מאמר שיטה

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

DOI:

10.3791/52224

⸱

25 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויסות נוטריינטים באמצעות הזנה מותאמת לצמיחה מתמשכת משפר את שיעורי הגדילה של ספרואידים של תאי יונקים בהשוואה להזנת אצווה לסירוגין עבור תרביות בביו-ריאקטורים מעורבבים. מחקר זה מדגים את השיטות הנדרשות להקמת תרביות פשוטות המוזנות בקצב מותאם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהדגמה זו, ספרואידים שנוצרו מקו תאי האינסולינומה β-TC6 תורבבו כמודל לייצור מוצר תאי אי יונקים כדי להדגים כיצד ויסות רמות החומרים המזינים יכול לשפר את תפוקת התאים. במחקרים קודמים, ביו-ריאקטורים אפשרו נפחי תרבית מוגברים על פני תרביות סטטיות, אך לא נצפתה עלייה בתפוקת התאים. מגבלות בחומרים מזינים מרכזיים כמו גלוקוז, שנצרכו בין האכלות אצווה, עלולות להוביל למגבלות בהתרחבות התאים. נצפו תנודות גדולות ברמות הגלוקוז, למרות העלייה בריכוזי הגלוקוז בתקשורת. השימוש במערכות הזנה רציפה ביטל תנודות ברמות הגלוקוז, ושיפר את קצב צמיחת התאים בהשוואה לשיטות תרבית סטטיות ו-SSB. עליות נוספות בשיעורי הגדילה נצפו על ידי התאמת קצב ההזנה על סמך צריכת חומרים מזינים מחושבת, שאפשרה שמירה על גלוקוז פיזיולוגי במשך שלושה שבועות בתרבית. ניתן להתאים שיטה זו גם לסוגי תאים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לייצר מספר רב של תאים אנושיים קיימא והפונקציונליים להשתלה, הסדרת תנאי התרבות הכרחית. דלדול של חומרי הזנה, יחד עם הצטברות הפסולת המטבולית הם התורמים העיקריים לשינויים מהזדקנות מטבולית לפגוע באיכות התא המוצר 1 - 3. הליך זה מדגים שיטה בתאי יונקים תרבות spheroids באמצעות bioreactor עוררה בשילוב עם מערכת האכלה שיעור זלוף המתואם להסדיר גלוקוז בטווח הפיזיולוגי 4 לכל אורכו של התרבות. לצורך המחקרים הללו, לטווח הפיזיולוגי הוגדר בין 100 ל -200 מ"ג / ד"ל. אותן שיטות שניתן להשתמש בהם כדי להסדיר מזינים אחרים ופסולת מטבולית כגון חומצת חלב.

תרבויות סטטי בנפחים קטנים (1 - 30 מיליליטר) משמשות בדרך כלל את הגדרת המעבדה לשמור ולבדל שורות תאים עבור experimeלמטרות פתיחות opening סגירות closures. passaging Cell מתבצע עם שינויים בינוניים מלאים לפי צורך במרווחים קבועים. רוב "קונבנציונלי" מדיום התרבות יש ריכוז גלוקוז גבוה (450 מ"ג / ד"ל DMEM שימוש במחקרים אלה) כדי לאפשר את השינויים בינוניים תכופים פחות, מבלי להסתכן ביצירת מגבלות מזינות. עם זאת, שיטה-האכלה תצווה זה עדיין דורשת מניפולציה תכופה, מציגה השתנות סביבת התא, ומגבירה את הסיכון לזיהום 5 - 9. Bioreactors השעיה עוררה (SSB) לספק ערבוב טוב יותר וירידת טיפול 3,10 - 20, אבל כמו תרבויות סטטי מצריך שינוי בינוני ידני שתורמים תנודות שעלולות להזיק ברמות המוצר מזינות ופסולת. האכלה זלוף של תרבויות SSB מפחיתה בעיות אלו על ידי עירוי מתמשך והסרה של מדיום, אבל שינויים גדולים ברמות מזינות עקב צמיחת תאים להישאר בעיה. השימוש של ra האכלה מתואםte מחישובים של שימוש מזין על בסיס דרישות תא מוערך יכול לספק את סביבת תאי יציבות נדרשת לייעל כדאיויות תא ומתפקד 21 - 24.

