מאמר שיטה

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

DOI:

10.3791/52239

⸱

27 בינואר 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven, 2Biomedical MRI Unit/ MoSAIC, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים הליך ניסיוני של התפתחות ביופילם של קנדידה אלביקנס במודל תת עורי של עכבר. ביופילמים פטרייתיים כומתו על ידי קביעת מספר היחידות היוצרות מושבה ועל ידי הדמיית ביולומינסנציה לא פולשנית, כאשר כמות האור המופקת תואמת את מספר התאים הקיימאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח biofilm קנדידה אלביקנס על משטחי יוטיים ו / או א-ביוטי מהווה איום ספציפי לחולים מאושפזים. עד כה, ג biofilms אלביקנס נחקרו בעיקר במבחנה, אך יש צורך חיוני להבנה טובה יותר של התהליך הדינמי הזה, לפי תנאי in vivo. פיתחנו מודל עכברים תת עורי in vivo ללמוד C. היווצרות biofilm אלביקנס. במודל שלנו, מרובה (עד 9) מכשירי -infected קנדידה מושתלים לחלק האחורי של בעלי החיים. זה נותן לנו יתרון גדול על פני מערכת מודל צנתר הוורידים המרכזית כפי שהוא מאפשר לנו ללמוד כמה biofilms העצמאי בבעל חיים אחד. לאחרונה, אנו מותאמים מודל זה ללמוד C. פיתוח biofilm אלביקנס בעכברים / ג BALB. במודל זה, להתבגר ג biofilms אלביקנס לפתח בתוך 48 שעות ולהדגים את ארכיטקטורת biofilm תלת-ממדית הטיפוסית. כימות של פטריית biofilmהוא שלאחר המוות ניתח באופן מסורתי ודורש הקרבה מארח. כי זה דורש שימוש בבעלי חיים רבים לבצע מחקרים הקינטית, אנחנו מוחלים הדמיה פליטת אור לא פולשנית (BLI) לlongitudinally מעקב in vivo בוגר ג אלביקנס biofilms פיתוח במודל תת-עורי שלנו. ג תאי אלביקנס הונדסו לבטא את גן Gaussia לוציפראז פרינקפס (gLuc) הצמוד לקיר התא. אות פליטת אור מופקת על ידי לוציפראז שממיר את coelenterazine המצע הוסיף לאור שניתן למדוד. אות BLI דומה ספירת תאים המתקבלת מצנתרי explanted. הדמיה לא פולשנית לכימות בהיווצרות biofilm vivo מספקת יישומים מיידיים להקרנה והאימות של תרופות נגד פטריות בתנאי in vivo, כמו גם למחקרים המבוססים על אינטראקציות מארח הפתוגן, תורם בזאת להבין טוב יותרing של הפתוגנזה של הזיהומים הקשורים קטטר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קנדידה אלביקנס הוא אורגניזם commensal, אשר ניתן למצוא באתרים של אנשים בריאים שונים, למשל בעור או כחלק ממערכת העיכול והצומח בנרתיק. עם זאת, בבית חולים, ובעיקר immunocompromised חולים, הוא עלול לגרום למגוון רחב של זיהומי 1. אצל אנשים כאלה, המערכת החיסונית המוחלשת מאפשרת לתאי קנדידה להפיץ למחזור הדם ולפלוש לרקמות עמוקות יותר גורמים לזיהומים מסכני חיים. בנוסף, הנוכחות של מצעי א-ביוטי, כמו קטטרים ורידים ושתן מרכזיים, מסתמי לב מלאכותיים ומפרקים עשויות לספק נישה לקנדידה קובץ מצורף 2. הדבקה על מצעים כזה היא תנאי הכרחי לפיתוח biofilm נוסף, המייצג את שכבה של תאי שמרים וhyphal המוטבעים בחומר פולימרים תאי, בעיקר בהיקף של סוכרים 2. ג זיהומי קטטר -associated אלביקנסמשויכים שיעור תמותה גבוה. מאפיין כללי של biofilms הוא הרגישות ירדה אנטי פטרייתי ידועה, כגון azoles 3,4. שיעורים רק חדשים יותר של תרופות נגד פטריות, כגון echinocandins וניסוח liposomal של amphotericin B הוכיחו להיות פעיל נגד הזיהומים הקשורים קטטר 5-7. בגלל עמידות biofilm לאנטי פטרייתי, גישות טיפוליות מוגבלות מאוד, לעתים קרובות מובילות להסרת הקטטר והחלפתה לאחר מכן כפתרון יחיד.

