ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

תקציר

המרה של אור לדחפים חשמליים מתרחשת ברשתית החיצונית ומושגת בעיקר על ידי קולטני אור מוט וחרוט ואפיתל הפיגמנט ברשתית תאים (RPE). הרשתית לספק תמיכה קריטית לקולטניים אור ומוות או תפקוד לקוי של תאי הרשתית הוא אופייני של ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD), הגורם העיקרי לאיבוד ראייה קבוע באנשים בגיל 55 ומעלה. אמנם אין תרופה לAMD זוהתה, השתלה של הרשתית בריאה בעיניים חולות עשויה להיות טיפול יעיל, ומספר גדול של תאי הרשתית יכול להיות שנוצר בקלות מתאי גזע pluripotent. כמה שאלות מעניינות בנוגע לבטיחות והיעילות של משלוח תא הרשתית עדיין יכולות להיבחן במודלים של בעלי חיים, ופרוטוקולים מקובלים היטב המשמשים להזרקת הרשתית פותחו. הטכניקה המתוארת כאן נעשתה שימוש על ידי מספר קבוצות במחקרים שונים וכרוכה ביצירת חור בעין עם מחט חדה ראשונה. אז מזרק עם bluמחט NT עמוסה תאים מוכנסת דרך החור ועברה דרך הזגוגית עד שנוגע בעדינות ברשתית. שימוש בשיטת ההזרקה הזה, שהוא פשוט יחסית ודורש ציוד מינימאלי, אנחנו להשיג אינטגרציה של תאי הרשתית המופק מתאי גזע עקבית ויעילה בין הרשתית המארח המונעת כמות משמעותית של ניוון קולטי אור במודלים של בעלי חיים. אמנם לא חלק מהפרוטוקול בפועל, אנחנו גם מתארים כיצד לקבוע את היקף הטראומה הנגרמת על ידי ההזרקה, וכיצד לוודא שהתאים הוזרקו לתוך חלל subretinal באמצעות בשיטות ההדמיה vivo. לבסוף, השימוש בפרוטוקול זה אינו מוגבל לתאי הרשתית; זה יכול לשמש כדי להזריק כל מתחם או תא לחלל subretinal.

מבוא

הרשתית התחושתית, מאורגנת בשכבות תפקודיות של נוירונים, גליה ותאי אנדותל. קולטני אור בחלק האחורי של הרשתית מופעלים על ידי אור; באמצעות פוטוטרנסדוקציה הם ממירים פוטונים לאותות חשמליים המזוקקים על ידי אינטרנוירונים ומועברים לקליפת המוח הראייתית במוח. פוטוטרנסדוקציה לא יכולה להתרחש ללא המאמצים המתואמים של גליה מולר ותאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE). RPE מאורגנים בשכבה חד-שכבתית ישירות מאחורי קולטני האור ומבצעים פונקציות מרובות ומגוונות אינטגרליות לתפקוד קולטני האור וההומאוסטזיס. למעשה, RPE ופוטורצפטורים כל כך תלויים זה בזה שהם נחשבים ליחידה פונקציונלית אחת. מוות או תפקוד לקוי של RPE גורמים להשפעות משניות הרסניות על קולטני האור וקשורים לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), הגורם המוביל לעיוורון בקרב קשישים^1,2.

למרות שלא נמצאה תרופה ל-AMD, מספר מחקרים קליניים הראו כי החלפת תאי RPE עשויה להיות אופציה טיפולית מבטיחה^3-13. עם הופעת טכנולוגיית תאי הגזע, ניתן כעת לייצר מספר רב של תאי RPE במבחנה מתאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים ומושרים (hES ו-hiPS) הדומים מאוד לעמיתיהם הסומטיים מבחינה תפקודית ואנטומית^14-26. RPE שמקורו בתאי גזע הוכח גם כפועל in vivo על ידי מספר קבוצות עצמאיות, כולל שלנו, כדי להאט משמעותית את ניוון הרשתית בשורות חולדות ועכברים עם ניוון רשתית ספונטני^{16,18,21,22,25,28,29}. שילוב זה של ראיות תומכות קליניות ופרה-קליניות הוא כל כך משכנע שמספר ניסויים קליניים למניעת ניוון רשתית באמצעות תאי RPE שמקורם בתאי גזע נמשכים^{כעת 30,31}.

