ניתוח cytometry זרימת פרוטוקולים למשטח והתאי Antigen של סוגי תאים עצביים

Summary

אנו מספקים תיאור מפורט של פרוטוקול לניתוח זרימה ציטומטרי של אנטיגנים פני השטח ו/או אנטיגנים תוך-תאיים בסוגי תאים עצביים. היבטים קריטיים של תכנון ניסויים, הליכים מתודולוגיים שלב אחר שלב ועקרונות בסיסיים של ציטומטריית זרימה מוסברים על מנת לאפשר לנוירוביולוגים לנצל טכנולוגיה רבת עוצמה זו.

Abstract

ציטומטריית זרימה שימשה באופן נרחב להגדרת אוכלוסיות תאים באימונולוגיה, המטולוגיה ואונקולוגיה. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של פרוטוקולים לניתוח זרימה ציטומטרי של אשכול אנטיגנים פני השטח של התמיינות (CD) ואנטיגנים תוך-תאיים בסוגי תאים עצביים. התיאור המפורט שלנו של ההליכים המתודולוגיים כולל: קצירת תרביות עצביות במבחנה, שלב תיוג אופציונלי של קרבוקסיפלואורסצין סוקסינימידיל אסטר (CFSE), ואחריו צביעת אנטיגן על פני השטח עם נוגדני CD מצומדים (למשל, CD24, CD54), וזיהוי אנטיגן תוך-תאי לאחר מכן באמצעות נוגדנים ראשוניים/משניים או שברי Fab מסומנים פלואורסצנטיים (תיוג זנון). הסרטון מדגים את השלבים הקריטיים ביותר. יתר על כן, עקרונות תכנון ניסויים, הכללת בקרות קריטיות ויסודות הניתוח הציטומטרי של הזרימה (זיהוי אוכלוסיית היעד והרחקת פסולת; אסטרטגיית שער; פיצוי על חפיפה ספקטרלית) מוסברים בקצרה על מנת לאפשר לנוירוביולוגים בעלי ידע קודם מוגבל או הכשרה ספציפית בזרימה ציטומטרית להעריך את התועלת שלה ולנצל טוב יותר מתודולוגיה רבת עוצמה זו.

Introduction

Cytometry זרימה נוצל בהרחבה באימונולוגיה, המטולוגיה ואונקולוגיה להגדיר אוכלוסיות תאים באמצעות מאפיינים פנימיים פיזור, ביטוי אנטיגן שטח פני תא, ופרמטרים אחרים הקרינה ^1-3. תובנות שלנו לפיתוח שושלת דם ומחלות הן תוצאה למידה משמעותית של העידון המתמשך של מתודולוגיה זו לאחר ^4,5 היישום לראשונה שלה. הגברת מודעות לפוטנציאל האנליטי כמותיים והכולל של זרימת cytometry לאחרונה עודדו את השימוש הנרחב יותר שלה במחקר בתאי גזע ועשויות לאפשר התקדמות דומה עמוקה במסגרת זמן קצרה יותר ^6. עם זאת, היישום של הזרימה cytometry לנתח באופן ספציפי ולבודד אוכלוסיות עצביות נתפס עוד מאתגר. בניגוד לתאי hematopoietic שקיימים באופן טבעי בהשעיה, סוגים עצביים תא נקצרים בדרך כלל ממקורות מוגזמים מורכבים שעשויות לכלול גליה וo השונותיס תאים המקיפים כמו גם רשת סבוכה של תאי עצב נושאות תהליך. כתוצאה מכך, נוירוביולוגיה טרם ליישם את הרבגוניות של הזרימה cytometry לפוטנציאל המלא שלה בשגרת מחקר יומית. עם זאת, כל עוד השעיה תא בודדת קיימא יכולה להיות שנוצרה (ופרוטוקולים כבר המציא ומותאם במיוחד למטרה זו ^7), cytometry זרימה ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) יכול להיחשב מרכיב חשוב ברפרטואר האנליטיות בנוירוביולוגיה ^8-11.