רוב ההבנה הנוכחית שלנו של ג פיתוח biofilm אלביקנס מקורו בניסויים במבחנה על מצעי אביוטי כגון פוליסטירן, או פלסטיק המשמשים לייצור של מכשירים הנ"ל, כלומר, סיליקון, פוליאוריטן 2. מודלים אלה הם די מתקדמים ולנסות לחקות את המצב בvivo ככל האפשר. עם זאת, מערכות אלה אינן כרוכים בזרימת הדם רציפה וtהוא מערכת חיסונית של המארח. זה הביא לפיתוח של מערכות מודל in vivo, כגון מודל צנתר ורידים המרכזי (CVC) 8-10, מודל stomatitis התותבת של פטרת הפה 11 ומודל עכברי לcandiduria הקשורים קטטר 12. בנוסף, ג פיתוח biofilm אלביקנס נחקר in vivo על המשטחים הריריים, כמו אלה מחלל נרתיק 13 ​​ושבעל-פה 14. המעבדה שלנו תרמה להקמתה של ג תת עורית מודל אלביקנס biofilm, המבוסס על השתל של חתיכות קטטר נגועות בחלק האחורי של חולדות ספראג Dawley 15. מודל זה שימש בהצלחה במעבדה שלנו כדי לבדוק את רגישות biofilm לfluconazole וechinocandin תרופות 5,16, כדי לחקור את ההשפעה של טיפול קומבינטורית של diclofenac וקספופונגין 17. לאחרונה, אנו מותאמים מערכת זו לשימוש בעכברים / ג BALB 18,19. בהשוואה עם אחרים במודלי vivo, היתרון העיקרי של מודל זה הוא תת-עורי את האפשרות ללמוד biofilms מרובה לכל בעלי חיים שפותחו בתוך לומן של חתיכות צנתר מושתלות.

כדי לצמצם את מספרם של בעלי החיים במעבדה, יש לנו להתאים את המודל הזה כדי ללמוד את הפיתוח של ג אלביקנס biofilms הלא פולשני באמצעות הדמיה פליטת אור (BLI) 18,19. שיטה זו הוכיחה את עצמו טכניקה רבת עוצמה, אשר ניתן להשתמש בי לכמת biofilms ידי מדידת האות הספציפית BLI באזור של עניין (במקרה שלנו על השטח של צנתרים מושתלים), הימנעות הקרבת בעלי חיים. בהשוואה לחיידקים, שיכול לבטא את שני הגנים ואת המצע הדרוש לתגובת פליטת אור עקב כניסתה של אופרון לוקס ספציפי 20, רוב האורגניזמים אוקריוטים, כולל C. אלביקנס, תלוי בביטוי Heterologous של גן בלוציפראז בשילוב עםממשל חיצוני של מצע ספציפי, כגון D-luciferin או coelenterazine 21. כנראה בשל נוכחותם של דופן התא פטרייתי וג המורפוגנזה אלביקנס, המשלוח תאיים של המצע לאנזים בלוציפראז היה אתגר עיקרי 21. על מנת לפתור בעיה זו, Enjalbert et al. 22 מהונדס מתח שבו ג סינטטי הגרסה מותאמת לקודון אלביקנס של הגן ללוציפראז פרינקפס Gaussia מופרש באופן טבעי (gLuc) הייתה התמזג לג גן אלביקנס PGA59, GPI- מעוגן דופן תא חלבון. בגלל הנוכחות של לוציפראז בקיר התא, ניתן למנוע בעיות הנוגעות לזמינות תאית של המצע. מערכת מסוימת זו שימשה ללמוד זיהומים שטחיים שנגרמו על ידי ג 22 אלביקנס. ממש לאחרונה, BLI היה בשימוש גם כדי לעקוב אחר ההתקדמות של פטרת לוע התחתון וpossiblטיפול בדואר 23. ממצאים אלה תומכים בשימוש בBLI כטכניקה מבטיחה ללמוד זיהומים הנגרמים על ידי תאי חיים נטולי אלא גם זיהומים הקשורים מכשיר.