ישנו גוף גדול של ספרות המתאר שיטות תרבויות SSB להרחבה של בתאי יונקים במיוחד עבור התרבות והרחבת תאים פלוריפוטנטיים 25 - 32, עם אחרים התמקדו איון (בטא) תאים 17,33,34, או ייצור של מוצרים ביולוגיים 24, 35 - 38. רבים של סוגי התאים הנחקרים אלה עשויים להיות מבוגרים בתרבויות אליפטית, ונהלים ספציפיים עבור סוג התא בשימוש צריכים להיות מותאמים לפני יישום מערכת האכלה רציפה. בהפגנה זו, שיטת האכלת זלוף שמשה להרחיב קו תאי בטא גדל כמו spheroids בתוך bioreactor בחש 39 - 43. השיטה המתוארת במסמך זה מספקיישום פשוט של האכלת התאמות שיעור המבוססות על מדידות גלוקוז off-line כדי להשיג תנאי תרבות ממוקדות. התאמת קצב ההזנה בשיטה זו כדי לשמור על רמת גלוקוז פיזיולוגית מוצגת לתשואות תא עליות. בתאי יונקים מותנים מזין, גלוקוז מפתח, לייצור אנרגיה, ולכן שימוש שורות התאים מהווה מודל עבור בתאי יונקים בתרבית רבים 44. בנוסף, קו זה מדגים את המורכבות גדולות יותר של תאי בטא, אשר רגישים לרמות גבוהות הכרוניות של גלוקוז 45. לצורך המחקר, תאי β-TC6 הורשו יוצרים spheroids בתרבות כדי להיות קרובים ככל האפשר הגודל הממוצע של איי לנגרהנס in vivo. מערכת bioreactor זלוף 17 - 19,21,46 עם שיעור להאכיל המותאם לגלוקוז צריכה, הביאה שמירת מצבים פיסיולוגיים תשואות תא גבוהות ללא שינויים כדאיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קו ותחזוקה ניידים

  1. להשיג תאי β-TC6 (או שורת תאים יונקת חסיד אחר רצויה). לקראת מחקר, תרבות, מעבר, ואת cryopreserve התאים בהתאם להוראות ספק.

2. להרכיב את מערכת ההאכלה הרציפה

הערה: עיצוב מערכת האכלה המתמיד השיטה הבאה התבססה על מערכות דומות התואר בספרות 17 - 19,21,47 - 49. עצרת של המערכת בשימוש כאן מתוארת בפירוט בפרסום קודם 3.

