G7126 | |
| עמום ומעומעם; תילפורממיד | סיגמא-אולדריץ' | 22705-6 | |
| פתילי אלקטרודה | Bio-Rad | 165-4071 |
מקורות
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