במחקר זה, אנו מתארים את C. פיתוח biofilm אלביקנס על פיסות קטטר פוליאוריטן בעכברי BALB / c והכימות שלה באמצעות BLI. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של קולוניזציה במבחנה של צנתרים פוליאוריטן בתקופת ההידבקות אחרי השתלה בעכברים ובפיתוח biofilm שלאחר מכן בבעלי חיים. מלבד מדידת אות BLI הנפלטת על ידי ג תאי אלביקנס, אנחנו גם לקבוע את המושבה להרכיב יחידות להשוואה עם הטכניקה סטנדרטית לכימות עומס פטרייתי biofilm.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של KU Leuven (פרויקט מספר 090/2013). לשמור על חיות בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים KU Leuven.

1. ג אלביקנס צמיחה

  1. עשרים וארבע שעות לפני תחילתו של הניסוי בבעלי החיים, להכין צלחות YPD על ידי הוספת 10 גרם של מגורען תמצית שמרים, 20 גרם של peptone קטריולוגית, ו -15 גרם של אגר מגורען. מרכיבים את הנפח ל -900 מיליליטר מים מילי- Q וחיטוי.
  2. הוסף 50 מיליליטר של גלוקוז 40% סטרילי. מערבבים היטב ויוצקים לתוך צלחות פטרי. השאר צלחות אגר להתקרר ולחזק.
    הערה: במחקר זה, להשתמש בשני זנים, כלומר ג סוג בר אלביקנס SC5314 - זן gLuc שלילי (המכונה WT) וג אלביקנס SKCA23 מתח, שהוא ג סוג בר אלביקנס SC5314 הפך עם פלסמיד Clp10 :: Act1p-gLUC59 22 .In זן זה (בשם SKCA23-CTgLuc) gLuc התמזג לגן PGA59 אנדוגני תחת השליטה של אמרגן ACT1 (אקטין) (האמרגן הזה הוא פעיל בשמרים, כמו גם שלב hyphal של פטריית צמיחה). זן זה ניתן לבקש מהמעבדה של פרופ 'פטריק ואן Dijck, KU Leuven, לובן, בלגיה. פלסמיד פלסמיד Clp10 :: Act1p-gLUC59 22 נתרם באדיבותו של פרופ 'ג d'Enfert, מכון פסטר, פריז, צרפת.
  3. לשמור על שני הזנים במלאי גליצרול ולאחסן ב -80 ° C.
  4. לפני כל זני פס ניסוי על צלחת YPD. דגירה צלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. צנתר חתיכות הכנה

  1. לפני הניסוי, לקבוע כמה צנתרי צורך. ניתן להשתיל עד 6 חתיכות קטטר לכל עכבר (3 צנתרים בצד השמאל וקטטר 3 בצד ימין של בעל החיים (איור 2 א).
  2. עשרים וארבע שעות לפני ניתוח בעלי החיים, לפתוח את חבילהגיל המכיל קטטר משולש לומן תחת ארון הבטיחות הביולוגי. הסר את כל החלקים המיותרים עם פינצטה סטרילי ולחתוך את החלק מחובר לקטטר עם אזמל סטרילי. הנח שליט תחת חבילת הפלסטיק ולחתוך לחתיכות קטטר פוליאוריטן בדיוק 1 סנטימטר על פי קנה המידה על השליט (איור 1).
    הערה: חשוב לציין כי סוג זה של חתיכת צנתר הוא לא זרחני ולכן הוא מתאים לBLI 18,19.
  3. הנח למקסימום של 15 חתיכות קטטר החתך (שלב. 2.2) לתוך 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge. תמיד להכין 3 חתיכות נוספות, אשר משמשות כדי למנות את כמות תאי קנדידה המצורפת במכשיר לאחר תקופה של הידבקות.
  4. להשלים עם צנתרים כ 1.8 מיליליטר של 100% בסרום שור עוברי (FBS).
  5. במרץ מערבולת ולהוסיף 100-200 μl נוסף של 100% FBS. לגמרי לכסות את כל חתיכות קטטר עם סרום.
  6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.

3. בעלי חיים ודיכוי של המערכת החיסונית

  1. שמור נקבת BALB / c עכברים (כ 8 שבועות של גיל) בכלובים העליונים מסנן מאוורר בנפרד עם גישה חופשית למזון רגיל וכרצונך מים.
  2. ליזום דיכוי המערכת החיסונית שעות 24 לפני ניתוח בעלי חיים על ידי הוספת dexamethasone (0.4 מ"ג / ל ') למי השתייה של בעלי חיים. על מנת להימנע מכל זיהום חיידקים של המארח, להשלים את מי שתייה עם אנטיביוטיקה, למשל, אבקת נתרן אמפיצילין (L / 0.5 g).
  3. שמור דיכוי חיסוני של בעלי חיים במהלך הניסוי כולו (עד 6 ימים).