  1. אסוף את הרכיבים הדרושים עבור מערכת האכלה אשר מורכבת מחמישה מרכיבים עיקריים: מאגר בינוני, משאבת peristaltic, bioreactor בחש, מאגר פסולת, והמנהג סט צינורות / הדגימה תוכנן.
    1. הקמת המאגר הבינוני באמצעות בקבוק זכוכית 1 ליטר, המאגר הפסול באמצעות בקבוק זכוכית 2 L, ואת stirrebioreactor ד באמצעות כור זכוכית בנפח 250 מיליליטר (את גרסת המדף).
    2. השתמש משאבת peristaltic דיגיטלית או משאבה דומה עם ראש משאבת 8 ערוץ לשלוט חילופי בינוני.
    3. ייצור המאגר ומכסה bioreactor שונה מן הפלסטיק קשה autoclavable עם צינור נירוסטת תמסורת יציאות לספק אוורור דרך מסנני סטרילי, ולאפשר העברה בינונית בין מאגרי bioreactors. לחלופין, לרכוש מכסים מיוחדים עם יציאות תזרים מיצרנים שונים.
      הערה: מכסת bioreactor עשויה להכיל יציאות נוספות תמסורת עבור מכשור אופציונאלי בדיקות ניטור (למשל, צג חמצן).
    4. צרף צינור יצוא (OT) מפוברק בין צינורות אוורור זכוכית נקבוביים עם מגוון גודל נקבובי ממוצע של 40 מיקרומטר עד 60 מיקרומטר, ואת צפיפות נקבובית של 40% למכסת SSB השונה. לחלופין, לבחור עוד צינור יצוא מבוסס על הדרישות הספציפיות של התרבות.
      הערה: בחר אתגודל נקבובי OT כדי להסיר שאריות בינוניות ותא בלבד, עוזב אגרגטים תא בתרבות (כמפורט בסעיף 6 ופרסום 3 לפרטים נוספים).
  2. להרכיב סטי צינורות טפטוף autoclavable מ פלואוריד polyvinylidene (PVDF) מחברי צינורות צינורות משאבת peristaltic עמידים. אורכו של הקטע הוא תלוי המרחק בין המרכיבים השונים.
    הערה: זהירות בעת בחירת מגוון צינורות כדי להבטיח עמידות ואמינות לניסויים לטווח ארוך.
  3. להרכיב הצינורות להגדיר משלושה חלקים: קו הזנה, קו פסולת, וקו מדגם.
    1. הרכב את קו ההזנה באמצעות שני קטרי צינורות (L / S 14 ו- L / S 13). השתמש L / S 14 עבור הצינורות העיקריים יהיה לגשר על המרחק בין bioreactor למאגר הבינוני, וכנס אורך קצר של L / S 13 באמצע אורך הצינורות עבור מקטע המשאבה באמצעות מתאמי PVDF המתאימים.
    2. השתמש דוקרני צינור רגיל PVDF Tubiמתאמי ng להצטרף שתי חתיכות של L / S 14 צינורות משני צדי קטע משאבה הקצר (L / 13 S) צינורות.
      הערה: לחילופין, את כל אורכו של צינורות יכול להיות L בקוטר-קטן / S 13 צינורות, ואורך צינורות כולו יכול להיות מוחלף כאשר שלמות משאבת-סעיף מוטלת על כף המאזניים.
  4. הרכב את סעיף הצינורות השני לפינוי פסול באמצעות בקוטר גדול יותר (L / S 16) צינורות וכנס קטע קצר של צינורות L / S 14 באמצע עבור מקטע השאיבה. הדבר נעשה באותו אופן כמו קו הזנת הרכבה באמצעות PVDF מתאמים-תיל צינור, או לחלופין באמצעות אורך רציף של גודל צינורות משאבה הרצוי, והחלף לפי צורך.
    הערה: אם באותו המשאבה וראש משאבת שמש המעגל להאכיל המעגל פסולת, בסעיף המשאבה של קווי צינורות לפינוי פסול חייב להיות בקוטר גדול יותר מאשר סעיף המשאבה של קו ההאכלה. הדבר מבטיח כי שיעור משאבת הסרה מהיר מקצב ההזנה, ויימנע חזקIAL עבור שינויים גדולים בהיקף התרבות, ולהקטין את הסיכון של הצפה.
  5. הרכב את הרכיב הסופי של סט הצינורות: אסיפת אוסף מדגם.
    1. הליך זה מתאר את מנהג התאסף דגימת מערכת נמל; לחלופין, יציאת דגימת סטריליים ניתן לרכוש מיצרנים שונים.
    2. לבנות את הסט משלושה אורכי צינורות קצרים (~ 6 סנטימטרים) L / S 14 מחוברים יחדיו עם מחבר PVDF T-סוג, ושני מלחציים צינור קטנים על שני אורכי הצינורות.
    3. צרף מסנן גז סטרילי עבור אוורור גז לאחד האורכים הדקו, והשני משמש לחיבור מזרק דגימת סטרילי (מסנני גז סטרילי ייתכן שיהיו צורך להוסיף בארון ביו-בטיחות הבאה עיקור מסנן סטרילי רבים אינם autoclavable).
    4. חבר את הקצה השלישי למחבר מדגם נירוסטה המצורף על המכסה של bioreactor.
    5. חיטוי הרכבת הדגימה תוך מחובר bioreactor לפני התחילההניסוי (עיין לשלב 3 להלן).
    6. השתמש הרכבה זה כדי לאסוף דגימות סטרילי מן bioreactor לפי הצורך מבלי להפריע את תהליך אספקה ​​רצופה.

3. חומרים כל חיטוי

  1. יש להכין את כל המרכיבים bioreactor עבור עיקור החיטוי.
  2. אסוף רכיבים בודדים עבור עיקור. בינוני ומאגרי פסולת (התאספו משלב 2.1.1), בקבוק טווה 250 מיליליטר (מורכב מ 2.1.1), מכסים שונים הכרחיים (מורכב מ 2.1.3), צינור יצוא (המתואר 2.1.4), ערכות צינורות שלוש ( התאספו בסעיפים 2.2 through2.5), צינור יצוא (לפי הצורך להנקה רציפה).
    1. הרכב בקבוק טווה עם כל הרכיבים ולהיות בטוחים צינור היצוא מחובר היטב בתוך הבקבוק הטווה (כמתואר בסעיף 2.1.4), ולצרף את נמל הדגימה התאסף המותאם אישית (סעיף 2.5), או יציאת דגימה אחרת לראש של המכסה .
    2. עוטף את הרכבת בקבוק טווה כולו עם אוטומטיחומר לעטוף הקלאווה, חיטוי המציין קלטת. הקפד כי לעטוף אטום. הערה: רדיד אלומיניום או חומר דומה ניתן להשתמש כדי לכסות את קצות הפרט של כל יציאת גישה במכסת bioreactor לשמר סטריליות של המחבר / מסתיים כאשר עטיפה וכאשר שאינו מחוברים סטי הצינורות בתוך האינקובטור.
    3. הרכב את העפעפיים השונים של המאגרים הבינוניים ופסולת ולאחר מכן לצרף את בקבוקי זכוכית בהתאמה. מכסה אותם באמצעות רדיד אלומיניום ו חיטוי המציין קלטת.
    4. בנפרד לעטוף את ערכות צינורות (לסעיף - 2.2 2.5) עם לעטוף חיטוי וטיפ לסייע הרכבה סופית. ניתן להשתמש בנייר אלומיניום או חומר דומה לעטוף את הקצוות האישיים של כל צינורות להגדיר לשמר סטריליות של המחבר / מסתיים כאשר לקרוע את העטיפה.
    5. חיטוי כל הפריטים העטופים באמצעות מחזור חיטוי יבש רגיל (למשל, "Gravity" הגדרה עם ~ 15 psi ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או יותר).
      הערה: אל תחבר סטרילימסננים לפני מעוקר אלא אם כן הם אישרו להיות בטוח החיטוי.