. Cytometers עיקרון איור 1. ניתוח cytometric זרימה ורכיבים של cytometer זרימת זרימה יורכב משלוש מערכות עיקריות: fluidics, אופטיקה ואלקטרוניקה. זרימה יעילה של תאים בתרחיף (שהוכנה מרקמות ראשוניות או בתרבות חוץ גופית) מושגת על ידי flui הנדןד באמצעות הידרודינמית התמקדות, המגביל את המדגם למרכז הליבה שלה. החלקים האופטיים מורכבים מלייזרים שמאירים את הזרם של תאים ומסננים אופטיים המכוונים את האות לגלאים המתאימים. אותות האור זוהו מומרים לאותות אלקטרוניים, מעובד לאחר מכן על ידי מחשב ודמיינו על צג לניתוח נתונים וgating. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

משתמשים של רווח שיטות cytometric זרימה מלפחות הבנה בסיסית של היסודות הבסיסיים כוללים אבני הבניין של cytometer (לסקירה ראה ^12,13; גם ראו איור 1). קרן לייזר מצטלבת עם זרם fluidic hydrodynamically ממוקד המכיל את התאים בתרחיף, אשר בתורו לעבור בקרן הלייזר ב'קובץ יחיד "בזה אחר זה. Interceptiבתא (או כל חלקיק אחר, לצורך העניין) עם תוצאות הלייזר בפיזור של אור מחקירת נקודה זו. אור מפוזר ניתן לאתרם בהמשך לכיוון הלייזר (הפיזור קדימה, הקשורים לגודל של החלקיקים), כמו גם בניצב לכיוון שלו (פיזור הצד; המשקף את granulosity של החלקיקים / התא). מאפייני הפיזור האמורים אלה אינם דורשים תיוג ספציפי, ולכן מדגם ללא תווית (או גם פסולת תאית, בועות אוויר, וכו ') יפיק אות (אירוע) על הפיזור קדימה bivariate לעומת פיזור עלילה בצד משמשת בדרך כלל לgating הראשוני. על ידי שימוש בלייזרים ומסננים ספציפיים לספקטרום עירור והפליטה המתאים המתאימים, תאים ניתן לנתח לחיוביות שלה, רמת האינטנסיביות, או היעדרם של סמני ניאון. רוב יישומי cytometric זרימה התמקדו באפיון באמצעות אנטיגנים פני תא. בניגוד לlineag hematopoieticדואר, השושלת העצבית נשארה מוגדרת פחות בהרחבה על פי דפוסי ביטוי epitope משטח ^5. אחד יתרונות של ניצול אנטיגנים פני השטח הוא שיכולים להיות נתונה תאי חיים ועד לתא פרדיגמות מיון כגון FACS. בניגוד לכך, מכתים אנטיגן תאיים דורש צעדי קיבעון וpermeabilization לתווך את האינטראקציה epitope-נוגדן, המונע יישומים במורד הזרם שדורשים תאי קיימא. ראוי לציין, גישות כאלה עדיין לאפשר למבחנים כמותיים רבים ¹⁴ וכן ניתוחים במורד הזרם לRNA וחלבון ביטוי ^15. המטולוגיה, אימונולוגיה ואונקולוגיה השתמשו לעתים קרובות יותר מתריסר סמנים בשיתוף להגדיר תת-אוכלוסיות מסוימות ^16. בנוסף, cytometry ההמוני או CyTOF כעת ניתן להשתמש כדי לנתח עד 30 פרמטרים בו זמנית ^17,18.