4. מצעי פוליאוריתן Ex vivo ג אלביקנס הידבקות בFBS מצופה

  1. העבר כל פיסת צנתר מצופה סרום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר טרי.
  2. לגרד את חלק ג תאי אלביקנס גדלו על צלחות YPD (שלב 1) ולהשעות אותם ב 1 מיליליטר של PBS.
  3. לדלל יכולתאים דידה (1: 100) בצינור microcentrifuge נפרד. קח 10 μl של המדגם בדילול מלא ולהחיל אותו על תא ספירת תאים. לספור לפחות 16 ריבועים קטנים.
  4. הכן תאי קנדידה (כל זן בנפרד) במדיום RPMI 1640 לריכוז סופי של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר.
  5. הוסף 1 מיליליטר של השעיה תא לכל פיסת צנתר מצופה בסרום.
  6. במרץ מערבולת ולהבטיח כי הצנתרים שקועים בטווח הבינוני ולא צף על גבי.
  7. דגירה צנתרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות (תקופה של הידבקות).
  8. הסר צנתרים עם פינצטה סטרילי ולשטוף אותם פעמיים עם 1 מיליליטר של PBS. במהלך שלב זה לוודא כי נוזל הכביסה עובר לומן על ידי שמירה על קטטר במצב אנכי בעת שטיפה בעדינות את הצנתרים. חשוב לציין, לא משתמש בזרימה חזקה שעלולות להוביל להסרת תאים מצורפים.
  9. העבר כל קטטר שטף לצינור microcentrifuge נקי (חתיכה לtu אחדלהיות).
  10. מניחים על קרח ולשמור שם עד ניתוח.

5. הרדמה

  1. הכן הרדמה על ידי ערבוב 75 μl של קטמין (100 מ"ג / מיליליטר) עם של medetomidine 100 μl (1 מ"ג / מיליליטר) וμl 825 של תמיסת מלח סטרילית. לנהל intraperitoneally (IP) 60-80 μl של קוקטייל הרדמה למשקל גוף 10 גרם, וכתוצאה מכך במינון של 45-60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו.6-.8 מ"ג / קילוגרם medetomidine.
  2. להיפוך של הרדמה, לדלל 50 atipamezole μl (5 מ"ג / מיליליטר) ב4.95 מיליליטר מלוח, לנהל ip למשקל גוף 10 g 100 μl כתרופה, וכתוצאה מכך במינון של 0.5 מ"ג / קילוגרם.
  3. לאחר ההזרקה של הרדמה, למקם את החיה לכלוב נפרד ולחכות עד שהוא נרדם באופן מלא.
  4. לאשר הרדמה תקינה של בעלי החיים על ידי צביטת עור בהירה וקמצוץ הבוהן, שאינו גורם כל נזק לעור. כל תנועה שנצפתה מצביעה על כך שבעלי החיים לא הרדים מספיק כדי לבצע ניתוח. אם זה יקרה, לחכות couple של דקות ארוכות עד שהחיה לא מראה שום סימנים של תנועה על קמצוץ עור או הבוהן.