4. גיבוש אליפטית

הערה: טכניקה זו דומה לאלה המתוארים בספרות 17 - 19,21,50 - 52 עבור בתרביות תאים יונקים אחרים. כל הנהלים הבאים עיקור צריכים להיעשות ברדס זרימה למינרית ושימוש בכפפות סטריליות כדי לשמור על תנאים סטריליים עבור תרבית תאים.

  1. עבור כל התנאי, התרבות ולהרחיב התאים β-TC6 בתרבויות חסידות סטנדרטיות (שתואר על ידי ספק) עד כמויות תא מספיק מתקבלים לזרוע את המספר הרצוי של מתקני גידול.
    1. להרכיב את bioreactor ההאכלה הרציף עם צינור יצוא כפי שמוצג באיור 1 ו בסעיף 2, ולהתחבר נמל דגימת מכסת דגימה. הערה: צינור היצוא והרכבת נמל דגימה צריכה להתווסף bioreactאו האכלה רציפה לפני היווצרות אליפטית, ומורם למעלה מן מדיום התרבות עד ההאכלה רציפה הוא התחיל.
    2. לעקר את הרכבת SSB השונה על ידי חיטוי (כמפורט בסעיף 3).
    3. צרף פתחי סטרילית (0.22 מיקרומטר או קטנים מסננים סטריליים) כדי במיקומים המתאימים על העפעפיים של הבקבוק הטווה, וכלי בינוני ופסולת.
      הערה: זה חשוב כדי למנוע נעילת אד, וכדי לאפשר חילוף גזים בין החממה (5% CO 2) הסביבה ועל bioreactor. חילופי הגז יש צורך לשמור על pH הנכון בעת ​​שימוש בתקשורת שנאגר-ביקרבונט.
  2. אוספים את התאים על ידי trypsinization עדין באמצעות 0.25% (w / v) Trypsin- 0.53 פתרון mM EDTA, בטמפרטורת החדר בעזרת תסיסה מכני 2 - 3 דקות, וזרעי למתקני גידול בצפיפות של כ 1.3 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום תרבות 200 מ"ל.
    1. העבר צלוחיות המיועד מתוך האינקובטורלתוך ארון ביו-בטיחות.
      הערה: כל התרבות ומניפולציות התא צריך להיעשות בתוך ארון ביו בטיחות באמצעות טכניקה סטרילית נכונה.
    2. הסר בינוני תרבות צלוחיות ידי aspirating.
    3. שטפו תאים על ידי pipetting 5 מ"ל של בופר פוספט (ללא Ca ++ או Mg ++), לתוך הבקבוק, ושטיפה ברחבי תאים על פני השטח, ולאחר מכן לשאוב PBS.
    4. הוסף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA בקבוק אחד כי ייאספו (בדרך כלל כ 10x 175 ס"מ 2 T-צלוחיות).
    5. אפשר תאים שנקטפו כדי לדגור בטמפרטורת החדר למשך 2 - 3 דקות בארון ביו בטיחות.
    6. להתסיס בעדינות ביד כדי לשחרר תאים מפני השטח הבקבוק, ולאסוף התאים על ידי הוספת 6 מ"ל של מדיום תרבות (עם סרום) אל הבקבוק, ולהעביר את התאים צינור 50 מ"ל. כאשר שפופרת 50 מ"ל אחד מלא, להשתמש עוד 50 צינור מ"ל עד שכל התאים הדרושים נאספו כ (צינור אחד 50 מ"ל יהיה צורך כל 5 T-175 צלוחיותאסף).
    7. בעדינות צנטריפוגה (כ 50 x הכבידו) השעיות התא שנאספו עד גלולת התאים.
    8. לשאוב את המדיום הנותרים עוזב גלולה ללא פגע.
    9. לאסוף את כל תאי צינור יחיד על ידי מחדש השעיית הכדורי במדיום התרבות (המכיל סרום) בעזרת פיפטה, והעבר כל הכדורים לתוך הצינור אותו.
    10. לספור את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer רגיל עם כתמים כחולים trypan כמתואר בספרות 53.
    11. הוספת מספר רצוי של תאים הכוללים סטרילית SSB עבור כל תנאי (1.3 x 10 מיליליטר 6 תאים / היה צפיפות תא המוצא הממוקדת עבור ההפגנה הזאת).
    12. הוסף בינוני (עם ריכוז הסוכר הרצוי, במקרה הזה השתמשנו רמות גלוקוז בינוני בטווח הפיזיולוגי) כדי SSB בעזרת פיפטה להגיע נפח תרבות הכולל הרצוי (200 מ"ל נפח תרבות שימש למחקרים אלה).
      הערה: לקבלת הפד הרציף אלה SSB בוחן את המ"ק ltures היו זורעים באמצעות גירסת מערכת ה "נמוכה גלוקוז" שונה של המדיום תרבות (100 מ"ג / ד"ל). זה איפשר תרבויות להתחיל בריכוז הגלוקוז היעד הרצוי במקום להתחיל עם מדיום "גבוהה גלוקוז" ומחכה צריכת גלוקוז כדי להביא את רמות הגלוקוז לתוך לטווח הפיזיולוגי להתחיל האכלה. כל מדיום אחר האכלה במחקרים אלה השתמשו בתקן "גבוהה גלוקוז" בינוני (500 מ"ג / ד"ל).
    13. זז SSB עם תאים לצלחת ומערבבים בתוך תרבית תאי חממה.
  3. התרבות תאים של מתקני הגידול ללא האכלה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, 100% לחות יחסית, ושיעור ומערבבים של 70 סל"ד לאפשר spheroids להיווצר.
    הערה: אין התפשטות משמעותית יש לשים לב בתקופת היווצרות אליפטית שלושה ימים.
  4. לאחר היווצרות אליפטית, לחלק spheroids בין bioreactors עם תנאי תרבות רצויים.
le "> 5. תרבות האכלה רציפה ושיעור Feed מתואם