עבור יישומי תאי גזע עצביים, כמו גם תרבויות עיקריות ^14,19,20 ההטרוגניות של תאים במבחנה היא תופעה נפוצה ^21-23. התאים לא מייצגים את אוכלוסיית היעד של עניין מגלמים גורם שעלול להיות מבלבל עבור קריאה ניסיונית ^24,25. נוח, תת הסלולרי השונים קיימים בתוך השעיה תא הטרוגנית לשאת פרופילי ביטוי אנטיגן שונים (ידועים או שעדיין לא פוענחו), אשר יכול להיות מנוצל כדי להגדיר אלה אוכלוסיות שונות. Cytometry זרימה ומכאן יכול לשחק תפקיד מכריע בפתרון ההטרוגניות סלולרית, ובכך, להקל על יישומים ביו-רפואיים (במבחנה מבחני, טיפול בתאים) ולייעל את הקריאה כמותית על ידי התמקדות בתת-קבוצה הרלוונטית ביותר ^24,26. שילובי אנטיגן פני השטח שונים זוהו בשנים האחרונות, כדי לאפשר quantitation ובידוד של סוגי תאים עצביים ספציפיים. זה כולל CD133 להעשרה של תאי גזע עצביים ^27, שילוב של CD15 / CD24 / אנטיגנים משטח CD29 לבידודה של המועצה לביטחון לאומי, דיפרנציאלינוירון טד ותאי רכס עצביים ²⁸ או CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 לבודד עצבי ותת גליה ^25, בין חתימות אחרות ^29,30. מעבר לתאי עצב, סמני גליה כוללים A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² וGLAST ^33. הפרסום האחרון ניצל את סמן המוח התיכון floorplate מבשר קורין ^34,35 להעשיר למבשרי דופאמין בהשתלת תאי פרקינסון הפרדיגמות ^36. מולקולות CD הן לא רק סמנים, אך מתווכים רלוונטיים מבחינה תפקודית של תאי תאי אינטראקציות ושל היכולת של תא להגיב לאותות ממולקולות חוץ-תאיות וצמיחת הגורמים ^37. אסטרטגיה אחת של עוד שיפור הארסנל של אנטיגנים CD קומבינטורית לאפיין פיתוח שושלת עצבי היא להשתמש סמנים תאיים ידועים למסך וללהגדיר שילובי אנטיגן CD לסוג תא מסוים של עניין. יש לנו לאחרונה ניצלנו גישה כזו וזיהה CD49F ^- / CD200 דפוסי ביטוי קומבינטורית ^גבוהים כגישה חדשנית להעשרת תת נוירונים ממובחנים עצבי מערכות תרבות תאי גזע pluripotent המושרה ^38. כאן, אנו כוללים ולדון בפרוטוקול האחרון (ווריאציות אופציונליות ממנו) שבמכתים פני השטח וצביעה תאית ניתן להשתמש בו זמנית להגדרה תת-אוכלוסיות של תאים עצביים על ידי cytometry זרימה.

איור 2. תרשים זרימה של אפשרויות פרוטוקול ניסוי. הדמות מתארת ​​ייצוג סכמטי של המעורבים בפרוטוקול את השלבים העיקריים. צעדים אופציונליים (צבע CFSE או תיוג אנטיגן תאיים) מסומנים על ידי קופסות צבע אפור בהירות. לאחר קציר, זה חיוני כדי להעריך את מספר הכדאיות ותא של השעיות תא עצביות לפני מכתים שטח פני תא. חיובי כגם בקרות שליליות צריכה להיות כלולות בתוספת לדגימות של עניין. ניתן לנתח דגימות על ידי ניתוח התזרים cytometric ו / או שימוש בפרדיגמות מיון תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אמנם יש לנו בעבר השתמשתי נוגדן ראשוני בשילוב עם נוגדנים משני עבור מכתים תאיים ^38, אנחנו עכשיו להציג את התיוג שאינו קוולנטיים של הנוגדן הראשוני באמצעות שברי ניאון Fab (תיוג זנון) כוריאציה קלה, ובכך להפחית את הצעדים של תא מניפולציה ^39. יתר על כן, כדוגמא נוספת לרבגוניות של הפרוטוקול, אנו מעסיקים תיוג אופציונאלי של תת-קבוצה אחת ניסיונית על ידי carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) לפני המשטח מכתים אנטיגן. לפני תיוג CFSE כזו מאפשר השוואה המיידית הישירה של שתי שורות תאים או תנאי ניסוי (CFSE שכותרתו vs. ללא תווית) בתוך צינור מדגם יחיד, הפחתת שונות או הבדלים דקים בזמן דגירה ושמירת נוגדן. CFSE הוא צבע פלואורסצנטי הוקם המשמש בדרך כלל לתא מעקב ^40, בניסויי התפשטות ^41,42 וbarcoding ^43,44. לבסוף, בזמן שצעדים ממשיים מיון (FACS, הפרדת תאי immunomagnetic או immunopanning) אינם חלק מפרוטוקול זה, באופן עקרוני, נהלי הקצירה ותיוג המתוארים כאן לעשות דגימות תשואה שיכול להיות נתון למשטח יישומים מבוסס תיוג תאיים מיון antigen- או ^{15 25,28.}