6. ניתוח בעלי החיים

  1. העברת בעלי החיים הרדימו מהכלוב על רקמה נקייה מונחת על כרית החימום, טרום חימם עד 37 ° C (איור 2 א, (1)).
    הערה: חלופה זולה יותר היא להשתמש בשמיכות מחוממים בחשמל. כמו כן ניתן להשתמש ברפידות isothermic, אשר חייב להיות מחוממת במיקרוגל לפני הניתוח של בעלי החיים.
  2. החל משחה עיניים על העיניים.
  3. לגלח את הגב התחתון של בעלי החיים עם מכונת גילוח חשמלי. הסר את כל שערות בעלי החיים ולהעביר את בעלי החיים בממחטת נייר נקי. לחטא את העור (לדוגמא, עם 1% isopropanol יוד או 0.5% chlorhexidine באלכוהול 70%) ולעזוב את אזור החיטוי להתייבש במשך כ 1 דק '(איור 2 א, (2)).
  4. לעשות חתך קטן בעור (אחד בצד השמאל ואחד בצד ימין של בעלי החיים) (כ 0.5 ו# 8211; 1 סנטימטר) (איור 2 א, (3)).
  5. לנתח את subcutis עם מספריים כדי ליצור שתי מנהרות תת-עורי. כל מנהרה צריכה להיות כ -1.5 סנטימטרים וברוחב 1 סנטימטר.
  6. הכנס שלוש חתיכות קטטר, נגועים בעבר עם קנדידה, בכל מנהרה. ודא שהצנתרים לשכב אחד ליד שני בהסדר אופקי וכי הם אינם מכסים אחד את השני על מנת לאפשר ההשתלה של שישה שברי קטטר בסך הכל (איור 2 א, (4)).
  7. סגור את החתכים עם תפרים. לחלופין, להשתמש Dermabond כדי לסגור את הפצע.
  8. לחטא את הפצע בעדינות רבה עם chlorhexidine 0.5% בשנת 70% אלכוהול או עם isopropanol יוד (1%).
  9. החל הרדמה מקומית (ג'ל Xylocaine, 2%) ישירות על הפצע.
  10. לנהל היפוך של הרדמה (פרוטוקול 5, שלב 2): משקל גוף intraperitoneally 100 μl לכל 10 גרם.
  11. העברת בעלי חיים לכלוב נקי הונחו בעבר על צלחת חימום. לשמור על בעלי החייםנפרד וחם עד שהחיה היא ערה לחלוטין. בינתיים, תמשיך עם המבצע והשתל של החיה הבאה. ברגע שכל בעלי החיים המופעלים ער באופן מלא. העברה לכלוב אחד. צג בעלי חיים באופן קבוע.

הדמיה 7. פליטת אור: הכנת coelenterazine (CTZ), המצע לג ' לוציפראז פרינקפס

  1. הכן coelenterazine הטרי פתרון מניות (CTZ) על ידי המסת 5 מ"ג / מיליליטר CTZ באתנול acidified או על פי הוראות יצרן.
  2. הכן 1.2 פתרון עובד מ"מ על ידי דילול מניות פתרון 1:10 ב PBS סטרילי.
    הערה: להזריק תת עורי 100 פתרונות עובדים CTZ μl באזור המקיף את הצנתרים. השתמש במזרקי אינסולין להזרקה תת עורית של CTZ.
  3. תמיד לשמור CTZ בחושך (למשל, לכסות צינורות microcentrifuge המכילים CTZ ברדיד אלומיניום). אחסן את פתרון המניות ב -80 ° C למשך הניסויים.

8. פליטת אור הדמיה

  1. לאתחל את המצלמה BLI.
  2. להרדים את בעלי החיים באמצעות תיבת אינדוקציה. השתמש בתערובת גזים של isoflurane בחמצן, N 2 O / O 2, או באוויר ב2-3%.
  3. אחרי הגיוס, לשמור על הרדמה בתיבת האינדוקציה ובחדר ההדמיה ב1.5-2%.
  4. לפני שאתחיל בפגישה ההדמיה, למקם את צלחת ההדמיה בעמדה, אשר תואמת את FOV של 10 סנטימטרים. ודא שהמיקום הנכון של שקעי ההרדמה ובעלי החיים על ידי הצבת בעלי חיים שינה בתיבה.
  5. קח כמה תמונות עד בעלי החיים הוא במצב ההדמיה הרצוי, בFOV ממש מתחת למצלמה.
  6. הכן שני מזרקים אינסולין של הפתרון עובד CTZ כל 100 μl מכיל.
  7. הנח חיה אחת על הספסל ולשמור אותו ישן באמצעות חרטום מתן הרדמה גז.
  8. להביא את המחטים של המזרקים במקום סביב צנתרים תת עורי ולהזריקבו זמנית CTZ על גבי הצנתרים.
  9. מייד לאחר הזרקה, למקם את החיה על הצלחת החמה בתיבת המצלמה ולהתחיל רכישת תמונת פליטת אור.
  10. לרכוש סריקות ברציפות עם זמני רכישה החל 20-60 שניות (תלוי בעוצמת האות) עד שתגיע לעוצמת האות המקסימלי. במהלך הרכישה של הפריים הבא, למדוד את עוצמת אות BLI של המסגרות שנרכשו בעבר על ידי הצבת את ההחזר על ההשקעה על כל שלישיית צנתרים ומדידת שטף הפוטונים דרך ROI זה.
  11. חזור משלב 7 לחיה הבאה (ים).
  12. לאחר הדמיה, לחזור בעלי חיים לכלוב שלהם. חזור BLI במהלך ניסוי למעקב אורך, לא פולשנית של היווצרות biofilm.
  13. לנתח את נתוני BLI באמצעות תוכנת תמונת חיים. מניחים את ההחזר על ההשקעה מלבנית בגודל קבוע על כל שלישיית קטטר ולמדוד את שטף הפוטון (זוהר) דרך כל החזר על השקעה. חזור על פעולה זו עבור כל בעל חיים.
  14. דו"חעוצמת אות BLI של כל שלישיית קטטר כשטף פוטונים לשנייה. מייצג את נתוני BLI על סולם לוגריתמים על ידי התוויית הממוצע וסטיית התקן של שטף הפוטונים לשנייה לכל קבוצה. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים ביומן 10 נתונים הפכו.