  1. החיטוי או גז לעקר את כל הרכיבים, ולהרכיב ארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקות סטרילית (שלבים 2 - 4).
  2. לאחר היווצרות אליפטית, להסיר את SSB מן החממה ולהרכיב את הרכיבים עבור מערכת הזנה רציפה בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. ראשית למלא את המאגר הבינוני הטרי עם מדיום התרבות הרצוי, ולאחר מכן להתחבר בצד אחד של קו ההזנה. גם להבטיח כי המאגר הבינוני הטרי פרק כראוי עם מסנן סטרילי.
    2. חבר צד אחד של הקו להאכיל את יציאת כניסת ההזנה על bioreactor באופן סטרילי. מסנן סטרילי צריך להיות מותקן בין קו ההזנה ואת יציאת כניסת bioreactor לסנן המדיום לפני שהוא נכנס bioreactor.
    3. חבר את הקו פסולת אל צינור יצוא bioreactor ואת המאגר פסולת הבינוני, ולהבטיח כי המאגר הפסול פרק כראוי עם sterilמסנן דואר.
  3. הזז את ההרכבה מתוך ארון הבטיחות הביולוגי (זה כנראה ידרוש שני אנשים לסחוב את כל כלי הצינורות), ולשים את כל המרכיבים לתרבות לטווח ארוך.
    1. שים את SSB לצלחת ומערבבים הפנימי של החממה באמצעות הפרמטרים תרבות זהה עבור היווצרות אליפטית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100% ו -70 סל"ד). הערה: ייתכן שיהיה צורך לנתק את פלחי צינורות זמנית מן bioreactor אם הקווים צריכים להפעיל דרך חורים בצד של החממה ולא החוצה דרך אטם הדלת. ניתן לעשות זאת בצורה מזוהם על ידי לפפה את הקצוות של קבוצות צינורות ברדיד אלומיניום לפני מעוקר (שלב 3), ומחכה לצרף בצד bioreactor המדורים הזנה ופסולת צינור עד bioreactor הוא בתוך האינקובטור. קווי הצינור ניתן לשים במקום, ואת רדיד האלומיניום ניתן להסיר בתוך האינקובטור ומצורפים במהירות bioreactor.
    2. הפעל קצוות נותרים של סטי צינורות (אלה לא מחובר מכסה bioreactor) החוצה דרך יציאת גישת החממה (pass-through), או דרך חריץ אטם דלת חממה.
    3. מחוץ החממה (בתוך ארון בטיחות ביולוגי הסמוכים במידת האפשר), חבר את קו ההזנה במהירות למאגר הבינוני הטרי, והקו פסולת למאגר הפסולת הבינוני, ולהבטיח כי המאגר הפסול פרק כראוי עם מסנן סטרילי. הערה: כדי לעשות זאת בצורה ספטית, להסיר את רדיד האלומיניום ממחברי צינורות כולים ולהתחבר כלי בהתאמה מהר ככל האפשר (במיוחד אם הקשר הזה צריך להיעשות מחוץ לארון הבטיחות הביולוגי).
    4. שם מאגר בינוני טרי (מלא בינוני להאכיל רצוי) בתוך מיני-מקרר סמוך. בדוק כדי לוודא כי צינורות הזנה ופסולת מסוגלים לצאת בחממה והזן את המקרר ושאינם מונעים את הדלתות בכל תיסגר. זה גם קריטי כי אני מזיןאינס לא צבט נסגר על ידי דלתות או במקרר או בחממה.
      הערה: המדיום המשמש במחקרים אלה היה גלוקוז סטנדרט גבוה (500 מ"ג / ד"ל) בינוני תרבות המומלץ על ידי הספק עבור סוג זה התא. בכל מדיום גלוקוז גבוהה יכול לשמש מבוסס על הצרכים הספציפיים של סוג תא בתרבית. ריכוז גלוקוז של המדיום להאכיל צריכה להיות גבוה יותר סביר (2x או יותר) מאשר את הריכוז הרצוי בתרבות כמערכת ההאכלה מסתמכת על גברת קצב ההזנה של מדיום גלוקוז גבוה כדי לשמור על רמות גלוקוז נאותות בתרבויות תוך שמירה על שיעורים להאכיל סבירים .
    5. לאחר מכן, המאגר בינוני פסולת ניתן לשים על גבי ספסל מחוץ לחממה במיקום נוח.
    6. הבא, במקום "סעיף המשאבה" של קווי הזנה ופסולת לתוך ראש משאבת הבטחה בכיוון הנכון כך שקו להאכיל יהיה לשאוב בינוני מהמאגר הבינוני הטרי לתוך SSB, ואת קווי הפסולתיהיה לשאוב בינוני מן SSB וכדי המאגר בינוני פסולת.
  4. הפעל את המשאבה על לשיעור להאכיל הרצוי.
    1. חשבתי את קצב ההזנה באמצעות משוואת שיעור להאכיל מתואם מתואר בספרות 3 ו במקטע תוצאות הנציגים להלן.
    2. השתמש במידע ספירת התא האחרון (ההליך המתואר בשלב 5) יחד עם התחזית לצמיחה, ומדידות גלוקוז הבינוניות כדי להעריך את השיעור להאכיל לשמירה על ריכוז הסוכר הרצוי בתרבות.
      הערה: שיעורי צמיחת תאי שיעורי צריכת גלוקוז יצטרכו לקבל לפני ביצוע הליכים אלה.
    3. הגדר את מהירות המשאבה על פי שער להאכיל מחושב.
  5. חזור על החישוב להאכיל שיעור ולהתאים את מהירות המשאבה עבור כל נקודת דגימה (כל שלושה ימים עבור השיטה המתוארת).