עם מאמר זה, אנו שואפים: לסכם פרוטוקול מכתים אנטיגן שטח קיימא ^25,28, לסכם פרוטוקול לזיהוי של מטרות תאיות, כמו גם משטח משולב וניתוח אנטיגן תאיים ^38, מציג צעד תיוג צבע תאיים CFSE ^41,45 כ אפשרות ניסיונית לcomparative הניתוחים של אוכלוסיות תאים עצביות, ולסכם גישות לזרום ניתוח cytometric (שליטה ובקרה נאותה ^13,46, gating אסטרטגיה ונתונים מצגת ^47).

Protocol

1. קציר Cell העצבי

1. הערכה על ידי מיקרוסקופ:
   1. לפני שיתחיל בניסוי, לבדוק את מצב התרבות בשדה בהיר או מיקרוסקופ לעומת שלב.
      הערה: בעוד רקמה עצבית העיקרית המתקבלת מניתוחים היא, בעיקרון, נוח באותה מידה לזרום ניתוח cytometric ^14,28, שים לב שהפוקוס של הפרוטוקול הוא על תאים המתקבלים ממערכות תא עצביות במבחנה.
2. תאי קציר ^7:
   1. לשטוף בעדינות את הצלחת / הבקבוקון של תאים חסיד עם Mg ^{2 +} / Ca ^{2 +} פוספט שנאגרו מלוח חופשי (PBS) בשעה RT (למשל, 5 מיליליטר לבקבוק T75, 3 מ"ל לכל גם לצלחת 6-היטב, או 10 מ"ל ל צלחת 10 סנטימטרים).
      הערה: PBS בשימוש בכל הפרוטוקול היא Mg ^{2 +} / Ca ^{2 +} חופשי.
      1. לדוגמא הווידאו, השתמש בקבוק T75 של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y בconfluency 80%. החל צעדי כביסה נוספים במקרים בהםפסולת רבה נמצאת בצלחת.
      2. שקול שוטף עם, Percoll, או Ficoll ⁴⁹ הדרגתיים בסרום PBS ⁴⁸ המכיל אלבומין צנטריפוגה ו / או חרוזים זמינים מסחרי ^50,51. הסרת המיאלין ושומנים אחרים או מזהמים אחרים היא קריטית, במיוחד כאשר מקורות עיקריים רקמה בוגרות נמצאים בשימוש.
   2. להוסיף החלפת טריפסין מראש התחמם (37 ° C) בנפח מתאים, המכסה את כל פני השטח של כלי תרבית רקמה.
      הערה: לחלופין, לשקול Accutase או אפשרויות עיכול אנזימטי אחרות. שלב קריטי זה עלול להשפיע לרעה על ביטוי epitope משטח (ראה ^7).
   3. דגירה הצלחת / הבקבוק בC ° 37 ל2-5 דקות (תלוי בסוג התא) כדי לאפשר לתאי לנתק. לטפוח בעדינות את כלי תרבית רקמה או מיושר עם pipet סרולוגיות כדי לסלק את התאים. הימנע על עיכול (כמו זה יכול לגרום לאובדן תא וקרישה בשלבים מאוחר יותר).
   4. Quench החלפת טריפסין ידי הוספת הנפח כפול של זרימת חיץ (2% FBS PBS) ולאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
   5. בעדינות triturate ההשעיה התא באמצעות pipet microliter (100 - 1,000 μl) או pipet 5 מיליליטר סרולוגיות להכין השעיה תא בודדת.
   6. צנטריפוגה התאים ב 220 XG במשך 5 דקות במהירות של 25 ° C. בזהירות לשאוב supernatant עוזב גלולה מאחורי.
   7. מחדש להשעות את גלולה בנפח מתאים של זרימת חיץ, תלוי בגודל של גלולה (למשל, לבקבוק T75 ומחוברות אחת של תאי SH-SY5Y התשואה הטיפוסית היא לפחות 10 x 10 ⁶ תאים, ובמקרה זה התאים הם resuspended ב 5 מיליליטר של חיץ זרימה).
      הערה: אם גושים או קרישה גדולים יותר הם נצפו, לסנן דרך 30 - רשת מיקרומטר 100.
3. תא ספירה ^52:
   1. העבר את aliquot קטן של ההשעיה תא צינור microcentrifuge ולדלל ביחס מוגדר בהיקף של TRכחול ypan או צבע כדאיות חלופי לפני שמערכת תא ספירה אוטומטית ההעברה לhemocytometer או.
   2. לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר קיימא על ידי הוספת הנפח המתאים של זרימת חיץ או PBS עם BSA 0.1% (אם ימשיך עם תיוג CFSE).
      הערה: יודיד Propidium, D-7 aminoactinomycin, V Annexin וערכות assay הכדאיות ניתן לתקן זמינות מסחרי מייצגים אפשרויות חלופיים כדי להעריך את הכדאיות של תאים. כמו כן, מבחני אפופטוזיס באמצעות caspase-3 הקרינה כפי שתוארו לעיל ⁵³ ניתן להשתמש. ערוצי ניאון יהיו "כבושים" על ידי חומרים כימיים אלה שעלולים להגביל את האפשרויות לצעדים הבאים אם הוא כלול בכל הדגימות.