9. הצנתר explant

  1. הכן צינורות microcentrifuge המכילים 1 מיליליטר של PBS, אחד לכל מכשיר קטטר ולשמור אותם על קרח.
  2. להרדים בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם (איור 2, (1)).
  3. לחטא את העור של הגב עם chlorhexidine 0.5% בשנת 70% אלכוהול או עם isopropanol יוד (1%).
  4. עושה חתך (3 סנטימטרים בערך) מעל הצנתרים.
  5. לחתוך רקמה התת עורית ולהסיר את שברי קטטר אחד אחד מתחת לרקמה התת עורית באמצעות פינצטה סטרילית (איור 2, (2)).
  6. ידית קטטר בעדינות במצב אנכי ולשטוף אותו פעמיים עם 1 מיליליטר של PBS סטרילי. מניחים כל קטטרחתיכה לתוך צינור microcentrifuge נפרד (מוכן בשלב 1).

10. תאי כימות Biofilm קשורים-ידי רוזן יחידות מושבה להרכיב (CFUs) וניתוח סטטיסטי של תוצאות

  1. הצנתרים Sonicate הציבו בעבר ל1 מיליליטר של PBS במשך 10 דקות ב 40,000 הרץ בsonicator אמבט מים ומניחים אותם על קרח.
  2. לאחר sonication, במרץ מערבולת למשך 30 שניות ומקום שוב על קרח.
  3. הכן שני צינורות microcentrifuge נוספים המכילים 900 μl של PBS.
  4. הפוך 01:10 ו1: 100 דילולים מהמדגם המקורי שלך (אחד המכיל את הצנתר) ולשמור את כל צינורות microcentrifuge על קרח.
  5. צלחת של הדגימות המקוריות 100 μl, 01:10 ו1: על צלחות אגר YPD 100 דילולים בשני עותקים.
  6. דגירה צלחות במשך 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס ולספור CFUs.
  7. ספירת המושבות גדלו על צלחות אגר YPD (סכום ספיר של מושבות, 300 מושבות / צלחת המרבית) ולהכפיל אותם על ידי dilu הנכוןגורם tion (1x-מקורי, 10x או 100x דילול). נוסף להכפיל כל פיסת צנתר על ידי 10x, אשר תואמת את הסכום הסופי של מושבות בצינור מיליליטר 1 המכיל את הקטטר. להביא את הסכום הסופי של מושבות להיכנס 10 תאים / חתיכת קטטר עם סטיית תקן (SD). הגעה נתונים כממוצע ± SD.
  8. מניחים את כל הערכים עבור כל קטטר וקבוצה מסוימת ולתוכנת גיליונות אלקטרוניים או / סטטיסטית, כדי לבצע את החישובים הנ"ל וניתוחים סטטיסטיים. מצביע על קבוצות ספציפיות כדי להשוות, כלומר WT לעומת מוטציה או 2 ימים vs. 6 ימים היווצרות biofilm ולבצע מבחן t מזווג וANOVA עם שלאחר בדיקת Tukey על הנתונים הפך log10.
    1. הגעה רמת מובהקות על ידי ערך p. במחקר זה מצביע על משמעות אם ערך p <0.05, המיוצגים באופן הבא: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים את ההליך כירורגי של שתל קטטר וexplant במהלך in vivo פיתוח biofilm אלביקנס ג בעכבר. יתר על כן, אנו מציגים כימות של biofilms הבוגר לא רק על ידי ספירת CFUs קלסית אלא גם על ידי BLI.