6. ספירת תאים, כדאיות, ומדידות ריכוז הגלוקוז

  1. לאסוף דגימות מכל bioreactor כל שלושה ימים, או לפי הצורך.
  2. קח דגימות תרבות מתרבויות נמאסות ברציפות SSB באמצעות יציאת דגימה המיוחדת שתוארה לעיל.
    1. השארת SSB נמאס ברציפות בתוך bioreactor, לצרף מזרק סטרילי (מזרק בנפח 5 מ"ל שימש למחקרים אלה) לחיבור מסונן un של הנמל הדגימה.
    2. הזז את צינור הדגימה למטה לתוך מדיום התרבות.
    3. Unclamp בסעיף הצינור הולך המזרק, ולסגת נפח הדגימה הכולל הרצוי.
    4. הזז את צינור הדגימה כך שהוא כבר לא שקוע בתוך התרבות, וממשיך למשוך את המזרק עד אוויר מוסר.
    5. קלאמפ צינור שמזין את המזרק, ולנתק את המזרק המכיל את המדגם, ומניחים בצד.
    6. טרום לטעון מזרק סטרילי שני טרי עם אוויר, ולצרף אל צד הסינון סטרילי של נמל הדגימה.
    7. Unclamp הצינור הולך בצד-מסנן מזרק שלנמל הדגימה, ולאחר מכן לטהר את יציאת דגימה על ידי גירוש האוויר בעדינות את המזרק דרך מסנן סטרילי. הדבר מבטיח כי נמל הדגימה יהיה ברור של כל מדיום שיורית.
    8. Re-מהדק את הצינור הולך המסנן, ניתקת את המזרק סטרילי וזורק אותו.
  3. קח את המזרק המכיל את מדגם התא מתרבה, ולגרש אותו לתוך צינור 10 מיליליטר. תת דוגמאות של כרכים ידועים ניתן לקחת ישירות הצינור הזה.
  4. עבור ספירת תאים, להסיר נפח ידוע של תאי ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות, צנטריפוגות בעדינות במשך 1 - 2 דק '(כ 50 x הכבידה).
  5. מעבירים את supernatant בצינור נפרד עבור מדידות גלוקוז, מחדש להשעות גלולה עם נפח זהה של תמיסת טריפסין-EDTA (0.25% (w / v) טריפסין, 0.53 mM EDTA), ולספור בשלושה עותקים באמצעות hemocytometer רגיל עם trypan מכתים כחול כמתואר בספרות 53.
    1. הוסף בינוני (עם סרום) כדיהמדגם עבור דילול לפי הצורך.
    2. ספירת התאים, ולחשב את כדאיויות תא על ידי הקלטת חיה (בלא כתם) תאים, ומתים (מוכתם) תאים עצמאיים (כדאי% = תאי חיים / תאים בסך הכל).
  6. אמוד את רמות הגלוקוז בינוניות בשלושה עותקים באמצעות מד הגלוקוז בדם-מקלוני בדיקה לשימוש חד.
    1. קח מדידות גלוקוז כמתואר בהוראות מד הגלוקוז החלפת המדיום תרבות דם.
    2. טובל את מקלון הבדיקה בטווח הבינוני להיבדק (שנאסף ממדגם ספירה לעיל), וחזור על המספר הרצוי של משכפל (שלושה משכפל מומלץ).
    3. בדוק את שני המדיום ופסול המדיום החדש עבור ריכוזי גלוקוז.
      הערה: עבור חלק מטרים, מדידות נמוכות מ -20 מ"ג / ד"ל (סף לזיהוי של מטר), אפשר לראות כשגיאה בפלט מטר.