2. תאיים Dye תיוג שימוש CFSE (איור 3)

1. לדלל את CFSE לריכוז המניה רצוי שיכול לשמש בקלות.
   הערה: בניסויים אלה ריכוז מניות של0.01 מ"מ היה בשימוש. קבע את ריכוז העבודה האופטימלי של CFSE אמפירי.
2. הוסף 10 μl של 0.01 מ"מ פתרון CFSE לכל מיליליטר של תאים (סעיף 1.3.2, ריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בBSA + 0.1% PBS) לריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר. בקצרה מערבולת לערבב היטב.
   הערה: ריכוזי CFSE משמשים כאן הם על פי עשרה נמוכים יותר מאלה מיושמים בדרך כלל במבחני שגשוג, ומכאן תא רעילות של הצבע הוא מינימאלי. אנחנו לא שומרים השפעות שליליות על כדאיות תא.
3. דגירה במשך 5 דקות בRT עם רעד קבוע (200 סל"ד). להגן מפני אור.
4. להרוות את הצבע על ידי הוספת 5 כרכים של זרימת חיץ לצינורות. צנטריפוגה XG ב 94 דקות 5 ב RT.
5. בטל supernatant עוזב גלולה מאחורי. מחדש להשעות את התאים עם 5 כרכים של זרימת חיץ.
6. צנטריפוגה XG ב 94 דקות 5 ב RT. בטל supernatant מחדש להשעות את התאים בזרימת חיץ בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.
7. להוסיף מספר שווה של תאים בלא כתם המעניינים את ההשעיה התא המוכתמת. המשך לעלות על פני השטח פרוטוקול אנטיגן צביעה (סעיף 3).

איור 3. איתור של אנטיגן ביטוי פני השטח CD ההפרש בין שתי שורות תאים באמצעות תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y CFSE צבע תיוג. הוא מראש שכותרתו עם CFSE לזיהוי שלאחר מכן בהשוואה לfibroblasts BJ ללא תווית. Co-הכתמה של המדגם המעורב (לוחות מימין) עם סמני פני השטח CD24 או CD54 (שני מצומדות לAPC) מוכיחה כי שורות תאים הן בקלות להבחין בשל הכתמת CFSE (חיצים = SH-SY5Y; ראשי חץ = fibroblasts BJ). רוב תאי SH-SY5Y להביע CD54 CD24 אבל לא (ICAM-1). בניגוד לכך, fibroblasts BJ (CFSE-שלילי) הם חיובי לשלילי CD54 אבל במידה רבה לCD24.יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מכתים Surface 3. Cell

1. צינורות תווית כולל דגימות ובקרה קריטית (ראה טבלה 1).

צינור לא.	שם לדוגמא	Antigen-fluorophore	דילול
1	תאים בלא כתם	-
2	צבעוני יחיד	CD24-APC	01:50
3	צבעוני יחיד	488nm פלואוריד Tuj1-Alexa	1: 2,000
4	Double צבעוני	CD24-APC	01:50
		488nm פלואוריד Tuj1-Alexa	1: 2,000
5	צבעוני יחיד	משני בלבד: 488nm פלואוריד Alexa	1: 2,000

טבלת 1. ist L של צינורות להיכלל בזרימה אופיינית cytometry ניסוי. הטבלה מציגה במספר מינימלי של צינורות מדגם דרושים לניסוי שיתוף מכתים המתואר במאמר זה וידאו. ניסוי אידיאלי צריך לכלול את כל הפקדים הדרושים (בקרות שליליות, חיוביות, כמו גם פיצוי) לפירוש מדויק של התוצאות שהתקבלו.

2. הוספה של השעיה תא (מסעיף 2.7 או 1.3.2) 100 μl לכל צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
   הערה: ודא מינימום של 0.1 x 10 ⁶ תאים נמצא בהשעית תא 100 μl.
3. הוסף נוגדן fluorophore מצומדת למדגם בדילול מתאים.
   הערה: קביעה עובדת דילול עבור כל נוגדן לפני הניסוי. ראה טבלה 2 לo רשימהאנטיגנים משטח עצביים ו.

ד> [25]

Antigen	סוג התא	התייחסות
CD15	תאי גזע עצביים	[28, 67]
CD24	תאים עצביים	[28, 68]
CD29	תאי גזע עצביים	[28, 69, 70]
CD44	תאי גלייה	[25]
CD49f	תאי גזע עצביים	[38]
CD56 (NCAM)	תאים עצביים	[71]
CD133	תאי גזע עצביים	[27]
CD184	תאי גזע עצביים ותאי גלייה	[25]
CD200	תאים עצביים	[38]
CD271	תאי גזע רכס עצבי
A2B5	תאי גלייה	[31]
קורין	מבשרי דופאמין	[35, 36]
FORSE1	תאי גזע עצביים (NSC)	[72]
GLAST	תאי גלייה	[33]
NG2	תאי גלייה	[32]

בחירת טבלת 2. אנטיגנים משטח עצביים. טבלה זו מספקת רשימה של פני השטח epitopes מצאה להתבטא בסוגי תאים שונים עצביים כדי להדגים את הלוח הגובר של אנטיגנים משטח משמשים כדי לאפיין את השושלת העצבית. שים לב שבחירה זו היא רחוקה מלהיות מושלם ושרוב הסמנים אלה באים לידי ביטוי גם בטווח של תאים עצביים ולא עצביים אחרים. כתוצאה מכך, שילוב של מספר סמנים יידרש להגדיר טוב יותר ולבודד את תת עצביים מצויינים.

אמנות = "4">
1. דגירה למשך 30 דקות על שייקר מסלולית (200 סל"ד) בחושך.
2. לשטוף חיץ זרימה
   1. הוסף 1 מיליליטר של חיץ זרימה לצינורות. צנטריפוגה ב380 XG במשך 4 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. בטל supernatant עוזב גלולה מאחורי.
3. חזור על השלב לשטוף שוב.
4. לאחר לשטוף את השני, למזוג supernatant מחדש להשעות את התאים בזרימת חיץ לנפח סופי של 100 μl.
5. השתמש במדגם לניתוח הזרימה cytometric. לחלופין, להמשיך בסעיף 4 ו -5.
   הערה: אם תאים הם להיות מסודרים ולהחזיר לפוסט FACS-התרבות (כלומר, השעיה תא קיימא ללא קיבוע או permeabilization), ליישם טכניקות ספטית במהלך המסיק, הצביעה וצעדים אנליטיים.

4. קיבוע וpermeabilization ³⁸

1. paraformaldehyde קיבעון באמצעות (PFA):
   1. הכן חיץ קיבעון המכיל 2% PFA בPBS.
      
   2. הוסף 500 μl של חיץ קיבעון להשעית תא 100 μl.
   3. דגירה הצינורות ב RT במשך 15 דקות על שייקר מסלולית (100 סל"ד) בחושך.
2. לשטוף PBS:
   1. הוסף 1 מיליליטר של PBS לצינור. צנטריפוגה ב380 XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. בטל / למזוג supernatant עוזב כ -100 μl בצינור.
3. Permeabilization עם Tween-20:
   1. הכן חיץ permeabilization המכיל 0.7% Tween-20 בPBS.
   2. הוסף 500 μl של חיץ permeabilization להשעית תא 100 μl.
   3. דגירה הצינורות ב RT במשך 15 דקות על שייקר מסלולית (100 סל"ד) בחושך.
4. שוטף את התאים פעם עם PBS (כמתואר בסעיף 4.2) ולהסיר את supernatant משיתוף הצינורותmpletely, ומשאיר רק את גלולה מאחורי.

5. תאיים Antigen מכתים ³⁸ (איור 4)

1. הכנה של פתרונות נוגדן ראשוניים:
   1. לדלל את הנוגדנים הראשוניים במאגר דילול המכילים 1% אלבומין בסרום שור, סרום 10% (לדוגמא, בסרום נורמלי חמור או עז) וTween-20 0.5% ב- PBS.
      הערה: בחר את הסרום לשימוש בהתאם למין הנוגדנים משני הועלו ב.
   2. לחלופין, להשתמש בתיוג והעמסת זנון של הנוגדן הראשוני על פי הוראות היצרן.
      1. הכן 1 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני PBS ב דילול מתאים (נפח כולל ≤ 20 μl).
      2. הוסף 5 μl של מגיב זנון והעמסת IgG תיוג (רכיב) לפתרון הנוגדנים.
      3. דגירה את התערובת במשך 5 דקות בRT.
      4. הוסף 5 μl של מגיב חסימת זנון (המרכיב B) לתערובת התגובה.
      5. דגירההתערובת במשך 5 דקות בRT. החל הנוגדנים למדגם תוך 30 דקות.
2. צביעת נוגדן ראשונית:
   1. הוספה של פתרון הנוגדן הראשוני לתא גלולה 100 μl ועדינות triturate לערבב.
   2. לחלופין, להוסיף נוגדן שכותרתו והעמסת זנון להשעית התא בדילול המתאים.
   3. דגירה הצינורות ב RT למשך 30 דקות על שייקר מסלולית (200 סל"ד), מוגן מפני אור. שוטף את התאים פעם עם PBS (כמתאר בסעיף 4.2) ולהסיר את supernatant מהצינורות לחלוטין, ומשאיר רק את גלולה מאחורי.
3. צביעה משנית נוגדן (לא נדרשה לנוגדנים והעמסת זנון שכותרתו):
   1. לדלל את הנוגדנים משני בPBS בריכוז מתאים.
   2. הוספה של פתרון נוגדנים משני לתא גלולה 100 μl ועדינות triturate לערבב. דגירה הצינורות ב RT למשך 30 דקות על שייקר (סל"ד 200) בחושך.
4. שטוף את הדגימות פעמיים עם PBS (כמתואר בסעיף 4.2).
5. שטפים פעם עם זרימת חיץ (ראה סעיף 3.5).
6. להשעות מחדש את התאים בכ -150 μl של זרימת חיץ ולנתח על cytometer את הזרימה.

איור 4. Co-הכתמה של פני השטח וחלבונים תאיים. Cytometry זרימת נתונים מדגימה השוואה בין עיקריים + משניים נוגדנים מבוסס לעומת מכתים תאיים המבוססת על העמסת זנון בשילוב עם צביעת פני השטח. חיוביות בלעדיות על ציר y (רבע עליון משמאל) וציר ה- x (רבע ימני תחתון) מראה תאים מוכתמים עבור MAP2 וCD24, בהתאמה. לאחר שיתוף מכתים, MAP2 משותף וביטוי CD24 ניתן לראות ברבע הימני העליון (לוחות מימין). השוואה של שימושאלקסה פלואוריד 488. (למעלה; AF488) לעומת זנון והעמסת (למטה) לתוצאות דומות תשואות MAP2 תיוג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

6. זרימה Cytometric ניתוח

1. לבצע ניתוח התזרים cytometric מייד לאחר השלמת הפרוטוקול מכתים באמצעות cytometer זרימה עם מסננים מתאימים לגילוי אות. השתמש 488 nm לייזר אדום כחול ו 640 ננומטר עם FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), ומסנני FL-4 (675/25) bandpass.
2. הגדר את השערים עיקריים המבוססים על הפיזור קדימה וצד לא כולל פסולת ותאים מתים.
3. שערי הקרינה שנקבעו למשטח ואנטיגן תאיים ל≤0.5% המבוססים על הדגימות בלא כתם והפיצוי לחפיפה ספקטרלית באמצעות פקדים צבעוניים יחידים.