כפי שניתן לראות באיור 1 א, חתיכות קטטר פוליאוריטן אינו זרחניות נחתכו למכשירי 1 סנטימטר ולאחר מכן מצופים בסרום. שלב זה הוא חשוב מאוד משום שהוא מאפשר לתאי קנדידה לצרף מצע במהי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש במודלים של בעלי חיים, ומודלים של מכרסמים במיוחד, ללימודים המוקדשים לbiofilms חיידקים הוא מאוד חשוב כמו המערכת החיסונית המארח הוא גורם חיוני בהיווצרות biofilm שמודלים במבחנה לא יכולים להסביר. במחקר זה, אנו מתארים ג תת-עורי פשוט יחסית מודל אלביקנס עכבר biofilm, שניתן לאמץ בקלות במעבדת מחקר ואינו דורש כישורים טכניים חזקים. מודל זה פותח במקור כדי ללמוד היווצרות biofilm סטפילוקוקוס אפידרמידיס בחולדה 24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי KU Leuven PF 'IMIR', קהילת המחקר של FWO על ביולוגיה ואקולוגיה של ביופילמים חיידקיים ופטרייתיים (FWO: WO.026.11N) ועל ידי פרויקט FWO G.0804.11. SK מודה בהכרת תודה ל-KU Leuven על מלגת PDMK 11/089 ול-FWO על מלגת הפוסט-דוקטורט. אנו אסירי תודה לניקו ואנגות'ם על עזרתו בהכנת הדמויות. ברצוננו להודות לסליה לובו רומרו על הסיוע הטכני במהלך הליכי ניסוי in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמצית שמרים מגורענתMerckMERC1.03753.0500
פפטון בקטריולוגיאוקסואידLP037B
אגר מגורעןDifco214530
D-(+)-גלוקוזFluka49159-5KG
מי מלח חוצץ פוספט מוכן במעבדהעבור 1 ליטר של 10x PBS: 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4
RPMI1640 עם L-גלוטמין וללא נתרן פחמתי סיגמאR6504-1Lהתכוננו לפי הפרוטוקול לבדיקת רגישות לתרופות קנדידה אלביקנס 
3-(N-Morpholino)חומצה פרופנסולפונית (MOPS)SigmaM1254MOPS משמשת להתאמת ה-pH של מדיום RPMI (pH 7.0)
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaF7524
חתיכת קטטר תוך ורידי פוליאוריטן טריפה-לומן (קוטר 2.4 מ"מ, Certofix Trio S730) BBraunCV-15703חלק פוליאוריטן חתוך לחתיכות של 1 ס"מ
DexamethasoneFagron SAS, צרפת611139מדכא חיסון (תמיסת מלאי 10 מ"ג/מ"ל)
אמפיצילין Duchefa Biochemie, הולנדA0104טיפול מונע אנטיבקטריאלי
קטמין 1000פייזר804 119הרדמה
דומיטורפייזר134737-1הרדמה
אנטי-סדאןפייזר134783-2היפוך הרדמה
ג'ל קסילוקאין (2%) - זהו ליניסולאסטרהזניקה352 1206הרדמה מקומית לעור
עיניים טרמיצין/פולימיקסין-bלמניעת ייבוש וזיהום בעיניים
Coelenterazine פרולום (ננו-לייט)NF-CTZ-FBחומר רגיש לאור (יש לשמור בחושך)
יוד איזופרופנול (1%)3M™ DuraPrep ומסחר;  חומר חיטוי לעור
0.5% כלורהקסידין ב-70% אלכוהול.   חומר חיטויסדיום
ציוד
תא
מזרקי אינסולין (0.3 מ"ל)Terumo Myjector 29G324826להזרקת קולנטרזין
סכין גילוחלבעלי חיים קטנים
כליםמספריים, 2 זוגות פינצטה, אזמל
כרית חימוםLeica14042321474
תפר עורJohnson& ג'ונסוןK890Hחוט כירורגי, מחט
סוניקטור אמבט מיםמצלמת ברנסון 2210
BLI (ספקטרום IVIS) פרקין אלמר, תוכנת AlamedaIVISSPE
Living Image פרקין אלמר, אלמדה(גרסה 4.2) 
חומר משחת לעורספירת תאים חשמלי כירורגיים סטריליים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352(2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976(2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gaussia LuciferaseIn Vivo

מאמרים קשורים