7. מדידות דרג שיקוע אליפטית

  1. כדי להבטיח cel כיאשכולות l אינם הוסרו על ידי האכלת המערכת הרציפה, למדוד את קצב השיקוע של spheroids β-TC6 ידי התבוננות השקיעה שלהם טפטפו פלסטיק בקוטר גדול.
  2. תרבות תאי β-TC6 ב bioreactors SSB ליצירת spheroids כפי שתואר לעיל.
  3. לאחר 3 ימים של תרבות, לקחת 30 מ"ל דגימות של ההשעיה אליפטית ומניחים צינור 50 מ"ל.
  4. בעדינות pipet מעלה ומטה בעזרת פיפטה מיליליטר רחבה בקוטר 25 לחלק באופן שווה השעיה, ואז להפסיק pipetting עם ההשעיה ברמה ידועה pipet (למשל, 20 מיליליטר הסימן), ולאחר מכן לרשום את הזמן כל spheroids כדי ליישב 5 ס"מ.
  5. חזור על הליך זה מספיק פעמים כדי להשיג בטחון סטטיסטי (בדרך כלל n> 3).
    הערה: עבור מחקרים ביולוגיים, ערך ap פחות מ 0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית כאשר משווים מדידות. סטיית התקן של הממוצע שימש שגיאות הדיווח, והשניים זנב לזווג un מבחן סטודנט-tשמש להשוות תנאים שנפלו בנתונים המוצגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות תנודות גלוקוז בינוניות הגבל הרחבת תא בתרבויות SSB הרגיל