Results

הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר לגישות מגוונות ניסוי (איור 2). בגרסה הקצרה שלו (שלבים 1, 3 ו -6), זה יכולים להיחשב מדריך לצביעה פשוטה של אנטיגנים על פני שטח. בצורה המורכבת יותר שלו, מספר פרדיגמות שיתוף תיוג עם מגוון של אנטיגנים תאיים יכול להיות רדוף (צעדים אופציונליים 2 ו / או 4 עד 5). יתר על כן, צעד CFSE תיוג מדגים השירות שלה לתיוג / מעקב תא של תת-אוכלוסיות במחקרי אינט...

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן הוא מבוסס היטב לתרביות תאים עצביות שמקורם בתאי גזע אנושיים, אבל יכול להיות מיושם באופן שווה למקורות תא עצביים אחרים, כולל רקמה ראשונית או שורות תאים עצביות. בנוסף למקורות עובריים, ניתן לחלץ תאי גזע עצביים או מהאזורים העצביים של המוח בוגר ^27. יתר על כן, cytometry זרימה וניתן לנצל FACS לכמת, לנתח ולבודד אוכלוסיות תאים שונים, כולל נוירונים בוגרים ^54, astroglia ^33, microglial ^55, oligodendrocytes ^56, או תאי האנ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 (1:1) (תערובת מדיום הנשר/התזונה F-12 של Dulbecco)<	a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"> Life Technologies
ללא Ca2+ Mg2+	Life Technologies
סרום בקר עוברי, מוסמך, מאושר על ידי האיחוד האירופי, ממוצא דרום אמריקה (FBS)	Life Technologies	10270-106
MEM חומצות אמינו לא חיוניות (100x)<	a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"> Life Technologies	11140035
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84
DMSO	AppliChem	A1584
מסנני בקבוק אקספרס פלוס 0.22 ומיקרו; m, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE
צלוחיות שטופלו בתרבית תאים (T 25)	NUNC	156367
צלוחיות שטופלו בתרבית תאים (T 75)	NUNC
156499 צינורות חרוטיים (15 מ"ל)	שפופרות חרוטיות 188271
ביו-וואן (50 מ"ל)<	a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"> גריינר ביו-וואן	227261
פיפט פסטר, זכוכית (150 מ"מ)<	a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"> STEIN Labortechnik, Remchingen
S03710150 טיפים לפיפט (0.1-10 ומיקרו; l)	קורנינג	4125
טיפים לפיפט (1-200 ומיקרו; l)	קורנינג	4126
טיפים לפיפט (100-1000 ומיקרו; l)	קורנינג	4129
צנרת סרולוגית, 5 ml	קורנינג	4051
צנרת סרולוגית, 10 ml	קורנינג	4101
פיפטות סרולוגיות, 25 מ"ל	צינורות מיקרוצנטריפוגה קורנינג	4251
(0.5 מ"ל)<	a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"> Sarstedt	72,699
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)	גריינר ביו-וואן	616201
שפופרות מיקרוצנטריפוגות (2.0 מ"ל)<	a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"> Sarstedt	72,695,500
נוגדן חד שבטי CD24 APC אנטי-אנושי
נוגדן חד שבטי CD54 PE אנטי-אנושי
חמור אנטי ארנב	Life Technologies	A21206	דילול עבודה 1:2,000
Zenon® ערכת תיוג IgG של ארנב פלואורסצאין
	תעשיות מדעיות	G560E
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer	בקטון דיקינסון (BD)	653118
מיקרוצנטריפוגה מקוררת, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R
שייקר אורביטלי, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
צנטריפוגה מקוררת, Rotanta 96 RC	a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"> הטיך	4480-50
Class II ארון בטיחות ביולוגי בטוח 2020	Thermo Scientific	51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331
מערכת ואקום, נוחות	Vacusafe Integra Biosciences	158320
Microscope, Axiovert 40 CFL	בקר Zeiss	451212
Pipet, accu-jet pro	מותג	26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 ומיקרו; l)	Gilson	F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 & micro; l)	Gilson	F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 & micro; l)	Gilson	F144566