RPE ניתן להפיק בקלות מ-hES ו/או hiPS ולהשתיל אותו בחלל התת-רשתית של מכרסמים באמצעות טכניקות גזירה והזרקה שונות^32,33. (ראה Westenskow et al. למאמר שיטות בפורמט מולטימדיה המדגים את פרוטוקול הדיפרנציאציה המכוונת שאנו משתמשים בו)³⁴. נותרו שאלות קריטיות לגבי הבטיחות, ההישרדות והיכולת התפקודית של תאי RPE המועברים באופן אקסוגני עם ההשתלה, ולכן היכולת לבצע הזרקות תת-רשתית במכרסמים היא מיומנות קריטית^{16,18,21,29,36,37}. אספקת RPE אינה טריוויאלית, והתחום מחולק על טכניקת ההזרקה היעילה ביותר. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן הוא דרך פשוטה ויעילה להעביר בולוס של תאי RPE תת-רשתית, ושימש בניסוי הקליני הראשון להשתלת RPE שמקורו בתאי גזע³¹. (הקורא יכול גם לעיין במאמר אחר של JoVE מאת Eberle et al. לתיאור חלופי של זריקות תת-רשתית במכרסמים. ³⁸)

לא ניתן לדמיין את הטכניקה המתוארת בכתב יד זה וטראומה היא בלתי נמנעת (כמו בכל טכניקת הזרקה תת-רשתית). זה מבוצע על ידי יצירת חור ממש מתחת לכלי הלימבוס והחדרת מחט קהה לאורך מסלול טרנססקלרלי כדי להזריק בולוס של תאים מתחת לרשתית המנוגדת בקוטר. האדם שמבצע את ההזרקה ירגיש התנגדות כאשר המחט הקהה נוגעת ברשתית. עם זאת, ניתן לראות את התאים ישירות לאחר ההזרקה, וניתן לקבוע את מידת ניתוק הרשתית המושרה על ידי תיוג תאי RPE עם סמן פלואורסצנטי חולף וזיהויים באמצעות אופטלמוסקופ סורק קונפוקלי (cSLO). ניתן להשתמש גם במערכת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) כדי לנטר את הטראומה ולזהות בקלות את אתר ההזרקה.

פרוטוקול

הערה: טופלו כל בעלי החיים בהתאם לקווים המנחים האתיים שנקבעו על ידי מכון מחקר Scripps.

1. הכנת חומרים להזרקה (~ 20 דקות)

1. פתרון טרום חם תא דיסוציאציה (רצוי אחד שהוא מובטל באמצעות דילול, לא עם סרום), PBS סטרילי, ותקשורת ותרבות (טבלה 1).
2. לעקר את המזרק עם מחט בוטה על ידי הפירוק ורותח החלקים במים במשך 15 דקות.

2. הכנת תאי RPE להזרקה (~ 30 דקות עד 1 שעה)

1. לנתק את תאי RPE באמצעות פתרון תא דיסוציאציה מראש התחמם במשך 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
2. לגרד את התאים בעדינות כדי לשחרר את כל שעדיין מחוברים.
3. לדלל את התאים עם נפח גדול של תקשורת והתרבות (למלא את צינור 15 מיליליטר) כדי להשבית את פתרון הניתוק ולספור אותם.
4. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
5. Resuspend התאים ב 200,000 תאים / μl (כדי לספק 100,000 תאים בנפח 0.5 μl) בPBS מראש חימם סטרילי ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
6. לחלופין, להוסיף סמן ניאון חולף תא חי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 דקות.
7. טען את המזרק עם מחט קהה עם 0.5 μl של תאים. להזריק את התאים בהקדם האפשרי.

3. הזרקה תת-רשתית (~ 5 דקות לכל הזרקה)

הערה: אם אפשר ללמוד, הטכניקה עם חולדות לבקן מבוגרות מאז כלי ימבוס הם הרבה יותר קלים לדמיין. הזרק פתרון ירוק מהיר כאשר למידה (לפני שתנסה להזריק תאים) כדי להקל על הדמיה של הזריקה בקלות רבה יותר.

1. להרדים את המכרסמים. השתמש בזריקות intraperitoneal של 100 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -10 מ"ג / מיליליטר xylazine (20 μl / גוף g 10 wשמונה) על שאיפת isofluorane מכיוון שקשה לתמרן המכרסמים ולהזריק לתוך העין עם החוטם במשאף.
   1. ודא כי בעל החיים הוא בהרדמה עמוקה על ידי צובט אחת מכפותיו. אם זה נרתע, לחכות עוד כמה דקות ונסה שוב לפני תחילת הזרקת subretinal.
2. מקם את המכרסם על הצד שלה, כך שהעין שיהיה להזריק פונה לתקרה.
3. תחת מיקרוסקופ לנתח בעדינות למתוח את העור כל כך את העין קופצת מעט למעלה מהשקע (proptosis הזמני) והופכת לנגישים יותר במחזיק את הראש שלה עם שתי אצבעות מעל האוזן ועל ידי הלסת שלה ובעדינות למתוח את העור במקביל לעפעפיים כך שהעין קופצת מעט למעלה מהשקע (ראה איור 1 ג). לא לתפוס את המכרסם קרוב מדי לגרון.
4. עם מחט חד פעמי חד של 30 G-מעוקר מראש, לעשות חור מייד מתחת לימבוס (אם כלי פגעו, דימום יהיה בדואר משמעותי וזה יהיה קשה למצוא את החור בהמשך) ובזווית כדי להימנע מלגעת בעדשה עם המחט (1D איור). הימנע מלגעת בעדשה עם המחט החדה (או בוטה) או היווצרות קטרקט מיידית תתרחש.
   הערה: זריקות לעבוד טוב יותר עם שני אנשים. בדרך זו אדם אחד יכול לעבור את המזרק עם המחט הבוטה לאדם שבצע את הזריקה לאחר שיצר את החור הראשון עם מחט חד פעמי החד לשמור על מיקוד על שם החור הוא.
5. לחזור בו את המחט החדה פעמית מהעין, תוך שמירה על האחיזה בראש. זוכר בדיוק איפה החור הוא.
6. לאחר שתי הרכבה המזרק הטעון מראש עם מחט בוטה על micromanipulator או מחזיק אותו ביד, הכנס את הקצה של המזרק עם המחט הבוטה דרך החור, טיפול שוב לא לגעת בעדשה ובעדינות לדחוף אותו דרך העין מאוד בעדינות עד שההתנגדות מרגישה (1D איור).
7. Keeping כל התנועות למינימום, להזריק בזהירות את תאי RPE לאט אל תוך חלל subretinal.
   הערה: ניתוק הרשתית / רשתית יהיה המושרה; זה בלתי נמנע. עם זאת, הזרקת חומר ניקוי ממזערת את הניתוק ומשפרת באופן משמעותי את הסיכוי לחיבור מחדש (איור 1E). כל תנועות מוגזמות עלולות להזיז את המחט חזרה לתוך הרשתית, ותנועות לצדדים עלולות לגרום נזק לרשתית. השימוש במשאבת הזרקה הוא אופציונלית, אך מאפשר למסירה מדויקת מאוד.
8. לחזור בו מהמזרק באיטיות. החל לחות טיפות עיניים כדי לשמור על עין התייבשות.
9. תמשיך לעקוב אחר בעלי החיים עד שחוזר כיבה sternal. אל תשאיר חיה ללא השגחה או לחזור לכלוב עם בעלי חיים ערניים אחרים עד שחוזר כיבה sternal.

תוצאות

אנחנו יכולים לספק השעיה של תאי RPE לחלל subretinal של מכרסמים במהירות ובאופן עקבי באמצעות הטכניקה שתוארה בכתב היד הזה. אמנם לא נדרש, טראומות ניתן למזער באופן משמעותי באמצעות ההתקנה מוצגת עם micromanipulator באיור 1 א & B. החזק את המכרסם, כפי שמוצג באיור 1C לproptosis זמני. השלבים זהים אם הופיעו עם micromanipulator או ביד; אלה מתוארים בסרט המצויר באיור 1D. כאשר היא מבוצעת בצורה נקיה הקרינה מתאי הרשתית שכותרתו ניתן לאתר באמצעות ...

דיון

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית לביצוע זריקות subretinal של תאי הרשתית בהשעיה בחולדות ועכברים. הפרוטוקול הוא קל ללימוד וניסיון רב יותר עם ​​הטכניקה תהיה לתרגם בפחות טראומות (איור 3, ומייצג את אחת מהזריקות טובות יותר), במיוחד אם micromanipulator משמש (איור 1 א). כל טראומה יכולה להיות במעקב in vivo עם מערכת cSLO ואוקטובר (איור 2) אם הוא זמין. אם תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ופחות רועשות הן רצויים, מצב של פלטפורמות ההדמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מרקפטואתנול (55 מ"מ)	ג'יבקו	21985-023	50 מ"ל x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	מארז x 1
CellTracker ירוק CMFDA	בדיקות מולקולריות	C34552	50 ומיקרו; גרם x 20
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום	Gibco	14190-144	500 מ"ל x 1
ירוק מהיר	Sigma-Aldrich	F7258	25 גרם x 1
טיפות ג'לטאפ ג'לטאלי לחומר סיכה בינוני עד חמור	Walmart	4060941	25 מ"ל x 1
המילטון דגם 62 RN SYR	המילטון	87942	מזרק x 1
מחט המילטון 33 גרם, 0.5 אינץ', נקודה 3 (נירוסטה 304	המילטון	7803-05	מחטים x 6
נוקאאוט DMEM	Gibco	10829-018	500 מ"ל x 1
תחליף סרום נוקאאוט	Gibco	10828-028	500 מ"ל x 1
L-גלוטמין 200 מ"מ	Gibco	25030-081	100 מ"ל x 1
מעמד מגנטי	Leica Biosystems	39430216	מעמד x 1
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 100X	Gibco	11140-050	100 מ"ל x 1
מיקרומניפולטור	Leica Biosystems		מניפולטור 3943001 x 1
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחידות למ"ל)	Gibco	15140-122	100 מ"ל x 1
מזרקים עם קצה החלקה ללא מחטים BD  (3 מ"ל)	חבילת BD309656 VWR		x 1
מחטים לשימוש מיוחד BD  (30 גרם, 1 אינץ')	VWR		BD305128 Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), ללא פנול אדום	Gibco	12604013	100 מ"ל x 1

)