רמות גלוקוז להשתנות בתרבויות סטטי ותרבויות SSB לאורך תקופת התרבות 3. תנודות אלה להגביר עם הגדלת מספר סלולארי במהלך תקופת תרבות 21-היום היו כמעט זהים הוא בתרבויות סטטי SSB. תצפיות אלו מוצגות בפרסום הקודם שלנו 3. רמות גלוקוז יכולות להיות סופר-פיזיולוגית למשך תקופת התרבות עבור שני השיטות. בגלל חשיפה כרונית זה עלולה לע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת מוצרי תאים יונקים לייצור חומרים ביולוגיים עבור טיפולים בתאים דורשת ההתרבות וניטור בתאי יונקים בקנה מידה גדולה 55 - 58. יתר על כן, יישומים אלה מחייבים שורה של תנאי התרבות מוגדרות ומאומתים. כל שעליך לעשות הוא להגדיל את הנפח של תאים באמצעות טכנולוגיות מחקר לא לענות על כל הדרישות הללו. שינויים בינוניים ידניים גורמים לתנודות חומרים מזינות הצטברות של חומרים פסולת להפחית תא באיכות, כדאיות ואת תשואה. שימוש bioreactors הוא מבוסס היטב על התרבות הממוסחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למייקל גרווד וסם שטיין על הערותיהם המועילות, ולקריסטן מ. מיינרד על הסיוע בהכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
β תאי TC-6ATCC, Manassas, VACRL-11506קו תאי אינסולינומה של עכבר (סוג תא דבק)
DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dubbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAראה להלן למספרי מוצרים 
DMEM גלוקוז גבוה (500 מ"מ)Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM גלוקוז נמוך (100 מ"מ)Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (שימו לב שמדיום זה כבר מכיל פירובאט)
L-glutamineInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product
נתרן פירובטInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
סרום חזיר מומת בחוםGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
T-150 צלוחיות מטופלות בתרבית רקמותקורנינג, קורנינג, ניו יורק430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(מדעי החיים)
& categoryname=
חממת תרבית תאים NuAireפרינסטון, מינסוטהארה"ב Autoflow. ניתן להשתמש בכל חממת תרבית תאים מווסתת CO2 עם מעטפת מים.
צנטריפוגהסורוול RT 7 (ניתן להשתמש בכל צנטריפוגה שולחנית דומה)
מקררניתן להשתמש בכל מקרר מעבדה (נעשה שימוש בגרסת שולחן קטנה למחקרים אלה)
1 ליטר בקבוק זכוכיתקורנינג, קורנינג, ניו יורק1395-1 ליטרניתן להשתמש בכל ספק. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(מדעי החיים)
& categoryname=
2 ליטר בקבוק זכוכיתקורנינג, קורנינג, ניו יורק1395-2Lכל ספק יכול לשמש
250 מ"ל ביו-ריאקטורים מעורבבים קורנינג, קורנינג, ניו יורק4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(מדעי החיים)
& categoryname=
צלחת ערבובפישר סיינטיפיק11-496-104Aניתן להשתמש בכל צלחת ערבוב בטוחה לחממה, כל ספק
כלי תרבית רקמות 100 מ"מ קוטרNunc, רוצ'סטר, ניו יורק (פישר סיינטיפיק)1256598 ניתן להשתמש בכל ספק (הוזמן דרך Fisher Sci)
FALCON 50 מ"ל צינורות חרוטייםפלקון, סן חוזה, קליפורניה1256598כל ספק יכול לשמש
פלסטיק Delran המשמש לחלקים מותאמים אישיתמקמאסטר קארשוניםניתן להשתמש בכל חומר לבחירה, אך דרן נבחר מכיוון שהוא בטוח לחיטוי, לא תגובתי וקל לעיבוד.
http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac צינור נירוסטה למכסים מותאמים אישיתמקמאסטר קארשוניםניתן להשתמש בכל ספק. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
מכסי ביו-ריאקטור של Delran ששונו בהתאמה אישית להאכלה רציפהבהתאמהלא מודע לספקים המייצרים מוצר דומה
מכסי בקבוקי זכוכית מותאמים אישית להאכלה רציפהבהתאמהחלק מהספקים (למשל , Fischer Sci, Corning) מייצרים מוצרים דומים בקישורים למטה.
משאבה פריסטלטית דיגיטלית Masterflexקול פארמר, ורנון הילס, ILEW-77919-25ניתן להשתמש בכל משאבה פריסטלטית מדויקת. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
מחברי צינורות PVDF (שונים)קול פארמר, ורנון הילס, אילינויראה קישור ניתןלהשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
צינורות BPT חמושים L/S 16קול פארמר, ורנון הילס, ILWU-06508-16ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
צינורות BPT חמושים L/S 14קול פארמר, ורנון הילס, אילינויWU-06508-14ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
צינורות BPT חמושים L/S 13קול פארמר, ורנון הילס, אילינויWU-06508-13ניתן להשתמש בכל ספק. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Millipore Millex GP ממברנה PES 0.22 & #181; l מסנן מזרק סטרילי (משמש לאוורור וסינון בינוני)פישר סיינטיפיקSLGP033RSניתן להשתמש בכל ספק 25
מ"ל פיפטה פישרסיינטיפיק13-678-11ניתן להשתמש בכל ספק, וניתן להשתמש בגדלים שונים
PipetterFisher Scientific13-681-15Eניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה ניתן להשתמש
בהמוציטומטרפישר סיינטיפיק02-671-6ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
מיקרוסקופ אור הפוךLeicaניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה One
Touch Ultra Blood Glucose MeterFisher Scientific22-029-293ניתן להשתמש בכל ספק, או במוצר דומה (למשל, Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 ניתן להשתמש בכל ספק או במוצר דומה (e., Bayer)
אישית אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
  2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
  3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611(2013).
  4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
  5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
  6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
  7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
  8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
  9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
  10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
  11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
  13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
  14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
  15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
  17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
  18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
  19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
  20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
  21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
  22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
  23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
  24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
  25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
  26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
  27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
  28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
  30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
  31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
  33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
  34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
  35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
  36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
  37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
  38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
  39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
  40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
  42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
  43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
  46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
  47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
  48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
  49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
  50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
  51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
  52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
  53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262(2007).
  54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
  55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
  56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
  57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
  58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
  59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
  60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
  61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
  62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
  63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים